Cinética de degradação química de fibratos traduzido

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Cinética de degradação química de fibratos: bezafibrato, ciprofibrato e fenofibrato
Marcelo Antonio de Oliveira 1   * 
Gerliane Damázio da Silva 1 
Michele Soares Tacchi Campos 1 
1 Centro Universitário Norte do Espírito Santo, Universidade Federal do Espírito Santo, São Mateus, ES, Brasil
ABSTRATO
Os fibratos são medicamentos utilizados para o tratamento da hipertrigliceridemia e para a prevenção da aterosclerose. Três medicamentos na classe de fibrato, ciprofibrato, fenofibrato e bezafibrato foram escolhidos para este estudo porque suas matérias-primas estão prontamente disponíveis e porque as publicações científicas sobre esses compostos são limitadas. Para avaliar a sua estabilidade intrínseca, os medicamentos foram expostos a uma condição de teste (temperatura, oxidação, exposição à luz UV, hidrólise a diferentes valores de pH e íons metálicos em solução) e depois foram submetidos a análise por HPLC. As amostras foram executadas em uma coluna C18, com uma taxa de fluxo de 1,0 mL min -1em uma fase móvel consistindo em metanol: 0,01% de ácido fosfórico v / v (80:20), com comprimentos de onda de detecção variável nos espectros UV. A metodologia de análise mostrou parâmetros de desempenho satisfatórios. Os três medicamentos foram muito instáveis, degradando-se em cada uma das condições avaliadas. As condições de teste de hidrólise ácida e básica mostraram a degradação mais significativa. Os resultados demonstraram que os medicamentos desta classe são instáveis. Com base nesta cinética de degradação determinada experimentalmente, é fácil entender e enfatizar a importância da falta de formas de dosagem líquidas no mercado de fibratos devido à sua instabilidade.
Unitermos:  hipertrigliceridemia / fibratos; Fibra estabilidade / estudo; Fibra produtos de degradação / Cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC); Fibra / cinética de degradação.
INTRODUÇÃO
Os fibratos são medicamentos utilizados para o tratamento da hipertrigliceridemia e para a prevenção da aterosclerose e são representados pelos seguintes compostos: clorfibrato, ciprofibrato, bezafibrato, fenofibrato e geozila. Fibratos diminuem os níveis de triglicerídeos e aumentam os níveis de HDL-C, o último efeito é mais pronunciado em pacientes com hipertrigliceridemia. O efeito nos níveis de LDL-C varia. Eles podem reduzir os níveis de LDL-C em pacientes com baixos triglicerídeos, mas podem paradoxalmente aumentar os níveis de pacientes com níveis elevados de triglicerídeos. As fibras também reduzem significativamente os níveis de lipoproteínas remanescentes altamente aterogênicas e são mais eficientes que as estatinas ao fazê-lo ( Schulz, 2006 ).
Entre os fibratos, foram escolhidos três medicamentos para a execução deste projeto: ciprofibrato, fenofibrato e bezafibrato ( Figura 1 ). As drogas foram escolhidas com base na disponibilidade de matérias-primas e na evidência de poucas publicações científicas sobre os medicamentos sobre o tema da pesquisa.
FIGURA 1  Estrutura molecular de (a) bezafibrato, (b) ciprofibrato e (c) fenofibrato. 
Alguns métodos analíticos foram desenvolvidos para a análise de ciprofibrato, fenofibrato e bezafibrato por HPLC / UV ( Nascimento et al ., 2011 ; Salama et al ., 2011 ; Jain et al ., 2012 ; Kumbhar et al ., 2013 ; Wei et al ., 2008 ). A grande maioria dessas metodologias analíticas utilizou colunas de fase reversa, principalmente octadecil silano, com uma solução de pH acidental controlada para a fase móvel e detecção na faixa ultravioleta.
Poucos artigos foram publicados sobre a estabilidade dos fibratos escolhidos ( Salama et al ., 2011 ; Jain et al ., 2012 ; Kumbhar et al ., 2013 ), e não foram encontrados os produtos de degradação identificados, a via de degradação hipotetizada, ou estudou a cinética de degradação dessas drogas. Os excipientes são escolhidos para formulações farmacêuticas com base nos dados de estabilidade, com o objetivo de obter uma formulação mais estável. Note-se que o fenofibrato é um éster e o bezafibrato é uma amida, o que os torna muito suscetíveis a reações de hidrólise.
