Estudo dirigido citologia- QUESTIONÁRIO RESPONDIDO

Prévia do material em texto

Estudo dirigido – Composição química
Cite e explique as principais forças intermoleculares que estão envolvidas na formação das estruturas e das interações celulares.
Força dipolo-induzido: acontece em moléculas apolares sendo causada pelo acúmulo de elétrons em determinada região da molécula, a partir de um choque com outra molécula apolar(essa interação dura por muito pouco tempo). Não ocorre o tempo todo, a distribuição de elétrons na eletrosfera dessas moléculas é uniforme.
Forças dipolo-dipolo: força intermolecular presente em compostos polares.
 Ligações de hidrogênio: essa é a interação mais forte que ocorre entre moléculas, é comparada à força dipolo-dipolo bem mais intensificada. Esta ligação ocorre entre moléculas que contêm átomos de hidrogênio ligados a átomos de nitrogênio, flúor, oxigênio, ou seja, elementos muito eletronegativos, por isso os pólos δ + e δ- ficam mais acentuados.
Explique o que são proteínas, lipídeos, nucleotídeos e açúcares citando suas estruturas gerais e algumas de suas funções na célula.
Proteínas : são formadas a partir da união de muitos aminoácidos. Elas possuem diversas funções nos mais diversos organismos. A partir disso, pode-se notar que as proteínas não são somente as mais abundantes macromoléculas, mas também, são muito importantes para a vida.  As milhares de enzimas que um organismo possui são todas proteínas com funções importantes. As informações genéticas, por exemplo, são expressas através de proteínas.  Uma proteína tem função de defesa (anticorpos, veneno de serpentes), outra, função de reserva ( ovoalbumina, encontrada no ovo, caseína, encontrada no leite) e outras, a função estrutural (queratina, colágeno). 
 Lipídios: também chamados de gorduras, são biomoléculas orgânicas compostas, principalmente, por moléculas de hidrogênio, oxigênio, carbono. Fazem parte ainda da composição dos lipídios outros elementos como, por exemplo, o fósforo. Servem para fornecimento de energia para as células (porém, estas preferem utilizar primeiramente a energia fornecida pelos carboidratos).  Alguns tipos de lipídios participam da composição das membranas celulares. Nos animais endodérmicos, atuam como isolantes térmicos. Têm como funções essenciais a energética, estrutural e reserva.
 Nucleotídeo: é um conjunto formado pela associação de 3 moléculas – uma base nitrogenada, um grupamento fosfato e um glicídio do grupo das pentoses. Na formação da estrutura do DNA, temos as bases nitrogenadas Adenina, Guanina, Timina e Citosina, e na composição do RNA temos a Adenina, Guanina, Uracila e Citosina. Auxiliam nos processos metabólicos, especialmente as biossínteses, em grande parte das células. Atuam também como sinais químicos, respondendo assim a hormônios e outros estímulos extracelulares. Além disso, são também componentes estruturais de co-fatores enzimáticos, intermediários metabólicos e ácidos nucléicos.
Carboidratos /Glicídios/ hidratos de carbono/ açúcares : Os glicídios são compostos orgânicos à base de hidrogênio, oxigênio e carbono que tem como finalidade disponibilizar energia, são responsáveis pela rigidez dos tecidos, são concebidos pelas células vegetais através da quimiossíntese e da fotossíntese. Podem ser classificados em três tipos: monossacarídeos (como a glicose, a frutose ou a ribose), oligossacarídeos (quando hidrolisados podem fornecer oses) e polissacarídeos (celulose, amido ou glicose). As suas principais funções são: energética, estrutural e de reserva. Função Energética: constituem a primeira e principal substância a ser convertida em energia calorífica nas células, sob a forma de ATP. Nas plantas, o carboidrato é armazenado como amido nos amiloplastos; nos animais, é armazenado no fígado e nos músculos como glicogênio. Participam também da formação de estruturas de células e de ácidos nucleicos.
Por que as estruturas das moléculas orgânicas são importantes nas funções que elas desempenham?
Dependendo da estrutura da proteína ela pode ter um tipo diferente de função, já que isso afeta diretamente. As proteínas se dividem em 4 estruturas: primária, secundária, terciária, e quartenária. Cada estrutura possui suas próprias características espaciais e no formato correspondendo a uma proteína diferente, por exemplo a queratina do cabelo é uma proteína secundária em formato A-hélice, já a Mioglobina possui estrutura terciária, sendo que as interações hidrofóbicas nesse caso são essenciais para a função dela.
Estudo dirigido – Cultura de células
Explique o que é cultura de células primárias e de linhagem contínua, citando as vantagens e desvantagens de cada um desses tipos de cultura.
Cultura de células primárias: preparadas diretamente a partir dos tecidos/sangue de um organismo. A vantagem é que não exige o esforço para manter a cultura já que a maioria morre depois de algumas gerações, a desvantagem é que elas possuem um tempo de vida muito curto, e seu uso precisa ser imediato.
