REVISÃO SOBRE MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE PRATEÍNAS

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS 
CAMPUS DE JABOTICABAL
FRANCISCO BRUNO FERREIRA DE SOUSA
REVISÃO
MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS
JABOTICABAL/SÃO PAULO
2017
Francisco Bruno Ferreira de Sousa
MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE PROTÉINAS
 Relatório sobre métodos de determinação de proteínas apresentado á disciplina de Bioquímica no Sistema Solo-Planta do programa de pós-graduação (Mestrado) em ciência do solo da Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” UNESP/FCAV como instrumento de avaliação.
JABOTICABAL/SÃO PAULO
2017
INTRODUÇÃO 
As proteínas são as moléculas orgânicas mais abundantes nas células e representam cerca de 50% do seu peso seco. São encontradas em todas as partes das células, pois são fundamentais na estrutura e funções celulares, além disso, a maior parte da informação genética é expressa pelas proteínas (SANTOS, 2012). As proteínas são formadas por átomos de carbono, hidrogênio, nitrogênio e oxigênio, e quase todas contem enxofre. Algumas ainda podem conter fósforo, ferro, zinco e cobre.
A célula geralmente contem milhares de diferentes proteínas e cada uma tem diferente atividade biológica (NELSON e COX, 2011). As proteínas apresentam muitas funções biológicas diversas. Elas são de fundamental importância nos processos biológicos atuando como catalisadores biológicos (enzimas), hormônios, proteínas de transporte, estrutural e contrátil, antígenos/anticorpo, função nutricional, neurotransmissores, transportadores através de membranas entre outros, pois são essenciais sob todos os aspectos da estrutura e função celular (SANTOS, 2012).
As proteínas podem ser encontradas em produtos animais como carne, peixe, ovos, leite e seus derivados e em alimentos vegetais como cereais, grãos e sementes. Todas as fontes de proteínas contêm alguns dos aminoácidos essenciais, mas em quantidades variadas. Devido suas funções, principalmente biológicas e seu papel extremamente importante na determinação das propriedades nutricionais e funcionais dos alimentos, tem se tornado cada vez mais relevante o estudo de metodologias para determinar proteínas em várias áreas como em tecnologia e ciências de alimentos, laboratórios de análises clínicas, nutrição animal, nutrição humana e pesquisadores da área (ZAIA, 1998).
A prática de quantificar proteínas é importante e comum a muitas aplicações na pesquisa bioquímica geral e em práticas de laboratório clínico. Nos últimos 20 anos houve um aumento de números de ensaios para determinar a concentração de proteínas (OKUTUCU, 2007). Antes de iniciar qualquer tipo de análise de proteínas, o método utilizado deve ser validado, pois segundo Barros (2002) a validação de métodos é um aspecto vital da garantia da qualidade analítica.
De acordo com Sousa (2012), Vários métodos têm sido descritos na literatura para quantificar proteínas baseados em espectrofotometria, nefelometria e, recentemente, medições HPLC. A escolha do método depende da composição e conformação da proteína. Cada método tem suas vantagens e desvantagens, muitas vezes é necessário obter mais de um tipo de análise de proteínas para a aplicação em pesquisas (OKUTUCU, 2007). 
Os métodos mais utilizados para quantificar proteínas baseiam-se em três princípios diferentes (SOUSA, 2012). O primeiro princípio é o de absorção de luz ultravioleta no comprimento de onda de aproximadamente 280 nm. O segundo princípio é baseado na reação de grupos ou sítios específicos da proteína com diversos reagentes originando complexos (cromóforos) que absorvem em diferentes faixas de comprimento de onda da luz visível e o terceiro principio baseia-se na determinação de nitrogênio seguido pela multiplicação de um fator de conversão de porcentagem de nitrogênio em porcentagem de proteína (SGARBIERI, 1996).
Entre os principais métodos utilizados para determinar proteínas e outras moléculas temos a espectrofotometria, colorimetria, cromatografia e titulação.
ESPECTROFOTOMETRIA 
Segundo Zaia (1998) são muito variados os métodos para a determinação da concentração de proteínas totais, no entanto, as metodologias mais utilizadas são as espectrofotométricas no ultra-violeta e no visível. A principal vantagem dos métodos colorimétricos e espectrofotométricos é a de proporcionarem um meio simples para determinar quantidades diminutas de substâncias.
Um espectrômetro é um instrumento que dispõe de um sistema ótico que pode provocar a dispersão da radiação eletromagnética incidente, e com a qual se podem fazer medidas da radiação transmitida num certo comprimento de onda da faixa espectral (SOUSA, 2012). Um fotômetro destina-se a medir a intensidade da radiação transmitida ou uma função desta intensidade. Um espectrômetro e um fotômetro, combinados num espectrofotômetro, podem gerar um sinal que corresponde à diferença entre a radiação transmitida por um material tomado como referência e a radiação transmitida pela amostra analisada, num certo comprimento de onda. Na análise espectrofotométrica a fonte de radiação emite até a região ultravioleta do espectro. Ainda segundo Sousa (2012) o espectro vai de 185 a 800 nm, sendo ultravioleta de 185 a 400 nm e o espectro visível de 400 nm até 800 nm.
A espectrofotometria é uma técnica analítica baseado na absorção de luz por moléculas que passam do estado fundamental para o excitado, quando a luz é absorvida por um analito, a energia radiante do feixe de luz diminui, sendo a absorbância de luz diretamente proporcional a concentração das espécies absorventes de luz na amostra (SEVERO JUNIOR, 2007). A relação quantitativa entre o fenômeno de absorção e o número de espécies moleculares que sofrem absorção é dada pela lei de Lambert-Beer.
A espectrofotometria é considerada um processo analítico sensível, rápido, cujos resultados são precisos. Quando um feixe de luz monocromática atravessa uma solução que contém uma espécie absorvente, uma parte dessa energia radiante é absorvida e então se estabelece uma relação entre a absorbância ou transmitância com a concentração do analito (FREITAS, 2006; SOUSA, 2012).
Quando essa radiação atravessa a solução, os elétrons das ligações são excitados e ocupam um nível superior de energia, absorvendo parte da energia que passa pela solução. A absorção vai depender do comprimento de onda da radiação e da estrutura eletrônica da molécula, ou seja, quando a luz (monocromática ou heterógena) incide sobre um meio homogêneo, uma parcela da luz incidente é refletida, uma outra parcela é absorvida no meio e o restante é transmitido.