De acordo com o sistema de classificação biofarmacêutica (BCS), os fibratos são medicamentos de classe II com baixa solubilidade e alta permeabilidade ( Benet, 2006 ). Qualquer alteração na qualidade de uma droga de classe II causada por problemas de estabilidade influencia diretamente a biodisponibilidade do medicamento ( Yoshida et al ., 2010 , 2011).
A metodologia analítica de HPLC deve ser otimizada para a determinação do medicamento original, bem como possíveis produtos de degradação obtidos em condições de teste de estabilidade intrínseca. Os parâmetros de desempenho cromatográfico devem ser avaliados após a otimização técnica, como o fator de retenção (k '), o número de placas teóricas / coluna (N), resolução (Rs) e o fator ou a assimetria da cauda (T) (ANVISA, 2010).
Ao desenvolver uma formulação farmacêutica, é importante determinar a estabilidade intrínseca do fármaco para prever possíveis reações e produtos de degradação ( Silva et al ., 2009 ). A estabilidade da substância deve ser avaliada para uma série de estressores, incluindo mudanças de temperatura, oxidação, exposição à luz UV e hidrólise em diferentes valores de pH. A fotoestabilidade pode ser avaliada sujeitando o composto à irradiação UV. Algumas vias de degradação podem ser complexas. Nem todos os produtos de decomposição formados nas condições mais drásticas de estabilidade intrínseca são vistos em drogas submetidas às condições oficiais de estudos de estabilidade (USP, 2014; Silva et al ., 2009; ANVISA, 2005).
De acordo com os regulamentos, é importante esgotar as possibilidades de todas as reações medicamentosas que não foram totalmente exploradas ( Silva et al ., 2009 ; USP, 2014; ANVISA, 2005). Também é importante propor mecanismos de degradação, estudar a cinética das reações e avaliar a formulação farmacêutica e compará-la com a escolha dos excipientes utilizados.
Para pesquisar os produtos de degradação, os medicamentos são submetidos a condições drásticas, incluindo hidrólise neutra, ácida ou básica, oxidação com peróxido, exposição a luz UV, degradação com íons metálicos (FeSO 4 ) e calor (ANVISA, 2005, 2013). A análise deve ser realizada por HPLC e os mecanismos probabilísticos de possíveis reações de degradação devem ser propostos.
Kumbhar et al . (2013 ) relata que o fenofibrato sofre uma rápida degradação através de hidrólise ácida e básica e sob oxidação mediada por peróxido de hidrogênio. Jain et al . (2012 ) relata que o ciprofibrato é instável para hidrólise ácida, hidrólise básica e sob oxidação.
A cinética de degradação também é usada para avaliar a estabilidade da droga onde a extensão da degradação, t 90 (tempo para degradar 10% do fármaco), taxa de degradação, facilidade de degradação (que está relacionada à Ativação de Energia da reação), e torna-se interessante em comparação com condições de estresse estabelecendo uma lógica de proporcionalidade e para reações químicas. Assim, a estabilidade intrínseca e estudos cinéticos são componentes essenciais na descoberta de produtos potenciais de degradação de drogas, mesmo que esses produtos não ocorram em condições normais de armazenamento de medicação ( Yoshida et al ., 2010 , 2011).
Depois de definir as condições em que as drogas se degradam, realizamos um estudo que incluiu diferentes tempos de coleta para determinar a progressão das reações de degradação. Em seguida, foram realizados estudos químicos e matemáticos para determinar a energia de ativação (E a ), o fator pré-exponencial, a taxa de reação ( k ) e, finalmente, as estimativas do tempo necessário para degradar 10% do medicamento (t 90 ) em um específico condição, geralmente em 298 K, que é a temperatura de armazenamento padrão para produtos farmacêuticos. O t 90 é frequentemente interpretado como a vida útil de uma droga. Isso é calculado através de uma extrapolação da equação de Arrhenius, e o valor determina a vida útil do medicamento em 298 K ( Cides et al., 2006 ; Yoshida et al .,2010 , 2011).