Cultura de linhagem contínua: cultiva-se a cultura de células primárias que sobreviveram por no mínimo 1 ano, até se obter essa linhagem contínua. A vantagem é que se obtém experimentos homogêneos, que podem ser repetidos na mesma cultura- PADRONIZAÇÃO-. A desvantagem é que demora muito para se atingir esse ponto da cultura, o que demanda muito cuidado. 
Diferencie meios definidos de meios complexos e explique as vantagens e desvantagens de cada um desses tipos de meio de cultura.
O meio onde é inserida a cultura de células pode ser:
 definido (a composição química de todos elementos contidos é precisa e conhecida, e é certo que pode-se obter uma linhagem contínua) são muito úteis para estudos de fisiologia descritiva, além de serem usados no preparo de vacinas.
complexo ( são quimicamente indefinidos , geralmente tendem a desordem,  podem conter extratos moídos ou digeridos de animais, peixes, leveduras e vegetais, que fornecem os nutrientes, as vitaminas e os minerais necessários). Uma grande vantagem deste meio é que podem estimular esporulações que não ocorrem em meio mínimo, e sua principal desvantagem é que sua composição pode diferir de lote para lote.
Explique detalhadamente os 4 principais fatores físicos em cultura de células.
Temperatura: há temperaturas mínimas, ótimas e máximas para o crescimento das culturas. No geral a temp. ótima da maioria das células é de 37°C, pois é temperatura de alto rendimento das enzimas celulares. 
pH: possui faixas mínimas, ótimas e máximas. Sendo o pH menos que o mínimo ou maior que o máximo, ocorre a perda das funções das enzimas e a célula morre (independente do pH externo as células tendem a deixar seu interior neutro).
Atmosfera gasosa: As células precisam de concentrações diferentes de cada gás para sobreviverem. Dessa forma em relação ao oxigênio elas podem ser classificadas em aeróbios (precisam de O2 ou morrem), microaerófilos (precisam de pouco O2, e podem morrer com mais que isso), facultativos (crescem com ou sem O2, mas seu rendimento é maior com a presença dele), anaeróbios (não usam O2 DE MANEIRA ALGUMA, e podem morrer na presença dele). 
Pressão osmótica: a pressão osmótica da solução precisa ser controlada de maneira que não fique hipertônica (muito concentrada, acarretando saída de água da célula), nem hipotônica (pouco concentrada em relação a célula, acarretando entrada excessiva de água na célula o que pode romper a membrana plasmática técnica do fracionamento celular). A solução precisa ser isotônica dentro e fora da célula.
Explique as 4 fases da curva de crescimento de uma cultura de células convencionais, quando não há troca do meio de cultura.
Fase lag: Fase latente em que não ocorre replicação imediata, ocorre síntese do DNA e produção de enzimas necessárias para próxima divisão.
Fase log: Fase em que começa a divisão celular causando crescimento exponencial. É o período de maior atividade metabólica das células, momento perfeito para estudos.
Fase estacionária: período em que a taxa de morte celular se iguala ao surgimento de novas células (equilíbrio), e ocrescimento exponencial para. A atividade metabólica diminui consideravelmente, devido a alterações no meio ou o término de nutrientes.
Declínio: a taxa de morte celular aumenta bastante, e continua até que a população toda morra. 
células mortas  células novas
Estudo dirigido – Fracionamento celular
Explique as principais maneiras de se quebrar à membrana de uma célula para realizar a homogeneização dos extratos celulares .
Choque osmótico: deixa a solução hipotônica para romper membrana, porém é insuficiente para romper a célula integralmente, mas pode propiciar permeabilização seletiva. Esse tipo de rompimento é indicado para bactérias Gram-negativas.
Vibração ultrassônica: é o método mais utilizado em escala de laboratório e ocorre quando ondas sonoras, com freqüência da ordem de 20 kHz, são convertidas em vibrações em um meio líquido e causam o fenômeno de cavitação( formação de cavidades -bolhas de vapor ou de gás- num líquido por efeito de uma redução da pressão total ). Essas vibrações formam bolhas muito pequenas que entram em colapso que geram ondas de choque que circulam pelo meio líquido e resultam em impacto e aumento da tensão de cisalhamento (forças aplicadas em sentidos opostos, e direções iguais), com conseqüente rompimento celular. O uso do ultra-som para o rompimento em larga escala é inviável, pois é necessário utilizar grande quantidade de sondas dispostas em serie e instalar um eficiente sistema de refrigeração.