Um espectrofotômetro é formado basicamente por uma fonte de radiação, um monocromador, cubeta onde se coloca a amostra e um detector de sinal. Nos espectrofotômetros, para cobrir todo o intervalo de comprimento de onda, opera-se com duas lâmpadas. De acordo com Sousa (2012) a primeira, usualmente uma lâmpada de tungstênio- halogênio (ou de quartzo-iodo), cobre os comprimentos de onda do espectro visível até o ultravioleta próximo (300-320 nm). A lâmpada tem um bulbo de quartzo a fim de permitir a passagem da radiação ultravioleta. Uma segunda lâmpada, de hidrogênio ou de deutério, é usada para medidas no ultravioleta.
O aparelho ainda pode ser de feixe simples ou duplo, os espectrofotômetros mais modernos são de feixe duplo que cobrem a região de 200 a 800 nm mediante um processo de varredura continua e automática. 
O comportamento de uma amostra em relação à absorbância e sua concentração geralmente obedece uma lei que é a lei de Lambert-Beer. A lei de Lambert afirma que, quando a luz monocromática passa através de um meio transparente, a taxa de diminuição da intensidade com a espessura do meio é proporcional à intensidade da luz. Isto é equivalente a afirmar que a intensidade da luz emitida diminui exponencialmente com a espessura do meio absorvedor, ou que qualquer camada do meio com certa espessuraabsorve sempre a mesma fração da luz incidente sobre ela.
 Já Beer estudou o efeito da concentração do constituinte corado, numa solução, sobre a transmissão ou a absorção da luz e descobriu a mesma relação entre a transmissão e a concentração que Lambert havia descoberto entre a transmissão e a espessura da camada, isto é, a intensidade de um feixe de luz monocromática diminui exponencialmente com a concentração da substancia absorvedora (JEFFERY, 1992; SOUSA, 2012).
O método espectrofotômetro é um método econômico e de fácil execução quando comparado a outros métodos, e pode ser utilizados em análises rotineiras de controle de qualidade de medicamentos e alimentos (SOUSA, 2012).
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS MAIS UTILIZADOS PARA A DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS
Método de Lowry 
O método de Lowry foi proposto primeiramente por Wu em 1922 sendo o mais utilizado para a determinação de proteínas. O método se baseia numa mistura de molibdato, tungstato e ácido fosfórico (reagente Folin Ciocalteau) que sofre uma redução quando reage com proteínas, na presença do catalisador Cu+2 e produz um composto em absorção máxima de 750 nm (SANTOS, 2012). Os aminoácidos cromógenos são tirosina e triptofano. O desenvolvimento da cor do ensaio parece ser bastante estável até 4 horas após a adição do reagente de Folin-Ciocalteau (POMORY, 2008).
O método de Lowry é altamente sensível, apresenta uma melhor exatidão em relação a outros métodos, consome uma menor quantidade de amostras e dependendo do caso está menos suscetível a alguns tipos de interferentes (ZAIA, 1998). Apesar dessas vantagens, o método apresenta longo tempo de análise, possui absortividade específica altamente variável para diferentes proteínas e segue a lei de Lambert-Beer apenas numa pequena faixa de concentração de proteínas. Este método é muito utilizado para determinar proteínas em alimento e no tecido animal, porém, apesar de ser bastante sensível, pode estar sujeita à ação de diversos interferentes. Estes interferentes podem aumentar o valor de absorvância do branco ou a formação de algum tipo de precipitado. O uso de tricloroacético, para provocar a precipitação das proteínas, elimina a maior parte de interferentes deste método.
Aplicações
Para Zaia (1998), principal vantagem do método de Lowry é a sua alta sensibilidade e, por isto, tem sido utilizado para a determinação da concentração de proteínas totais em diversos meios, sendo eles: líqüor, plasma sanguíneo, saliva humana, tecido animal, plantas, suco biliar, membranas, leite humano e produtos alimentícios. Outros autores propuseram uma modificação no método de Lowry que possibilitou o aumento da sensibilidade em cinquenta vezes. 
Tal modificação está baseada no fato de que o verde de malaquita reage com o azul de molibdato produzido no método de Lowry e o produto desta reação absorve fortemente em 690 nm aumentando a sensibilidade do método de Lowry. Devido ao seu extenso uso, o método de Lowry tem sido utilizado em diversos tipos de equipamentos automatizados. Em estudos comparativos de métodos, alguns autores recomendam a utilização da metodologia proposta por Lowry para determinar proteínas totais em líqüor, tecido animal e tecido vegetal. Os autores, de maneira geral, recomendam o método de Lowry, pois no estudo comparativo de metodologias o mesmo mostrou-se mais sensível, com melhor exatidão, menor consumo de amostra e, dependendo do caso, menos suscetível a alguns tipos de interferentes.
Vantagens e desvantagens 
Os autores, de maneira geral, recomendam o método de Lowry, pois no estudo comparativo de metodologias o mesmo mostrou-se mais sensível, com melhor exatidão, menor consumo de amostra e, dependendo do caso, menos suscetível a alguns tipos de interferentes.
Apesar dessas vantagens, o método apresenta longo tempo de análise, possui absortividade específica altamente variável para diferentes proteínas e segue a lei de Lambert-Beer apenas numa pequena faixa de concentração de proteínas (SOUSA, 2012). Porém, a razão para a curvatura da curva padrão parece não ser uma questão de desvio da lei de Lambert-Beer, essa curvatura ainda não é muito bem explicada. Para resolver estes problemas, têm sido propostas várias modificações do método de Lowry como a proposta por Hartree no método melhorando a faixa de linearidade e uniformizando as absortividades específicas para algumas proteínas (ZAIA, 1998).
Ainda de acordo com Sousa (2012), outra desvantagem do método seria a interferência dos íons magnésio (Mg2+) e cálcio (Ca2+). A hipótese para a interferência do cálcio não está muito bem definida, mas a do magnésio seria que o íon magnésio liga-se a proteína e a alguns constituintes do reagente B de Lowry e assim reduz a sua sensibilidade ao reagente de Folin (XIE, 1994; SOUSA, 2012). A adição de oxalato de sódio reduziu significativamente os erros na determinação da concentração de proteína em que havia interferência do cálcio, o oxalato de sódio é um quelante de cálcio.