As seguintes equações podem ser usadas para descrever a cinética observada de degradação em solução:
C = concentração (%); k = constante de taxa (s-1); Co = concentração inicial; t = tempo (s).
Equação de Arrhenius (1):
 (1)
onde: k = constante de taxa, Ea = energia de ativação, A = fator pré-exponencial, T = temperatura em Kelvin, R = constante de gás (8,314 J mol -1 K -1) .
O objetivo deste trabalho foi desenvolver e otimizar um método analítico de HPLC para determinação de fibratos e possíveis produtos de degradação, avaliar a estabilidade intrínseca desses medicamentos em condições de estresse e estudar a cinética de degradação desses fármacos tão suscetíveis a reações químicas.
MATERIAL E MÉTODOS
Desenvolvimento e otimização de uma metodologia analítica para determinação de HPLC
As análises foram realizadas usando uma HPLC (Waters (r)) equipada com um detector UV / DAD, um auto-injetor e um forno. A metodologia de separação foi baseada em cromatografia de fase reversa, usando uma coluna de octadecil silano (RP-18) com um comprimento de 30 cm para facilitar a separação de possíveis produtos de degradação e um detector UV / DAD para facilitar a identidade dos produtos de degradação, e revelar possíveis co-eluções.
Parâmetros de desempenho
Os parâmetros de desempenho (adequação do sistema) foram calculados de acordo com as fórmulas descritas pela Farmacopeia Brasileira (Brasil, 2010) para o fator de retenção ( k '), assimetria de pico (As), número de placas teóricas (N) e resolução (Rs).
Avaliação da estabilidade intrínseca
As condições iniciais utilizadas para avaliar a estabilidade intrínseca de bezafibrato, ciprofibrato e fenofibrato foram:
Calor seco: 20 mg de cada droga foram dissolvidos em metanol e submetidos a calor seco num forno a 323 K por 4 horas. Após este procedimento, as amostras foram diluídas em metanol até uma concentração de 0,01 mg mL -1 .
Hidrólise neutra: dissolveram-se 20 mg de cada droga em metanol. Foram adicionados 20 mL de água e a solução foi incubada num banho de água a 323 K durante 4 horas. Após este procedimento, as amostras foram diluídas em metanol até uma concentração de 0,01 mg mL -1 .
Hidrólise alcalina: dissolveram-se 20 mg de cada droga em metanol. Foram adicionados 20 mL de NaOH 0,1 M e a solução foi incubada num banho de água a 323 K durante 4 horas. Após este procedimento, as amostras foram diluídas em metanol até uma concentração de 0,01 mg mL -1 .
Hidrólise ácida: dissolveu-se 20 mg de cada droga em metanol. Foram adicionados 20 mL de HCl 0,1 M e a solução foi incubada num banho de água a 323 K durante 4 horas. Após este procedimento, as amostras foram diluídas em metanol até uma concentração de 0,01 mg mL -1 .
Oxidação: dissolveram-se 20 mg de cada droga em metanol. Foram adicionados 20 mL de peróxido de hidrogénio a 3% (v / v) e a solução foi incubada num banho de água a 323 K durante 4 horas. Após este procedimento, as amostras foram diluídas em metanol até uma concentração de 0,01 mg mL -1 .
Exposição à luz ultravioleta: 20 mg de cada droga foram dissolvidos em metanol e colocados numa câmara de radiação UV sob uma lâmpada de 254 nm por 4 horas. Após este procedimento, as amostras foram diluídas em metanol até uma concentração de 0,01 mg mL -1 .
Solução com iões metálicos (FeSO 4 ): dissolveram-se 20 mg de cada droga em metanol. Foram adicionados 20 mL de uma solução de FeSO4 0,05 M e a solução resultante foi incubada no banho de água a 323 K durante 4 horas. Após este procedimento, as amostras foram diluídas em metanol até uma concentração de fármaco de 0,01 mg mL -1 .
Depois de serem expostas às condições de estresse e sendo diluídas como descrito acima, as amostras foram analisadas por HPLC.
Estudos de cinética de degradação
Após os estudos de degradação, os fármacos foram submetidos a hidrólise ácida ou base em 323, 333, 343 ou 353 K, condições em que os fármacos foram submetidos a uma maior degradação. As amostras foram coletadas após 4, 5, 6 e 7 horas. A ordem das reações de degradação foi estabelecida de acordo com os modelos de zero, primeira e segunda ordem cinética.