Homogeneizador a alta pressão: é o método mais utilizado para a quebra celular e é adaptado das indústrias de laticínios. O homogeneizador é constituído por pistões projetados para aplicar altas pressões, forçando a passagem da suspensão celular por um orifício estreito seguido de colisão contra uma superfície rígida e imóvel em uma câmara à pressão atmosférica, ou colisão contra um segundo fluxo sob pressão elevada. A redução instantânea da pressão associada ao impacto provoca o rompimento celular sem danificar biomoléculas. O rompimento das células ocorre de acordo com fatores que atuam simultaneamente sobre as células, como cavitação, turbulência e cisalhamento.
Diferencie centrifugação zonal de centrifugação isopícnica.
centrifugação zonal/ por velocidade de sedimentação: permite a separação de partículas com diferenças de velocidade de sedimentação relativamente pequenas. A amostra contendo as partículas a separar (organelas ou macro moléculas de grandes dimensões) é aplicada no topo de um gradiente de densidade contínua que contém uma alta concentração de sal, resultante da deposição em camadas distintas de soluções com densidades decrescentes. A separação das partículas deve ser efetuada antes da sedimentação completa. O tempo de centrifugação deverá ser o suficiente para que as partículas caminhem ao longo do gradiente, formando zonas ou bandas. A migração de cada componente, segundo uma ou banda, a uma velocidade própria depende: da força centrífuga, da dimensão e forma da partícula, da densidade e viscosidade do meio – suporte.
centrifugação isopícnica/ sedimentação por equilíbrio: permite a separação de partículas com base na sua diferença de densidade e não da sua forma ou tamanho e é independente do tempo, ou seja, uma vez a partícula atingindo a sua zona isopícnica, mesmo que se prolongue a centrifugação, a partícula não sai dessa zona. Cada partícula sedimenta na posição em que o sua densidade é equivalente a densidade da solução. A força centrífuga faz com que as partículas se movam ao longo do tubo em direção ao fundo, mas estas ao entrarem numa zona do gradiente mais densa voltam à sua posição anterior. O que for mais denso estará mais no fundo, geralmente é o próprio gradiente escolhido.
Explique as principais formas de cromatografia.
PARTIÇÃO  FASE ESTACIONÁRIA= LÍQUIDA
Cromatografia de papel: Esta técnica é assim chamada porque utiliza para a separação e identificação das substâncias ou componentes da mistura a migração diferencial sobre a superfície de um papel de filtro de qualidade especial (fase estacionária). A fase móvel pode ser um solvente puro ou uma mistura de solventes. Este método é muito útil para separar substâncias muito polares, como açúcares e aminoácidos. Possui o inconveniente de poder-se cromatografar poucas quantidades de substância de cada vez.
Cromatografia de camada fina: Ela é usada para determinar a pureza do composto, identificar componentes em uma mistura comparando-os com padrões; acompanhar o curso de uma reação pelo aparecimento dos produtos e desaparecimento dos reagentes e ainda para isolar componentes puros de uma mistura. Na cromatografia de camada delgada a fase líquida ascende por uma camada fina do adsorvente estendida sobre um suporte. O suporte mais típico é uma placa de vidro (outros materiais podem ser usados). Sobre a placa espalha-se uma camada fina de adsorvente suspenso em água (ou outro solvente) e deixa-se secar. A placa coberta e seca chama-se "placa de camada fina". Quando a placa de camada fina é colocada verticalmente em um recipiente fechado (cuba cromatográfica) que contém uma pequena quantidade de solvente, este eluirá pela camada do adsorvente por ação capilar.  Como na cromatografia de coluna, as substâncias menos polares avançam mais rapidamente que as substâncias mais polares. Esta diferença na velocidade resultará em uma separação dos componentes da amostra. Quando estiverem presentes várias substâncias, cada uma se comportará segundo suas propriedades de solubilidade e adsorção, dependendo dos grupos funcionais presentes na sua estrutura.
COLUNA  A cromatografia em coluna costuma ser citada como o mais antigo procedimento cromatográfico. Foi utilizada primeiramente para o isolamento dos pigmentos existentes nas folhas verdes dos vegetais.Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plástico, preenchida com um adsorvente adequado (celulose por exemplo), na próxima etapa coloca-se a amostra que se quer separar, e depois põe lenta e continuamente um solvente no topo dessa mistura (ele vai servir para “empurrar” essa mistura para baixo). Os diferentes componentes da mistura vão descer em velocidades diferentes, então é só coletar.
Cromatografia de troca iônica: matriz insolúvel e ionizado 
As diferentes afinidades são a base da separação por troca iônica. Quando analitos com diferentes afinidades daquela das resinas dos trocadores iônicos são injetadas dentro de uma coluna de troca iônica, aquelas com maior afinidade com as cargas fixadas migrarão através da coluna mais lentamente. A retenção é reduzida aumentando a concentração dos íons competidores na fase móvel. A retenção e a seletividade da separação podem ser influenciadas pelo tipo de íon competidor e sua carga, e/ou pela mudança de carga dos íons do analito, or exemplo, por uma alteração do pH ou uma complexação. A troca iônica pode ser aplicada para a separação de íons orgânicos e inorgânicos, e também de biomoléculas como aminoácidos, peptídeos, proteínas, ou ácidos nucleicos.