Dawson e Heatlie (1984) em seus estudos comprovaram que outro interferente do método de Lowry seria a luz. Como as absorbâncias foram consistentemente mais elevadas em amostras que foram expostas diretamente a luz natural, concluiu-se que o ensaio pode ser fotossensível. 
Apesar de todos os interferentes, o método de Lowry é um dos mais utilizados para quantificação de proteínas (SOUSA, 2012).
Método de Biureto
Princípio
As origens do método do biureto podem ser traçadas desde a proposta inicial de Autenrieth, em 1915 (ZAIA, 1998), posteriormente diversos autores propuseram modificações do mesmo, sendo, atualmente, a proposta metodológica de Gornall e cols a mais utilizada.
O método se baseia na reação do reativo do biureto, que é constituído de uma mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante que estabiliza o cobre em solução, sendo o tartarato de sódio o recomendado por Gornall e cols (ZAIA, 1998), ainda segundo Zaia (1998), ocorre a formação de um complexo quadrado planar do cobre com a ligação peptídica da proteína, em meio alcalino. O produto de reação apresenta duas bandas de absorção, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda na região de 270 nm aumentar em seis vezes a sensibilidade do método do biureto, a banda na região de 540 nm é a mais utilizada para fins analíticos, porque diversas substâncias, normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na região de 270 nm causando muita interferência no método.
Aplicações
Esse método tem sido bastante aplicado para determinar a concentração de proteínas totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sanguíneo, líquido cérebro espinhal (líqüor), urina, alimentos, saliva, fibrinogênio e tecido animal. O método de biureto tem sido também, utilizado em análise por injeção em fluxo, assim como em alguns métodos cinéticos (ZAIA, 1998). 
Apesar de ser rápido, utilizar reagentes de baixo custo e não apresentar grande variação da absortividade específica para diferentes proteínas, este método não é muito sensível, como foi destacado por diversos autores, colocando-o em grande desvantagem, em relação a outras metodologias, e por isto tem sido, ao longo dos anos, substituído por métodos mais sensíveis. Mesmo assim, o método de biureto continua sendo recomendado para a determinação da concentração de proteínas totais em plasma sanguíneo pela Associação Americana de Análise Clínicas e por diversos autores, bem como para a determinação de proteínas totais em saliva e leite, quando comparado com outros métodos.
Interferentes
Verifica-se que o método de biureto está sujeito à interferência de substâncias que possam reagir com os íons cobre. Os métodos para sua eliminação variam conforme o caso, Zaia (1998) recomenda a precipitação das proteínas com ácido tricloroacético e posterior solubilização para determinação das mesmas.
 Método de Bradford
Princípio
O método de Bradford é uma técnica para a determinação de proteínas totais que utiliza o corante de “Coomassie brilliant blue” BG-250. Este método ébaseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. Para isto ocorrer, a proteína deve ter estrutura macromolecular, ou seja, de 8-9 ligações peptídicas no mínimo. A ligação ocorre em dois minutos e esta dura aproximadamente duas horas.
Segundo Zaia et al (1998), no pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve fortemente em 595 nm.
Aplicações
O método de Bradford de acordo com Zaia (1998) é mais rápido que o de Lowry e tem sido utilizado para a determinação de proteínas totais em diversos meios: plasma ou soro sanguíneo, líqüor, saliva humana, produtos alimentícios, leite humano, tecidos de plantas, suspensões de células, avidina e estreptavidina, urina e detergentes (JENZANO, 1988).
Alguns autores recomendam o método de Bradford para a determinação de proteínas totais em leite humano, líquor e urina. No entanto, com relação à urina, diversos autores destacam dois fatores contra a utilização desta metodologia, sendo um deles a dependência entre o número de diluições da amostra e o resultado da concentração de proteína obtido e, o outro, a presença de proteínas de baixo peso molecular, subestimando a concentração de proteínas totais na urina, principalmente, de pacientes com proteinúria.
Interferentes
Apesar do método de Bradford ser mais rápido, sensível e estar sujeito a um número bem menor de interferentes que o método de Lowry, o mesmo apresenta algumas desvantagens, tais como a variação da absortividade específica para diferentes proteínas, devido à baixa solubilidade ou baixo peso molecular das mesmas, e fornecimento de resultados nem sempre reprodutíveis devido ao grau de pureza do corante BG-250 que varia conforme a procedência, sendo recomendável a padronização das condições de reação para cada lote de corante adquirido (GOREN, 1986).
Para tentar tornar mais uniforme a absortividade específica de diferentes proteínas, algumas alternativas foram sugeridas: aumentar a concentração do corante aumentar a solubilização das proteínas que vão reagir com o corante, usando detergentes, hidróxido de sódio ou fenol ou aquecer com uréia e 2-mercaptoetanol (GOREN, 1986). Entretanto, no caso de amostras com proteínas de baixo peso molecular, não se recomenda a utilização deste método (ZAIA, 1998).
A falta de linearidade na lei de Beer-Lambert tem sido, também, observada devido a uma variação do pH quando da adição da amostra ao reagente BG-250. Existem poucas substâncias, citadas na literatura, que são interferentes no método de Bradford (ZAIA, 1998). Estes interferentes normalmente reagem com as proteínas impedindo a reação com o corante BG-250 ou reagem com o corante causando aumento na absorbância. Os métodos de eliminação destes interferentes variam conforme o caso, no entanto, Zaia (1998) recomenda a precipitação das proteínas com ácido tricloroacético.
Método de Smith ou BCA
Princípio
O método proposto por Smith (1985), também conhecido por método do ácido bicinchoninico (BCA 4,4'-dicarboxi-2,2'- biquinolina), se baseia na reação de cobre (Cu+2) com proteínas, em meio alcalino, produzindo cobre (Cu+1) e formando um complexo com o BCA, que absorve fortemente na região de 560 nm. Smith et al (1985) declararam que este método monitora os íons cobre monovalentes produzidos na reação de proteínas com cobre bivalente, aumentando a sensibilidade do método, como ocorre no de Lowry. 
Existem outras substâncias capazes de reduzir o Cu+2 a Cu+1 tais como ácido úrico e glicose que causam interferência na determinação (Smith et al, 1985).