Uma vez que cada resultado foi ajustado para o modelo de melhor ajuste (zero, primeira ou segunda ordem), foi possível calcular a taxa de degradação ( k ) para cada temperatura com o auxílio do coeficiente de correlação linear (r).
Uma vez que as taxas de degradação ( k ) foram calculadas a cada temperatura, tornou-se possível determinar, com a ajuda da equação de Arrhenius, k a 298 K e assim indicar quanto tempo o medicamento leva a degradar 10% (t 90 ). Esta é uma forma de determinar a data de validade de um medicamento ou medicamento, também chamado de t 90 , ou vida útil.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As condições cromatográficas foram otimizadas para análise dos fármacos bezafibrato, ciprofibrato e fenofibrato usando uma fase móvel consistindo em metanol e 0,01% de ácido fosfórico (80: 20% v / v); coluna de octadecil silano (250 x 4,6 mm; 5 μm); comprimentos de onda para bezafibrato (254 nm), ciprofibrato (236 nm), fenofibrato (290 nm); taxa de fluxo de 1,0 ml min -1 ; temperatura 303 K; volume de injeção de 20 μL e 20 minutos de análise de análise.
Após o método de análise de HPLC foi otimizado, os parâmetros de desempenho foram determinados para cada composto: bezafibrato (k '= 0,67; As = 1,41, N = 4299 placas / coluna), ciprofibrato (k' = 1,09; As = 1,35, N = 6052 placas / coluna; Rs = 3,95) e fenofibrato (k '= 3,51; As = 1,07, N = 13,258 placas / coluna; Rs = 17,77). Esses parâmetros de desempenho mostraram-se satisfatórios de acordo com os limites estabelecidos para cada parâmetro, que eram k '(fator de retenção)> 0,5, N (placas teóricas)> 2.000, T (fator de alinhamento) ≤ 2 e Rs (resolução)> 2 ( Ribani et al ., 2004 ).
Sob estas condições, os tempos de retenção diferiram para cada um dos compostos e foram 4,31 minutos para bezafibrato, 5,4 min para ciprofibrato e 11,6 min para fenofibrato. Os três medicamentos mostraram-se muito instáveis ​​e degradados em todas as condições utilizadas nos estudos de estabilidade intrínseca. A redução mais significativa na área de pico após a submissão às condições de estresse foi devido à hidrólise ácida e básica. À luz desses resultados para a estabilidade intrínseca, a cinética de degradação foi avaliada nas condições de hidrólise ácida e básica, inicialmente a temperaturas de 323 K, 333 K, 343 K e 353 K.
Para bezafibrato e ciprofibrato, estudos cinéticos de degradação de drogas durante a hidrólise ácida e básica não mostraram relação proporcional entre tempo e temperatura, e os estudos de degradação não foram reproduzíveis. Esses resultados demonstram a dificuldade em decifrar os produtos intermediários da cinética de degradação, e essa degradação era impossível de se adequar aos modelos cinéticos. Estudos anteriores de degradação sob análise térmica por TG (termogravimetria) também não foram reprodutíveis para o TG dinâmico determinado experimentalmente ou o TG isotérmico. Essa falta de reprodutibilidade de resultados ao submeter bezafibrato e ciprofibrato a condições de estresse indica uma complexidade em ambos os processos de degradação.