Cromatografia de filtração em gel: matriz inerte e porosa.
 É um importante método para realizarmos purificação e análise de macromoléculas, podendo determinar a massa molecular e a forma das mesmas. Nesta cromatografia as moléculas maiores tendem a migrar mais rapidamente que as menores, pois elas não conseguem penetrar no interior dos poros da resina, sendo assim desce diretamente pela coluna. Já as menores moléculas levam mais tempo para ser descer, pois percorrem o interior dos poros. Outra característica, que deve ser considerada neste método é que nela ocorre a diluição da amostra, pois requer um fluxo constante de solvente. Contudo, esta técnica possui características importantes na purificação e determinação de massa molecular, como já enunciado anteriormente, alem de ser um método rápido de dessalinização de soluções.
 Cromatografia de afinidade: matriz inerte e porosa
Uma característica importante de muitas proteínas é a sua capacidade de se ligar a moléculas específicas de uma forma não covalente. Esta propriedade podeser usada na purificação de proteínas através da cromatografia de afinidade. Nesta técnica, a molécula, conhecida como o ligando, que se liga especificamente à proteína de interesse, está covalentemente ligada a uma matriz inerte e porosa. Quando uma mistura passa através deste material cromatográfico, a proteína de interesse liga-se ao ligando imobilizado, enquanto outras substâncias são eluídas ao longo da coluna com o tampão. A proteína-alvo pode assim ser recolhida numa forma altamente purificada a partir da alteração das condições de eluição até que a proteína seja libertada da matriz cromatográfica. A grande vantagem da cromatografia de afinidade é a sua capacidade de explorar as propriedades únicas das proteínas ao invés de pequenas diferenças nas propriedades físico-químicas entre as proteínas. A matriz da cromatografia de afinidade tem que ser quimicamente inerte, ter alta porosidade e possuir um grande número de grupos funcionais capazes de formar ligação covalentes com o ligando. Um dos poucos materiais disponíveis que segue estes critérios é a agarose. Tem sido utilizada na purificação de substâncias, como enzimas, anticorpos, proteínas transportadoras, receptores de hormônios, membranas e até células. ALTA PURIFICAÇÃO ALCANÇADA EM 1 ETAPA!
Explique a técnica HPLC.
A existência de duas fases (estacionária e móvel) permite esta separação uma vez que uma maior afinidade de um composto à fase estacionária permite que a sua eluição pela fase móvel seja mais lenta. Na técnica, coloca-se um pequeno volume de uma amostra líquida numa coluna cromatográfica com partículas porosas (fase estacionária). Então um reagente é dispensado na coluna, fazendo com que os componentes da mistura desloquem-se através da coluna. As substâncias com maior afinidade pelo reagente (solvente) movem-se mais lentamente; já as com menor afinidade movem-se mais rapidamente. Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma.
Explique detalhadamente como ocorre a eletroforese em gel de proteínas e ácidos nucléicos.
O processo de eletroforese de proteínas e ácidos nucléicos são iguais, a única diferença é o meio. Os suportes para eletroforese comumente empregados são os géis de poliacrilamida para proteínas e agarose para os ácidos nucléicos, em virtude de estes polímeros funcionarem como uma peneira molecular, ou seja, separar as espécies em função de sua massa e tamanho molecular, respectivamente, inibe a propagação do calor em virtude do atrito causado pela migração e pela aplicação do campo elétrico.
Os géis de poliacrilamida são comumente utilizados na separação de proteínas em virtude de ser quimicamente inertes, facilidade de coloração com nitrato de prata e corante azul de Coomassie(corantes como esses coram totalmente a agarose impossibilitando a identificação das espécies no eletroforetograma), os poros são facilemente ajustáveis através do controle de acrilamida e bis-acrilamida que são os polímeros que formam o gel.
As macromoléculas são colocadas em uma solução chamada tampão de amostra contendo SDS, Azul de Bromo-fenol e DTT(rompe ligações nativas da proteína);
A solução tampão de amostra contendo as proteínas é aquecida a 90ºC de 5 a 10 minutos;
Após o aquecimento das proteínas são desnaturadas, suas ligações dissulfeto são quebradas, e o SDS agrega-se ao redor das proteínas proporcionando uma carga líquida negativa.
 A amostra contendo as macromoléculas devidamente desnaturadas e reduzidas  é distribuída ao nos poços ou cavidades do gel de suporte;
Após a distribuição o equipamento é fechado e o campo elétrico é aplicado no gel, através de um dispositivo diferencial de energia elétrica e as macromoléculas vão sendo distribuídas pela extensão do gel e são separadas em função de sua massa e tamanho molecular que são os principais fatores que determinam a mobilidade eletroforética.