No entanto, outros autores citado por Smith (1985), estudando o papel catalisador do cobre, em meio alcalino, na reação entre proteínas e o reativo de Folin-Ciocauteau, detectaram formação de um intermediário de Cu+3 com peptídeos, porém não detectaram Cu+1, como estabelecido por Smith (1985), devendo, portanto, ser este mecanismo melhor estudado para se estabelecer qual ou quais intermediários de cobre são formados.
Aplicações
Este método tem a vantagem de ser mais simples no preparo dos reagentes, tão sensível quanto o método de Lowry é relativamente rápido, sendo aplicado assim como os métodos anteriores, na determinação da concentração de proteínas totais em saliva, proteínas celulares, interferons, leite humano e determinação de grupos funcionais.
O método de Smith tem sido recomendado em estudos de comparação de metodologias para a determinação de proteínas totais em leite humano e células. Esta metodologia também tem sido adaptada para a determinação de proteínas totais utilizando-se equipamentos automatizados.
Interferentes
O método de Smith possui algumas desvantagens, como a dependência da temperatura de incubação das amostras, a variação da absortividade específica para diferentes proteínase a variação da absorbância com o tempo. Recomenda-se, portanto, um rígido controle no tempo de leitura das amostras, após a incubação das mesmas (ZAIA, 1998).
Os interferentes, em potencial, do método de Smith são aquelas substâncias que reagem com os íons cobre (reações de óxido-redução, formação de complexos, precipitação) ou com o reativo de BCA (ZAIA, 1998). Os métodos de eliminação destes interferentes variam conforme o caso, em muitas situações recomenda-se a precipitação das proteínas com ácido tricloroacético.
Método de absorção no Ultra-violeta
Princípio
Este método é baseado no fato de que as proteínas mostram absorção na região de 280 nm e na região abaixo de 220 nm, sendo a primeira devido a diversos aminoácidos (fenilalanina, cisteína, cistina, metionina, triptofano, histidina e tirosina), e a segunda devido à ligação peptídica. No entanto, em 280 nm, em pH neutro, somente os aminoácidos triptofano, tirosina e cistina possuem uma absortividade molar significativamente grande (ZAIA, 1998).
Aplicações
O método tem sido muito utilizado durante os procedimentos de purificação e separação de proteínas para a quantificação das mesmas. Suas principais vantagens são as de não destruir a amostra e de ser rápido, na literatura raramente são descritas outras aplicações além desta (ZAIA, 1998). O principal motivo desta limitação é que, em amostras complexas, diversas substâncias absorvem no ultra-violeta tornando os resultados pouco confiáveis.
Interferentes
Este método está sujeito a muitos interferentes, sendo que qualquer substância que apresente uma banda de absorção na região de leitura é um interferente em potencial. Este fato fez com que esta metodologia fosse utilizada somente em processos de purificação de proteínas, onde uma avaliação semiquantitativa é suficiente, na maioria dos casos. Os métodos discutidos acima são os mais utilizados, porém, como estão sujeitos a limitações, a todo o momento continuam aparecendo, na literatura, modificações das metodologias já existentes.
ELETROFORESE 
Eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. Esta técnica é normalmente utilizada para separar proteínas, moléculas de DNA e moléculas de RNA. As moléculas são separadas de acordo com a massa molecular, carga e conformação (BROETTO, et al., 2014). 
O gel (suporte para a migração eletroforética) pode ser de acetato de celulose, gel de agarose, gel de poliacrilamida, entre outros. Os géis de poliacrilamida são comumente utilizados na separação de proteínas em virtude de ser quimicamente inertes, facilidade de coloração com nitrato de prata e corante azul de Coomassie (corantes como esses coram totalmente a agarose impossibilitando a identificação das espécies no eletroforetograma), os poros são facilmente ajustáveis através do controle de acrilamida e bis-acrilamida que são os polímeros que formam o gel.
Géis de poliacrilamida são formados por copolimerização de acrilamida e Bis-acrilamida (Bis) na presença de persulfatode amônia e tetrametiletilenodiamina (TEMED) ou riboflavina e TEMED sob luz ultravioleta ou fluorescente (BROETTO, et al., 2014). O TEMED catalisa a liberação de radicais livres de persulfato SO4- que, por sua vez, iniciam a polimerização. A acrilamida é uma molécula linear, enquanto a Bis-acrilamida tem forma de “T”. Ao misturar-se essas duas moléculas, tem-se a formação de uma “rede” onde diferentes relações entre as concentrações dessas moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de separação. 
De acordo com Esteves (2012) existem variantes da técnica de eletroforese, que podem ser divididas em: eletroforese nativa (em que as proteínas migram de acordo com os três fatores mencionados anteriormente: carga, massa molecular e conformação), zimografia (em que as condições de corrida e de detecção permitem que se detecte uma determinada atividade enzimática) e eletroforese em condições desnaturantes (mais conhecida por SDS-PAGE, em que as proteínas são desnaturadas previamente, sendo separadas apenas de acordo com a sua massa molecular).
Eletroforese de proteínas SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 
SDS-PAGE é o método mais utilizado para análises qualitativas de proteínas. É um método particularmente útil para acompanhar a purificação de proteínas. Sendo um método em que proteínas são separadas segundo o tamanho, a análise de proteínas por SDS-PAGE também é útil para a determinação da massa molecular relativa da proteína. O SDS é um detergente aniônico. Amostras aplicadas no SDS-PAGE são previamente --mercaptoetanol. O fervidas por 5 min em tampão de amostra contendo SDS e mercaptoetanol reduz as pontes de disulfeto que mantém a estrutura terciária de proteínas e o SDS liga-se fortemente à proteína desnaturando-a. As proteínas presentes nas amostras são totalmente desnaturadas através deste tratamento adquirindo uma forma alongada em forma de tubo cercada de várias moléculas de SDS ao longo da cadeia. Em média, uma molécula de SDS liga-se a dois resíduos de aminoácidos.
A estrutura nativa original da molécula é, portanto, completamente rodeada por moléculas de SDS carregadas negativamente. As estruturas alongadas em forma de tubo são mantidas graças às repulsões entre as cargas negativas que recobrem a cadeia polipeptídica, o que impede qualquer dobramento da proteína de volta à sua estrutura tridimensional. O tampão de amostra também contem um corante, o azul de bromofenol, que permite a visualização da corrida eletroforética, e o glicerol, que aumenta a densidade final da amostra, fazendo com que ela permaneça no fundo do pocinho de aplicação.