Não há relatos na literatura de possíveis mecanismos de degradação para bezafibrato e ciprofibrato. De acordo com as estruturas moleculares de cada droga, é possível compreender a complexidade dessas degradações. Para bezafibrato, podem ocorrer reacções possíveis em condições de estresse, tais como: o grupo éter pode sofrer quebras na cadeia quando sob hidrólise ácida; o grupo halogeneto aromático pode sofrer hidroxilação formando um fenol; e o grupo amida pode sofrer hidrólise, que é favorecida em meio básico ou ácido, resultando em álcool e ácido carboxílico. Para ciprofibrato, sob condições de estresse, o grupo éter pode romper-se na cadeia quando sob hidrólise ácida; o grupo halogeneto pode ser convertido no alceno sob hidrólise básica, onde tem uma solução alcoólica aquecida e uma base inorgânica; e grupo de halogenetos,
Para o fenofibrato, osestudos de degradação cinética mostraram uma diminuição significativa na área do pico após a hidrólise ácida e básica. Semelhante aos resultados para bezafibrato e ciprofibrato, em condições de hidrólise ácida, não foram observados resultados reprodutíveis e, portanto, não foi possível fazer ajustes matemáticos. Esta dificuldade de ajustar os dados cinéticos na hidrólise ácida pode estar relacionada a possíveis reações que podem ocorrer, tais como: o grupo cetona pode reagir reversivelmente com o metanol usado quando sob hidrólise ácida, formando "acetais"; o grupo éter pode sofrer rupturas na cadeia quando sob hidrólise ácida; o grupo éster pode sofrer hidrólise, que pode ser favorecida em meio ácido, resultando em um álcool e um ácido carboxílico; e até mesmo o grupo haleto aromático pode sofrer hidroxilação formando um fenol.
Para o fenofibrato, após a hidrólise básica, os resultados se encaixaram bem no modelo e foram reprodutíveis. A Figura 2 mostra os cromatogramas de estudos cinéticos de fenofibrato após hidrólise básica a diferentes temperaturas e tempos de exposição. O possível mecanismo de reação de degradação do fenofibrato parece estar relacionado à hidrólise do éster de agrupamento reacional característico. Este mecanismo foi descrito por Kumbharet al. (2013 ) e Salama et al. (2011 ), e em vista dos modelos de degradação do ajuste matemático, esse mecanismo parece ser a única forma de degradação da droga nesta condição de estresse.
FIGURA 2  Cromatogramas da solução de fenofibrato antes (padrão) e após 4, 5, 6 ou 7 horas de hidrólise básica a 323, 333, 343 ou 353 K. 
Os valores relacionados com o ajuste dos dados de degradação cinética de fenofibrato ao zero, primeiro e segundo modelos matemáticos na ordem 323, 333, 343 e 353 K são descritos na Tabela I .
TABELA I  Dados cinéticos para a degradação do fenofibrato sob hidrólise básica em 323, 333, 343 e 353 K 
	Temperatura (K)
	Parâmetro
	Ordem
	
	
	Zero
	Primeiro
	Segundo
	323
	abr
	-10.12976 96.91408 -0.97008
	-0,06461 1,98355 -0,97819
	0,00231 0,010441 0,98616
	333
	abr
	-10.45412 94.03265 -0.95643
	-0.07886 1.96967 -0.97922
	0.00357 0.01052 0.99558
	343
	abr
	-13.86424 90.43891 -0.94528
	-0.16557 1.96678 -0.99370
	0,01754 0,00065 0,95795
	353
	abr
	-14.74440 88.03679 -0.92663
	-0,25706 1,95949 -0,99007
	0,08259 -0,08093 0,80273
Os dados foram melhores para uma linha do tipo Y = a X + b, onde a é a inclinação, b é a intercepção y e r é o coeficiente de regressão linear.
A análise do coeficiente de regressão linear calculado (r) sugeriu que a cinética de degradação do fenofibrato em relação à temperatura é melhor descrita como uma reação de primeira ordem, de modo que a taxa de reação depende de um único fator, que pode ser um reagente ou produto envolvido na reação ( Brown et al ., 2005 ).
Após o fim da reacção foi determinada, as constantes de taxa de degradação foram calculadas para cada temperatura: k 323K = 0,148797926, k 333K = 0,181610946, k 343K = 0,381299703, e K 353K = 0,591997704. No entanto, também foi possível calcular k 298K, que foi de 0,031406672. Assim, t90 foi de 3,34 horas. Isto significa que após 3,34 horas em NaOH 0,1 M, ou pH equivalente, o fármaco degradou-se 10%.
A Figura 3 mostra o gráfico da função de log kx 1 / T da equação de Arrhenius. O declive da linha é definida pela equação E um (2303 × R) -1 , antes foi possível calcular a energia de activação, de modo a ser E um = 455,14 J mol -1 para a reacção de degradação de fenofibrato.
FIGURA 3  Gráfico de equação de Arrhenius extrapolado para 298 K para o fenofibrato de fármaco. As identifica seta k 298 K . 