No topo do gel existe uma mistura de macromoléculas de variados tamanhos e massas moleculares de modo que quando o campo elétrico é aplicado as moléculas menores migram primeiro, pela malha formada pelo gel. Ao passo que durante a distribuição o gel funciona como uma peneira molecular e as moléculas com massa molecular mais elevada vão sendo retidas ao longo  do processo pelas malhas gel o que permite que as macromoléculas sejam analisadas pela sua massa molecular.
No final do processo quando todas as macromoléculas estão distribuídas o gel é mergulhado em uma solução corante.
Para proteínas são usadas solução de nitrato de prata que detecta proteínas mesmo que a concentração seja muito baixa. Ou o gel é mergulhado em uma solução ácida e alcoólica de corante azul de coomassie. Um período de tempo é aguardo e em seguida observa-se o eletroforetograma que nada mais é do que o gel corado. Para analise de ácidos nucléicos (DNA e RNA) são usados corantes como brometo de etidio, laranja de acridina e profalvina que são corantes com estrutura aromática, quando sob a luz utravioleta apresentam fluorescência.
 
Explique o que é espectrometria de massa e suas principais utilidades.
Espectrometria de massa para identificação de proteínas e seqüência de peptídeos, determinando a sua massa precisa.
as proteínas a serem analisadas devem ser primeiramente isoladas ou extraídas de lisados celulares ou tecidos. 
Após a etapa de purificação, o próximo passo é converter a(s) proteína(s) isolada(s) em um conjunto de peptídeos. Isso é feito com o uso de enzimas que promovem a clivagem das proteínas em pontos específicos.(TRIPSINA)
Os fragmentos polipeptídicos são inseridos no espectrômetro de massa e as suas massas são medidas (Esse tratamento gera peptídeos de vários tamanhos diferindo um do outro por apenas um aminoácido).
A diferença da massa entre dois peptídeos muito parecidos pode ser deduzida indicando os aminoácidos diferentes.
Pela repetição desse procedimento, uma seqüência de aminoácidos parcial da seqüência original pode ser determinada
Ao final do processo, os resultados inerentes a massa molecular (MM) dos peptídeos, obtida a partir do PMF, bem como a informação relativa a seqüência de aminoácidos dos peptídeos, contida nos espectros de fragmentação (MS/MS), são usados pelos softwares de busca para "localizar" as proteínas nos bancos de dados.
Aplicações: indústria farmacêutica, teste de drogas, análise de hemoglobina,  na ecologia, toxicologia, geologia, biotecnologia
Estudo dirigido – Microscopia de luz
Explique como funciona, em detalhes, um microscópico óptico comum.
A luz, que incide sobre um condensador, atravessa o objeto e é encaminhada para o canhão de lentes convergentes, formado pela objetiva e a ocular.  Quando o feixe luminoso atinge a lente objetiva, forma-se uma imagem intermediária e aumentada do objeto. A lente ocular, por fim, funciona como uma lupa que amplia e produz a imagem final do espécime observado.
A capacidade de resolução da imagem formada vai depender da qualidade das lentes e do comprimento de onda do feixe de luz. Nos microscópios ópticos, este comprimento varia de 400 a 700 nanômetros, o que possibilita a observação de espécimes maiores que uma bactéria.
Explique detalhadamente como preparar uma amostra para o microscópio óptico comum.
FIXAÇÃO: Deixa a amostra estabilizada preservando o material, e torna as células permeáveis aos corantes. Os principais fixadores são formol, e gluteraldeído. Após a sua remoção do organismo, os tecidos devem ser fixados o mais rapidamente possível, para evitar a digestão dos tecidos por enzimas presentes no interior das células (autólise) ou por bactérias (putrefacção), preservando assim a sua estrutura e a composição molecular.
DESIDRATAÇÃO: toda a água da amostra é substituída por álcool ou cetona, através de sucessivos banhos de um agente desidratante
INCLUSÃO: a amostra precisa estar em um meio de suporte antes da secção, comumente é usado para isso parafina ou cera de resinas plásticas. Essa resina é endurecida por resfriamento ou polimerização, formandoum bloco.
MICROTOMIA: Depois da inclusão a amostra está pronta para ser seccionada pelo micrótomo, as secções são de geralmente 1 a 10 mM de espessura. 