Uma vez aplicadas todas as amostras, liga-se a fonte de tensão. É importante observar que a amostra não é aplicada diretamente no gel de separação (normalmente em torno de 5 cm) e sim sob uma camada de gel mais poroso (em geral em torno de 0.8-1 cm) conhecido como gel de empilhamento. É neste gel de empilhamento que se produz as cavidades onde são injetadas as amostras. O objetivo do gel de empilhamento é concentrar a amostra da proteína para formar bandas finas antes de entrar no gel de separação. Este objetivo é alcançado utilizando diferenças na força iônica e no pH entre o tampão de eletroforese e o tampão do gel de empilhamento.
O gel de empilhamento possui um poro bem grande (4 % de acrilamida), o qual permite que as proteínas migrem livremente e se concentre sob o efeito do campo elétrico. O efeito de afinamento da banda baseia-se no fato de que íons glicinato ([glicina]-) presentes no tampão de eletroforese possuem uma mobilidade eletroforética menor do que o complexo proteína-SDS ([proteína-SDS] -) o qual por sua vez, possui mobilidade menor que íons cloreto (Cl-) presentes no tampão (loading buffer) e no tampão do gel de empilhamento. Quando a corrente é ligada, todas as espécies iônicas precisam migrar com a mesma velocidade, do contrário elas funcionariam como breque no circuito elétrico.
O complexo proteína-SDS carregado negativamente migra para o ânodo, e como todas as proteínas possuem a mesma carga líquida por unidade de comprimento, elas migram no gel de separação com a mesma mobilidade. No entanto, à medida que eles passam no gel de separação as proteínas de tamanhos diferentes se separam devido às propriedades “peneirantes” do gel. De forma simples, quanto menor a proteína mais facilmente ela passa através dos poros do gel, enquanto proteínas maiores tem sua migração retardada pela força friccional (resistência) resultante do efeito peneira do gel. Sendo uma molécula pequena, o azul de bromofenol é o que migra com mais facilidade indicando a localização da frente da eletroforese.
Quando o corante atinge a extremidade do gel, desliga-se a corrente (fonte de tensão) e o gel então é removido e colocado em uma solução de coloração (normalmente utiliza-se o Coomassie Blue) e depois descolorido utilizando-se uma solução de descoloração. A solução de descoloração remove o corante que não se ligou ao gel, deixando visíveis as bandas de proteínas coradas em azul em um gel transparente. Um minigel leva em torno de 1 h para o preparo, 40 min para a corrida em 200 V e 1 h para coloração em azul de coomassie. Fazendo-se uma descoloração rápida é possível visualizar as bandas em 20 min, porém as bandas são melhor visualizadas após descoloração por uma noite. A massa molecular relativa (Mr ou PM, peso molecular) de uma proteína pode ser determinada comparando-se a mobilidade da proteína com o de padrões de Mr conhecido. Plotando-se um gráfico de log Mr x migração relativa, constrói-se uma curva de calibração (curva padrão) que permite a determinação da Mr da proteína de interesse. A análise por SDS-PAGE é utilizada para acompanhar a purificação de proteína em cada etapa de purificação. Uma proteína pura aparece como uma banda única no gel, a não ser que a proteína seja constituída por duas subunidades de tamanhos distintos. Neste último caso, aparecerão duas bandas no gel, cada uma correspondendo a uma subunidade da proteína.
Detecção de proteínas no gel 
O corante mais comumente utilizado para detectar proteínas em um gel é o Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB). A coloração normalmente é feita com uma solução a 0.1 % de CBB em metanol:água:ácido acético glacial (45:45:10). A mistura ácido-metanol serve como um agente desnaturante que precipita e fixa as proteínas no gel, evitando que as proteínas sejam perdidas no processo de lavagem do gel. A coloração por CBB requer em torno de 0.1 ug (100 ng) de proteína. Quando se requer uma coloração mais sensível que detecte concentrações mais baixas de proteína, utiliza-se a coloração por prata. No processo de coloração o íon de prata (Ag+) é reduzido à prata metálica na proteína, onde a prata se deposita formando uma banda de cor marrom. A coloração por prata pode ser utilizada imediatamente após a eletroforese ou depois da coloração com CBB. A coloração por prata é pelo menos 100 vezes mais sensível que o CBB detectando proteínas em torno de 0.001 ug (1 ng). Outros corantes utilizados são o Sypro Orange (30 ng) e Sypro Ruby (10 ng). 7 Análises quantitativas da proteína podem ser feitas realizando-se um escaneamento por densitometria. Existem vários equipamentos comerciais (Densitômetros, Scanners) que detectam as bandas através do uso de um laser e medindo-se a transmitância. Embora a análise por eletroforese em gel seja um método analítico, em algumas situações ela pode ser utilizada para separar ou purificar proteínas. Neste caso corta-se a banda contendo a proteína de interesse. Em geral esse procedimento é feito para análises que requerem quantidade muito pequena de amostra como, por exemplo, para análises por espectrometria de massas.
CROMATOGRAFIA 
A Cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionáriasa torna uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação. 
A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura. As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando-se diversos critérios, sendo alguns deles listados abaixo: 
Classificação pela forma física do sistema cromatográfico 
 Em relação à forma física do sistema, a cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar. Enquanto a cromatografia planar resume-se à cromatografia em papel (CP), à cromatografia por centrifugação (Chromatotron) e à cromatografia em camada delgada (CCD), são diversos os tipos de cromatografia em coluna, os quais serão mais bem compreendidos quando classificados por outro critério.
Classificação pela fase móvel empregada 
Em se tratando da fase móvel, são três os tipos de cromatografia: a cromatografia gasosa, a cromatografia líquida e a cromatografia supercrítica (CSC), usando-se na última um vapor pressurizado, acima de sua temperatura crítica. A cromatografia líquida apresenta uma importante subdivisão: a cromatografia líquida clássica (CLC), na qual a fase móvel é arrastada através da coluna apenas pela força da gravidade, e a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), na qual se utilizam fases estacionárias de partículas menores, sendo necessário o uso de uma bomba de alta pressão para a eluição da fase móvel. A CLAE foi inicialmente denominada cromatografia líquida de alta pressão, mas sua atual designação mostra-se mais adequada. No caso de fases móveis gasosas, separações podem ser obtidas por cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR). A diferença entre os dois tipos está na coluna. Enquanto na CGAR são utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionária é um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de maior diâmetro empacotadas com a fase estacionária. 
