protocolo MTT

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA-LABIOEX
Coordenadora: Profª Rozangela Curi Pedrosa
Revisores do Protocolo: Karina B. Felipe/Maicon R. Kviecinski
Avaliação da viabilidade celular pela técnica do MTT
Protocolo para Células Aderentes
1. Princípio
Este ensaio baseia-se na medida do dano induzido pelo composto/extrato em estudo no metabolismo celular de glicídeos usualmente através da avaliação da atividade de desidrogenases mitocondriais. A viabilidade mitocondrial, e conseqüentemente, a viabilidade celular, é quantificada pela redução do MTT (um sal de coloração amarela e solúvel em água) a formazan (sal de coloração arroxeada e insolúvel em água) pela atividade daquelas enzimas. Dessa forma, a redução do MTT a formazan, será diretamente proporcional à atividade mitocondrial e a viabilidade celular.
2. Amostra
Células aderentes cuja viabilidade celular deseja-se avaliar após o seu tratamento com o composto/extrato em estudo. 
3. Reagentes/soluções/ suspensão celular
3.1. Meio de cultura suplementado com soro fetal bovino (SBF) e solução de antibióticos (penicilina 10.000u/mL e estreptomicina 10.000µg/mL)
	Normalmente, para células aderentes, é utilizado o meio DMEM simples ou rico em glicose, o qual deve ser suplementado com SFB (10%) e solução de antibióticos (1%). 
3.2. Solução de MTT (0,5mg/mL)
	Para preparar de 10 mL da solução de MTT (0,5mg/mL), proceder da seguinte maneira:
1- Preparo da solução estoque a 5mg/mL: Pesar 5mg de MTT e solubilizar em 1 mL de PBS estéril.
2- Preparo da solução 0,5mg/mL: 
CV=CV
5mg/mL X V = 0,5mg/mL X 10 mL
V= 1 mL da solução estoque
Dessa forma, para preparar 10 mL da solução a 0,5mg/mL deve-se utilizar 1 mL da solução estoque e adicionar 9 mL de meio completo.
Observações: Este cálculo mostra as quantidades de solução estoque, PBS estéril e de meio completo necessários para preparar 10 mL da solução de MTT a 0,5mg/mL, que refere-se à quantidade necessária para executar o ensaio em uma placa de 96 poços completa. Se você não for utilizar uma placa inteira, reajustar os cálculos!
3.3. Suspensão celular na concentração de 0,5X105 células/mL
	Para preparar uma suspensão celular (0,5X105 células/mL), proceder da seguinte maneira:
1- Determinar o número de células existentes nas garrafas de cultivo celular
2- Uma vez determinado o número de células (onde o resultado será expresso em células/mL), fazer regra de três para determinar a quantidade da suspensão celular (proveniente das células da garrafa), bem como a quantidade de meio completo a ser utilizada. Exemplo: Se você determinou o número de 5 x105 células/mL na contagem deverá fazer a seguinte regra de três:
5 x105 ----- 1000µl
 0,5 X105 ----- X
X= 100µl
Ou seja, em 100 µl da suspensão celular da garrafa você possui 0,5 X 105 célula. Para obter 1 mL de uma suspensão de 0,5X105 células/mL, bastaria pegar os 100 µl da suspensão celular da garrafa e adicionar 900 µl de meio completo. Posteriormente, você deve ajustar os cálculos para quantos mL de suspensão celular necessitará para realizar o teste.
4. Procedimento
1- Preparar uma suspensão celular na concentração de 0,5X105 células/mL. Levar em consideração o número de poços a serem utilizados e o fato de que em cada poço, devem ser adicionados 200 µl dessa suspensão celular.
2- Adicionar em cada poço, 200 µl da suspensão celular.
3- Incubar a placa na estufa de CO2 pelo período de 24 horas.
4- Retirar o meio de cultura.
5- Tratar as células com 100 µl das respectivas soluções controle e compostos teste nas concentrações desejadas.
6- Incubar a placa na estufa de CO2 pelo período de 24, 48 ou 72 horas.
7- Retirar o meio de cultura.
8- Lavar os poços 2X com 200 µl de PBS estéril a temperatura de 37ºC.
9- Adicionar a todos os poços 100 µl da solução de MTT (0,5mg/mL).
10- Incubar a placa na estufa de CO2 pelo período de 2 horas.
11- Retirar a solução de MTT da placa.
12- Adicionar a todos os poços (INCLUSIVE NO BRANCO) 100µl de DMSO puro.
13- Agitar a placa no agitador de placa pelo período de 5 minutos.
14- retirar a placa do agitador e esperar 5 minutos para estabilização da cor.
15- Fazer a leitura a 540 nM. 
5. Cálculos
	Deve-se calcular a média de absorbância de todos os testes, inclusive do BRANCO e dos CONTROLES. Posteriormente, deve-se subtrair a média da absorbância do BRANCO de todos os testes, inclusive do CONTROLE. O valor obtido pela subtração da média dos controles pela média dos brancos deve ser considerado como 100% de células viáveis. Para os demais testes, deve-se fazer uma regra de três (utilizar o valor obtido pela subtração da média dos testes pela média dos brancos) para obter o percentual de células viáveis.