COLORAÇÃO: (a escolha depende do que atrair a célula)
•Corantes básicos- Azul de toluidina, Azul de metileno, Hematoxilina = coloração de substâncias basófilas (DNA, RNA, licoproteínas ácidas) 
•Corantes ácidos- Eosina, Orange G, Fucsina = coloração de substâncias acidófilas (proteínas
básicas citoplasmáticas)
Explique como é formada a imagem nos microscópios:
- de fluorescência células vivas ou mortas
 A luz utilizada na iluminação é muito potente, e passa primeiramente por um filtro de barreira que só deixa passar a luz que tem um comprimento de onda que excita determinado corante fluorescente. Essa luz reflete em um espelho que reflete na amostra , isso volta de novo pelo espelho (transmite luz com ondas maiores a que reflete ) . Depois essa luz irá passar por um segundo filtro de barreira que bloqueia sinais florescentes indesejáveis. Parte da amostra absorveu a excitação primária e reemitiu uma luz com maior comprimento de onda, isso é o princípio da fluorescência. O microscópio de fluorescência usa a capacidade de algumas moléculas em fluorescer sob luz ultravioleta, visualizando moléculas autofluorescentes, como a vitamina A, ou ainda marcando as amostras, com a fluorescência introduzida. A excitação e a emissão de luz das moléculas fluorescentes são reguladas por filtros para promover cor e contraste.
Aplicação: detecção de antígenos ou anticorpos nos procedimentos de coloração imunocitoquímicos, moléculas fluorescentes específicas também podem ser injetadas em um animal ou diretamente em células, e usadas como rastreadores. Tais métodos são úteis para estudar as junções intercelulares (gap), rastrear a via de fibras nervosas na neurobiologia e detectar marcadores de crescimento em tecidos mineralizados.
- de contraste de faseamostras vivas e não coradas
A luz atravessa diferentes quantidades de matéria, o que gera diferentes índices de refração, ou em outros termos, quanto maior a quantidade de matéria, menor o índice de refração. Porções escuras da imagem correspondem a porções densas do espécime, porções claras da imagem correspondem a porções menos densas do espécime.
Aplicação: possibilita o exame de células e tecidos não corados e é muito usado para análise de células vivas (geralmente em cultura), microrganismos, seções de tecidos finos, fibras, dispersões de látex, partículas subcelulares (incluindo o núcleo e outras organelas), diagnóstico de células tumorais, hematologia, virologia, bacteriologia, parasitologia e biologia marinha.
- confocal amostra viva , forma imagem 3D e 2D
O laser emite um feixe de luz que irá incidir, em primeiro lugar, na objetiva e, de seguida, no espelho dicróico, que reflete a luz para uma segunda objetiva. Esta converge a luz para um único ponto na amostra. A luz fluorescente emitida pela amostra é, então, captada pela segunda objetiva e passa através do espelho dicróico, enquanto que a luz do feixe é refletida. Posteriormente, a luz fluorescente da amostra é convergida por uma terceira objetiva de modo a ser captada pelo fotomultiplicador. Antes desta ser detectada pelo mesmo, é parcialmente obstruída de forma que apenas a luz proveniente do ponto focal seja captada. O fotomultiplicador transforma, então, o sinal luminoso em sinal elétrico, que será gravado por um computador. O microscópio digitaliza a amostra sequencialmente, ponto por ponto e linha por linha, e converge os pixéis numa imagem. Deste modo, secções ópticas da amostra são imagens com grande contraste e resolução nos eixos X, Y, Z, ou seja, são tridimensionais.
Aplicação: estudo do movimento viral.
- de campo escuro não corado
Apenas a luz que foi dispersa ou refratada pelas estruturas na amostra alcançam a lente.  É o mesmo princípio que nos permite ver as estrelas a noite ou as partículas de pó no feixe de luz em um projetor numa sala escura. Para conseguir seu objetivo, a técnica de microscopia de campo escuro faz uso de um tipo especial de condensador, capaz de fazer com que somente os raios luminosos que atingirem um objeto na lâmina entrem na objetiva. Antes do condensador há um disco opaco, que só permite a passagem de uma pequena fração de luz para o condensador.
Aplicação:  A microscopia de campo escuro é útil quando precisamos analisar células, componentes ou microrganismos não corados. 
Quais os tipos de microscopia permitem observar células vivas?
Microscopia de constraste de fase, microscopia confocal. 
Estudo dirigido – Citoquímica
Explique como funcionam os diferentes tipos de corante e cite os alvos de cada corante.
CORANTE ÁCIDO ANIÔNICOS (interação iônica)
Liga-se a um substrato que está carregado positivamente (+). Destacam-se o grupo Ponceau (alvo: proteínas), e Fast Green (alvo : proteínas) 
CORANTE BÁSICO CATIÔNICOS (interação iônica)
Liga-se a um substrato que está carregado negativamente (-). Destacam-se o Azul de Toluidina (alvo: parede celular), e a Hematoxilina (alvo: núcleo). 
CORANTE- LIGAÇÃO COVALENTE:
Utilizam ligações covalentes com seus substratos para que possam detectá-los, como é o caso da Reação de Feulgen (alvo: DNA), e as PAS lectinas (alvo: polissacarídeos)
CORANTE- INTERAÇÃO HIDROFÓBICA:
Tanto o alvo quanto o corante tem afinidade por serem hidrofóbicos, como é o caso do Sudan (alvo: lipídios) 
Explique como ocorre a detecção de enzimas in situ.