Classificação pela fase estacionária utilizada 
Quanto à fase estacionária, distingue-se entre fases estacionárias sólidas, líquida e quimicamente ligadas. No caso da fase estacionária ser constituída por um líquido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte sólido ou imobilizado sobre ele. Suportes modificados são considerados separadamente, com fases quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de separação. 
 Classificação pelo modo de separação 
 Por este critério, separações cromatográficas se devem à adsorção, partição, troca iônica, exclusão ou misturas desses mecanismos. Dentre os vários tipos de cromatografia, especial ênfase será dada à cromatografia em camada delgada (CCD), à cromatografia líquida clássica e de alta eficiência (CLAE) e à cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR).
I CROMATOGRAFIA PLANA 
 Na cromatografia plana, a fase estacionária é suportada sobre uma placa plana ou nos poros de um papel. Nesse caso, a fase móvel desloca-se através da fase estacionária por ação da capilaridade ou sob a influência da gravidade. Útil em separação de compostos polares. Encontra-se bastante difundida devido à sua facilidade experimental e ao seu baixo custo. 
 1. Cromatografia em Papel 
 Esta técnica é assim chamada porque utiliza para a separação e identificação das substâncias ou componentes da mistura a migração diferencial sobre a superfície de um papel de filtro de qualidade especial (fase estacionária). A fase móvel pode ser um solvente puro ou uma mistura de solventes. Este método é muito útil para separar substâncias muito polares, como açúcares e aminoácidos. Possui o inconveniente de poder-se cromatografar poucas quantidades de substância de cada vez. 
Manipula-se o papel com cuidado e pelas pontas, e cortam-se tiras em tamanhos que possam ser contidos nas cubas. É importante cortar o papel seguindo o eixo das fibras, pois a celulose está orientada neste sentido, o que facilitará a passagem da fase móvel. Os líquidos polares terão grande afinidade pelas hidroxilas da molécula de celulose, formando pontes de hidrogênio, ficando retido e funcionando como fase estacionária, e os líquidos menos polares serão repelidos por esta estrutura, funcionado como fase móvel. 
As cubas deverão ser perfeitamente fechadas para permitir a saturação interna. A cromatografia pode ser ascendente ou descendente, sendo que esta última é mais rápida e consome menos eluente. 2 cm de altura de eluente na cuba é suficiente para a cromatografia ascendente. Coloca-se a amostra a ser analisada um pouco acima da extremidade inferior do papel seco, que após ter esta extremidade inferior mergulhada numa mistura de solventes, terão os seus constituintes arrastados, juntamente com esta mistura que tende a subir por capilaridade. Os diferentes constituintes apresentarão variação na velocidade de deslocamento, de acordo com os seus coeficientes de partição. Os componentes menos solúveis na fase estacionária (água) terão uma movimentação mais rápida. Pode ser utilizado para análise de mistura de aminoácidos ou misturas de açúcares. A cromatografia em papel pode ser também no sentido descendente e bidimensional, este último realizado em duas etapas com solventes apresentando diferentes propriedades.
2. Cromatografia em Camada Delgada 
A cromatografia em camada fina (ou delgada) é uma técnica simples, barata e muito importante para a separação rápida e análise quantitativa de pequenas quantidades de material. Ela é usada para determinar a pureza do composto, identificar componentes em uma mistura comparando-os com padrões; acompanhar o curso de uma reação pelo aparecimento dos produtos e desaparecimento dos reagentes e ainda para isolar componentes puros de uma mistura.
3. Cromatografia Centrífuga
Cromatografia centrifuga é uma cromatografia em camada delgada preparativa e acelerada centrifugamente. Baseia-se no principio da operação onde a amostra a ser separada é aplicada como uma solução no centro do disco giratório umedecido com o solvente. A eluição com solvente gera bandas circulares de separação dos componentes que são removidos juntamente com o solvente para um tubo de recepção. 
III. CROMATOGRAFIA EM COLUNA
A cromatografia em coluna costuma ser citada como o mais antigo procedimento cromatográfico. Foi utilizada primeiramente para o isolamento dos pigmentos existentes nas folhas verdes dos vegetais. Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plástico, preenchida com um adsorvente adequado. É uma técnica de partição entre duas fases, sólida e líquida, baseada na capacidade de adsorção e solubilidade. O sólido deve ser um material insolúvel na fase líquida associada, sendo que os mais utilizados são a sílica gel (Si O2) e alumina (Al2O3), geralmente na forma de pó. 
IV. CROMATOGRAFIA GASOSA
Cromatografia data de 1903 no trabalho do cientista russo Mikhail Semenovich Tswett. O estudante graduado alemão Fritz Prior desenvolveu a cromatografia gasosa de estado sólido em 1947. Archer John Porter Martin, quem foi vencedor do Prêmio Nobel por seu trabalho no desenvolvimento das cromatografias líquido-líquido (1941) e em papel (1944), estabeleceu os fundamentos para o desenvolvimento da cromatografia gasosa e posteriormente produziu a cromatografia gás-líquido (1950). Técnica de separação e análise de misturas por interação dos seus componentes entre uma fase estacionária e uma fase móvel.
Técnica utilizada na Cromatografia Gasosa: 
Uma cromatografia gasosa é uma técnica que se baseia na análise química instrumental por separação de compostos químicos e uma amostra complexa. Uma cromatografia gasosa usa um tubo estreito através do qual se dá o fluxo conhecido como coluna, através do qual diferentes constituintes de uma amostra passa em uma corrente de gás (gás condutor, ou transportador, a fase móvel) em diferentes taxas dependendo de várias propriedades físicas e químicase suas interações com um específico recheio da coluna, chamada fase estacionária. Como os compostos químicos saem no final da coluna, são detectados e identificados eletronicamente. 