Para o ciprofibrato, após a avaliação de possíveis produtos de degradação (DP) formados na reação, foi possível estudar a cinética de formação desses produtos de degradação formados após exposição à hidrólise ácida. Assim, os estudos cinéticos indicaram um ajuste matemático na cinética de formação de DP (tempo de retenção = 6,61 min) de ciprofibrato em meio ácido. A Figura 4 mostra cromatogramas do estudo cinético de ciprofibrato em hidrólise ácida, observando que os estudos cinéticos foram realizados para o produto de degradação formado em 6,61 min.
FIGURA 4  Cromatogramas da solução de ciprofibrato antes (padrão) e após 4, 5, 6 ou 7 horas sob hidrólise ácida a temperaturas de 323, 333, 343 e 353 K. 
Os valores relatados na Tabela II mostram os ajustes matemáticos dos modelos zero, primeira e segunda ordem de um produto de degradação de ciprofibrato a temperaturas de 323 K, 333 K, 343 K e 353 K. Pode ser observado a partir da Tabela II que o melhor ajuste é o modelo de primeira ordem, onde o coeficiente de correlação foi o mais próximo de 1.000, definindo assim a ordem da reação. As constantes de taxa foram calculadas para cada temperatura: k 323 K = 68644,24, k 333 K = 104592,10, k 343 K = 137831,45 e k 353 K = 235535,56. Usando o método gráfico de Equação de Arrhenius (Figura 6), foi possível calcular kem 298 K, que era 20812.63. A equação de Arrhenius foi utilizada para determinar a energia de ativação (E a ), E a = 370,88 J mol -1 para a forma do produto de degradação do ciprofibrato.
TABELA II  Dados cinéticos para degradação de ciprofibrato sob hidrólise ácida a 323, 333, 343 ou 353 K  
	Temperatura (K)
	Parâmetro
	Ordem
	
	
	Zero
	Primeiro
	Segundo
	323
	abr
	29806.44521 -3554.958904 0.97959
	0.10016 4.63585 0.92342
	-1.63613E-06 1.57726E-05 -0.91602
	333
	abr
	45415.58904 9593.80822 0.99340
	0,05794 5,09438 0,99350
	-5.17395E-07 6.75259E-06 -0.99265
	343
	abr
	59848.65385 41.63462 1.00000
	0,07978 5,06706 0,99744
	-5.78635E-07 6.38697E-06 -0.98889
	353
	abr
	102273.363 30729.60274 0.98866
	0,04994 5,50056 0,99517
	-1.95E-07 2.76459E-06 -0.99032
Os dados foram melhores para uma linha do tipo Y = a X + b, onde a é a inclinação, b é a intercepção y e r é o coeficiente de regressão linear.
FIGURA 5  Gráfico da equação de Arrhenius extrapolada para 298 K para um produto de degradação de ciprofibrato. As identifica seta k 298 K . 
CONCLUSÕES
O método de análise HPLC foi otimizado através da introdução de parâmetros de desempenho apropriados para os três medicamentos.
As três drogas revelaram-se extremamente instáveis ​​em meios líquidos, passando por reações em cada uma das condições de estresse testadas. A instabilidade mais significativa foi relacionada à hidrólise ácida e básica.
Não foi possível estudar a cinética da degradação de bezafibrato e ciprofibrato, uma vez que a degradação desses fármacos não apresenta proporcionalidade entre o tempo e a temperatura e, portanto, não pode ser ajustável aos modelos cinéticos. No entanto, foi possível estudar a cinética da formação de um produto de degradação de ciprofibrato com um E a de 370,88 J mol -1.
Na avaliação da cinética de degradação da hidrólise básicas fenofibrato, a reacção mostrou-se primeira ordem com pelo 90 valor de 3,34 horas. Essas análises demonstram a instabilidade do fármaco quando exposto a NaOH 0,1 M ou a um pH equivalente.
A ausência de formas de dosagem líquidas para fibratos no mercado pode ser entendida dada a instabilidade das drogas como mostramos por estudos de degradação e cinética.
AGRADECIMENTOS
O apoio financeiro para esta pesquisa foi fornecido pela FAPES (Fundação para o apoio à pesquisa do Espírito Santo) e CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Tecnológico e Científico).