Cria-se um ambiente favorável a partir da incubação do substrato, então ajusta-se o pH e a temperatura que corresponde a atividade padrão dessa enzima. A enzima é detectada porque o substrato escolhido muda de cor assim que se liga a essa enzima. 
Explique a técnica de imunocitoquímica.
Os antígenos são detectados através de anticorpos específicos marcados com indicadores (enzimas- visíveis por microscópio de luz, fluorocromos- visíveis por microscópio de fluorescência, ou colóides de ouro- visíveis por MEV) que se ligam ao antígeno revelando sua presença. Esses anticorpos podem ser primários (liga diretamente no antígeno) ou secundários (liga-se no anticorpo que está ligado ao antígeno).
Explique os princípios da hibridização in situ.
 É uma técnica pela qual se identificam sequências específicas de nucleotídeos em células ou cortes histológicos. Estas podem ser de DNA ou RNA, endógenas, bacterianas ou virais. Essa sequência complementar de nucleotídeos chamada de sonda, é marcada com um indicador e colocada no meio, se caso houver essa sequência presente elas se ligam. Sua aplicação na área de doenças infecciosas tem sido predominantemente a identificação de infecções virais.
Explique os princípios da técnica FISH.
 É um método que utiliza recursos moleculares para analisar os cromossomos na procura da presença ou ausência de determinada sequência de DNA, ou seja, é o mapeamento de um gene por uma sonda, marcada por fluorescência, num cromossomo espalhado em lâmina. A técnica de FISH envolve basicamente os seguintes passos: desnaturação da sonda específica de DNA e sua marcação com um fluorocromo, em que o método de marcação pode ser direto (a própria sonda marcada com o fluorocromo) ou indireto (a sonda é ligada a um anticorpo que por sua vez se liga a outro que transporta o fluorocromo), que tem a vantagem de amplificar o sinal de fluorescência.
 Hibridização da sonda com os cromossomos e observação dos cromossomas marcados em microscópio de fluorescência, com filtros adequados para o tipo de fluorocromo que se utiliza. Sob condições de temperatura e concentração salina altamente restringentes, a sonda hibrida unicamente com segmentos complementares de DNA e não com a imensa quantidade de segmentos de outras partes do genoma. Sob estas condições, as pontes que se formam entre sequências que não emparelham perfeitamente tornam-se instáveis, e as que se formam entra sequências que emparelham perfeitamente são estáveis.
  Estudo dirigido – Técnicas imunológicas
Explique o que sãoanticorpos/imunoglobinas e explique detalhadamente a estrutura e função dos principais tipos de anticorpos presentes no organismo.
IgM resposta primária do sistema imunológico. Constitui 10% dos anticorpos do plasma sanguíneo. Sua estrutura é na maioria das vezes em forma de pentâmero (5 moléculas). As 5 cadeias são ligadas entre si por pontes dissulfeto e por uma cadeia polipeptídica inferior chamada de cadeia J. A IgM é encontrada principalmente no intravascular, sendo uma classe de anticorpos "precoces" (são produzidas agudamente nas fases agudas iniciais das doenças que desencadeiam resposta humoral). É uma proteína que não atravessa a placenta (por ser grande). É encontrada também na superfície dos linfócitos B de forma monomérica, realizando a função de receptor de antígenos.
IgG resposta secundária do sistema imunológico. Constitui 75% dos anticorpos do plasma sanguínea, e a mais abundante. É a única que atravessa a placenta. Formada por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas, também idênticas ligadas por pontes de dissulfeto e forças não-covalentes. A região FC realiza ativação de complemento (quando unida ao antígeno) e auxilia a fagocitose por se ligar a macrófagos. Com a ativação do complemento, há geração de quimiotaxia de neutrófilos, aumento da permeabilidade vascular e amplificação da resposta inflamatória. 
Explique detalhadamente a técnica ELISA e suas variações.
Baseia-se em reações antígeno-anticorpo detectáveis por meio de reações enzimáticas. O teste de ELISA é responsável pela detecção de diferentes doenças infecciosas, uma vez que a maioria dos agentes patológicos leva à  produção de imunoglobulinas. Também pode ser utilizado no diagnóstico de doenças auto-imunes ou alergias. 
ELISA indireto, utilizado para detecção de anticorpos. Neste caso o antígeno fica aderido aos poços da microplaca. Em seguida coloca-se o soro problema e em seguida um anticorpo marcado com uma enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor. A presença de cor nos poços indica a presença do anticorpo, e os poços que não mudarem de cor indica a ausência do anticorpo em questão. Caso estejam presentes anticorpos no soro, específicos para o antígeno em questão, haverá a formação da ligação antígeno-anticorpo que, por conseguinte, é detectada pela adição de um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espécie que está sendo pesquisada, a qual é ligada a peroxidase. Este anticorpo anti-IgG, ligado à enzima recebe o nome de conjugado. Quando se adiciona o substrato apropriado para a enzima (ou seja, H2O2 dissolvida em uma substância química eu dá uma reação colorida quando H2O2 é desdobrada), os locais onde ocorre a reação antígeno-anticorpo, que apresentam uma coloração característica, sendo que esta coloração varia de acordo com o substrato. 