A função da fase estacionária na coluna é separar componentes diferentes, causando a cada um saída da coluna em um tempo diferente (tempo de retenção). Outros parâmetros que podem ser usados para alterar a ordem ou tempo de retenção são a taxa de fluxo do gás condutor e a temperatura. 
Em uma análise CG, um volume conhecido de analito gasoso ou líquido é injetado na entrada da coluna, geralmente com o uso de uma microseringa (ou com fibras de microextração de fase sólida, ou). Conforme o gás carreador leva as moléculas do analito através da coluna, essa movimentação é inibida pela adsorção das moléculas do analito nas paredes da coluna ou no material do empacotamento da mesma. A taxa com que as moléculas progridem ao longo da coluna depende da força da adsorção que, por sua vez, depende do tipo de molécula e do material da fase estacionária. Uma vez que cada tipo de molécula tem uma taxa de progressão diferente, os vários componentes da mistura de analito são separados conforme progridem ao longo da coluna, chegado ao fim dela em momentos diferentes (tempos de retenção).
Um detector é empregado para monitorar o fluxo de saída da coluna. Assim, o momento em que cada componente sai da coluna, e a quantidade deles, pode ser determinada. Geralmente, as substâncias são identificadas (qualitativamente) pela ordem com que emerger (eluem) da coluna e pelo tempo de retenção do analito na coluna.
As partes de um Cromatógrafo Gasoso: 
A cromatografia é um método físico de separação, no qual componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases: a fase estacionária, e a fase móvel. A amostra é transportada por uma corrente de gás através de uma coluna empacotada com um sólido recoberta com uma película de um líquido. Devido a sua simplicidade, sensibilidade e efetividade para separar os componentes de misturas, a cromatografia de gás é uma das ferramentas mais importantes em química. É amplamente usada para análises quantitativos e qualitativos de espécies químicas e para a determinar constantes termoquímicas tais como, calores de solução e vaporização, pressão de vapor e coeficientes de atividade. A cromatografia de gás é também usada para monitorar os processos industriais de forma automática: analisam-se as correntes de gás periodicamente e realizam-se reações de forma manual ou automática para compensar variações não desejadas.
V. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA 
A cromatografia líquida (HPLC) é um processo de análise de separação físico cuja aplicação permite a análise qualitativa mais comumente e quantitativa de uma amostra. Esse método analítico vem sendo amplamente empregado graças ao rápido tempo de análise. Permite separar constituintes de uma mistura através de sua distribuição em duas fases: fase móvel é um líquido e a fase estacionária é um sólido. A cromatografia liquida é utilizada em várias áreas da ciência, no acompanhamento de sínteses, em análises de pesticidas, feromônios, no isolamento de produtos naturais e sintéticos e na produção e controle de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicações. 
AVALIAÇÃO DO NITROGÊNIO TOTAL (PROTEÍNA TOTAL) PELO MÉTODO DE KJELDAHL 
O termo proteína bruta envolve grande grupos de substancias com algumas semelhanças químicas, porém com funções bioquímicas e fisiológicas diferentes. O nitrogênio é o elemento com propriedades mais distintas presentes na proteína. Os teores de nitrogênio não provem somente das proteínas, mas também de outros componentes como ácidos nucleicos, aminas, aminoácidos não proteicos e etc (GOMES & OLIEIRA, 2011).
A analises de proteína é complicada pelo fato desses componentes presentes nos alimentos possuírem propriedades físico-químicas semelhantes. Assim, baseado no fato das proteínas terem percentual de nitrogênio aproximadamente, pode se proceder á sua avaliação inteira por intermédio da concentração de nitrogênio no material e utilizando fatores de conversão para a expressão do resultado em termos de equivalentes proteicos (SILVA & QUEIROZ, 2002).
O método mais utilizado no Brasil foi proposto por kjeldahl na Dinamarca em 1883, quando estudava proteínas em grãos. Este método apresenta três etapas distintas: digestão, destilação e titulação. A digestão baseia se no aquecimento da amostra em acido sulfúrico até que os compostos orgânicos sejam oxidados. O nitrogênio da proteína (orgânico) é reduzido e transformado em sulfato de amônia (inorgânico) que é uma substancia estável.
Nessa etapa utiliza se uma mistura digestora, composta de um sal (sulfato de sódio ou potássio), com a finalidade de elevar o ponto de ebulição do acido sulfúrico permitindo a decomposição da matéria orgânica, e um catalisador metálico, que aumenta o poder de oxidação do meio (SILVA & QUEIROZ, 2002). Posteriormente, adiciona se hidróxido de sódio concentrado e aquece-se para a liberação da amônia, que constitui forma quantificável do nitrogênio. O borato de amônia formado é titulado com uma solução padronizada de acido sulfúrico, obtendo-se o teor de nitrogênio presente na amostra (SILVA & QUEIROZ, 2002).
A digestão pode ser feita em tubos fechados ou abertos. A principal vantagem dos tubos fechados é a dispensa de catalisadores ou de qual quer outro aditivo além do ácido sulfúrico (H2SO4) e a temperatura de digestão é de 450 °C, aproximadamente. 
A decomposição de material orgânico nitrogenado em amônia e outros componentes requer uma quantidade variável de acido sulfúrico, o que está na dependência da quantidade e estrutura da amostra. A quantidade total de acido depende, ainda, de sua perda por volatilização, a qual, por sua vez, varia com a taxa de aquecimento da temperatura e com o tempo de digestão (SILVA & QUEIROZ, 2002). A perda de acido também depende da proporção entre o ácido sulfúrico e os sais da mistura digestora, ou seja, do índice acido.
De acordo com Silva & Queiroz (2002) o índice ácido regula a perda do nitrogênio, portanto, se o material frio, após a digestão, estiver solido ou quase solido, é provável que tenha ocorrido perda de nitrogênio, motivada pela quantidade insuficiente de ácido presente. Então, uma quantidade especifica de ácido deve estar presente durante a digestão, para não haver perda de nitrogênio.
Em face das diferentes temperaturas exigidas para a decomposição das substancias orgânicas, uma vez que algumas não se decompõem á temperatura normal de ebulição do ácido sulfúrico, torna se necessário aumentar a severidade da reação pela adição de determinados sais, sendo o mais comum o sulfato de potássio ou de sódio. Mesmo assim, a oxidação da matéria orgânica ainda é relativamente lenta. Entretanto, poderá ser acelerada pela adição de catalisadores ou agentes oxidantes. Os sais de cobre (CuSO4 . 5H2O) e selênio metálico (S) são os mais comumente usados.
O mercúrio tem sido considerado o melhor dos catalisadores, relativamente ao fato de não-ocorrência de perda de nitrogênio. Todavia, ele forma um complexo mercúrio-amoniacal que necessita ser decomposto antes de ser determinado o nitrogênio. O selênio tem dado resultados variáveis, tendo sido relatada perda de nitrogênio quando se usa este elemento, porém, do ponto de vista de aumentar a velocidade do tempo da digestão, ele é superior ao mercúrio. O cobre também pode acarretar alguma perda de nitrogênio.
De acordo com Silva & Queiroz (2002) o uso de agentes oxidantes tem sido pouco aconselhado, por causa dos perigos de perda do nitrogênio. Ácido perclórico, por exemplo, pode causar perda de nitrogênio. Em alguns casos, a água oxigenada tem dado bons resultados, especialmente em material que contem grande quantidade de carbono na fora de gordura, e, além disso, evita a formação de excesso de espuma.
A amônia pode ser separada por meio da destilação, aeração e difusão, sendo o processo de destilação, com arraste por vapor, preferido ao do aquecimentodireto. A determinação da amônia pode ser por titulação simples, método iodométrico e método colorimétrico. A titulação simples, comumente usada nos processos tradicionais de determinação de nitrogênio total, só pode ser utilizada com a separação da amônia após a digestão o que não é necessário com os outros métodos. O método iodométrico ou semelhante tem inúmeras desvantagens e não é popular. Os métodos colorimétricos são relativamente novos e de pouca aplicação.
A mistura digestora pode variar conforme o método a ser usado, sendo a mais comum a composta dos seguintes sais e na proporção 10 partes de sulfato de sódio ou de potássio e 1,0 parte de sulfato de CuSO4 . 5H2O. A mistura digestora tem, entre outras finalidades: o sulfato de sódio ou o de potássio contido nesta mistura tem objetivo de elevar o ponto de ebulição do ácido sulfúrico de 180°C para, aproximadamente, 400°C e, pela formação de S2O7, tornar a digestão mais rápida. 
As reações químicas que ocorrem durante o processo da determinação dos compostos nitrogenados podem ser assim resumidas:
DIGESTÃO: Durante a fase de digestão, coloca se no balão Kjeldahl a amostra embrulhada, de preferencia em papel impermeável, juntamente com a mistura digestora e o H2SO4 concentrado. Faz se o aquecimento a gás ou em chapa elétrica. Provavelmente as seguintes reações são observadas:
O carbono contido na matéria orgânica é oxidado e o dióxido de carbono (CO2) se desprende. Durante o processo da digestão a solução passa de uma coloração escura (preto) para um verde (claro). Além dos agrupamentos proteicos, existe o nitrogênio sob a forma de amina, amida e nitrila, que é transformado em amônia (NH3) a qual reage com o H2SO4, formando o sulfato de amônio ((NH4)2SO4) conforme mostrado nas reações durante a digestão, e esse ao esfriar forma cristais.
Destilação
Após a digestão inicia-se o processo de destilação que pode ser feita por aquecimento direto ou por arraste de vapor. O sulfato de amônio é tratado com hidróxido de sódio (NaOH), em excesso, ocorrendo a liberação de amônia, conforme as reações:
Ao se adicionar o hidróxido de sódio, deve-se utilizar algumas gotas de solução indicadora, no destilador, para garantir um ligeiro excesso de base. A amônia que desprende na reação é coletada num frasco contendo ácido bórico (H3BO3) com o indicador, previamente adaptado ao conjunto da destilação.
Considera-se terminado o processo, quando toda a amônia já se desprendeu. A solução contendo ácido bórico com o indicador que no início apresentava coloração rósea adquire a cor azulada à medida que vai se formando o borato de amônio (NH4H2BO3), conforme a reação:
Titulação
A última etapa do processo corresponde a titulação. O borato de amônio é titulado com uma solução padrão de ácido clorídrico (HCl) de título conhecido até a viragem do indicador, conforme a reação:
O nitrogênio total (NT) é determinado pela seguinte equação:
Onde:
NT – teor de nitrogênio total na amostra, em percentagem;
Va – volume da solução de ácido clorídrico gasto na titulação da amostra, em mililitros;
Vb – volume da solução de ácido clorídrico gasto na titulação do branco, em mililitros;
F – fator de correção para o ácido clorídrico 0,01 mol/L;
P1 – massa da amostra (em gramas).
Na determinação da proteína bruta, multiplica-se o valor do nitrogênio total encontrado pelo método de Kjeldahl por um fator que converte o nitrogênio em proteína. Convencionalmente, em amostras de alimentos para animais: plantas forrageiras, rações concentradas, entre outros materiais, a proteína bruta (PB) é expressa pelo fator 6,25, considerando que a maioria das proteínas contém nas suas moléculas aproximadamente 16% de nitrogênio. A expressão abaixo é utilizada para determinar a proteína bruta:
PB = NT x FN
Onde:
PB – teor de proteína bruta na amostra, em percentagem;
FN – 6,25.
Parte Experimental
Materiais e Equipamentos
• Bloco digestor; • Capela para exaustão de gases;
• Destilador de nitrogênio; • Bureta automática;
• Agitador magnético; • Erlenmeyer de 50 mL;
• Frascos dosadores de reagente; • Espátula;
• Balança analítica - precisão (± 0,0001g); 
• Tubo de ensaio com borda reforçada (25x250 mm);
• Papel impermeável. 
Reagentes e Soluções
• Ácido sulfúrico (H2SO4 – d=1,84), p.a., concentrado;
• Hidróxido de sódio (NaOH) a 40% (m/v);
• Sulfato de sódio (Na2SO4);
• Sulfato de cobre pentaidratado (CuSO4.5H2O);
• Ácido clorídrico (HCl) 0,01 mol/L;
• Solução alcoólica de verde de bromocresol, a 0,1% (m/v);
• Solução alcoólica de vermelho de metila a 0,1% (m/v);
• Solução alcoólica de vermelho de metila a 0,04% (m/v);
• Solução de ácido bórico, a 2% (m/v).
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