ELISA direto, parecido com o método indireto, com a diferença que o anticorpo que irá ligar no antígeno já está acoplado em uma enzima conjugada. A partir daí ocorre a interação enzima –substrato que gera mudança de cor.  
ELISA sanduíche (DAS-ELISA) é indicado para identificação de antígenos, e este antígeno fica entre dois anticorpos. Assim, um anticorpo primário específico ao antígeno é imobilizado em uma superfície sólida em um poço de uma placa de microtitulação. Em seguida o antígeno na solução problema é adicionado. O material não ligado é lavado, e o antígeno ligado é reconhecida mais uma vez em condições de ligação com a adição de uma solução de um segundo anticorpo específico para o mesmo antígeno, que desta vez está acoplado a uma enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor. A presença de cor nos poços indica a presença do antígeno, e os poços que não mudarem de cor indica a ausência do antígeno em questão. 
Explique detalhadamente a técnica de imunofluorescência.
É definida como uma técnica que possibilita a  visualização de antígeno nos tecidos ou em suspensões celulares, por meio da utilização de anticorpos específicos, marcados com fluorocromo, capazes de absorverem a luz ultra-violeta (UV), emitindo-a num determinado comprimento de onda, permitindo sua observação ao microscópio de fluorescência (com luz UV). Após os fluoróforos serem excitados por um determinado comprimento de onda, emitem fótons de luz fluorescentes a um comprimento de onda superior. 
Dentre os fluorocromos mais comumente utilizados estão: 
Fluresceína (FITC); 
Rodamina (TRICT). 
DIRETA 
 Fixação do esfregaço da lâmina; 
Tratamento com anticorpo marcado; 
Incubação; 
Lavagem para remover excesso de anticorpos marcados não ligados; 
Visualização no microscópio fluorescente. 
 
INDIRETA, Utiliza-se este tipo de imunofluorescência, também conhecida como técnica de dupla camada, na detecção de anticorpos no soro do paciente por meio de antígenos fixados em uma lâmina, na qual se aplica primeiramente um anticorpo específico não fluorescente. Por fim, coloca-se um anticorpo fluorescente com especificidade marcada contra determinados antígenos do primeiro anticorpo usado para reagir com o antígeno. 
Esta técnica tem como vantagem possibilitar uma fluorescência mais evidente, uma vez que os anticorpos fluorescentes associam-se somente aos anticorpos primários, além de permite trabalhar com diversos anticorpos primários específicos para distintos tipos de antígenos, sendo capaz de identificar qual a classe a qual o anticorpo pertence. 
Explique o que é immunogold labelling.
Uma técnica de coloração INSOLÚVEL utilizada na microscopia eletrônica, em que coloides de ouro são colocados em anticorpos secundários, os quais  serão anexados a anticorpos primários que estão ligados ao antígeno/proteína. O ouro é usado devido a sua alta densidade eletrônica , resultando em pontos escuros de alto contraste. Serve para localizar antígenos ou proteínas no microscópio. 
Explique detalhadamente como ocorre a imunocromatografia.
 Os testes dispensam o uso de reagente adicional ou equipamentos. São testes de triagem, portanto de elevada sensibilidade. Alguns deles, como a determinação da glicemia (glicosímetros), usam métodos enzimáticos químicos, e outros são imunológicos como para o teste de gravidez. 
O sistema é realizado em uma matriz constituída de membrana de nitrocelulose ou de náilon coberta por acetato transparente para facilitar a visualização do teste. O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana na forma de linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado com proteína inerte como nos testes imunoenzimáticos (ELISA). Para detecção de antígenos podem ser utilizados anticorpos fixados na linha de captura e como conjugado um segundo anticorpo conjugado ao corante. Um dos métodos imunológicos desses testes emprega corante insolúvel, como ouro coloidal (róseo) ou prata coloidal (azul marinho) como revelador da interação antígeno-anticorpo. 
A amostra aplicada se liga ao conjugado colorido e após a migração por cromatografia a formação do imunocomplexo é revelada pelo depósito do corante coloidal na linha de captura. 
Estudo dirigido – técnicas moleculares
Explique detalhadamente o processo de PCR.
PCR é o processo pelo qual uma determinada sequência de DNA pode ser clonada em um curto período de tempo. 
A fita de DNA a ser replicada é esquentada ate 95°C, temperatura em que as fitas se separam.
Adiciona DNA-polimerase(TAQ), nucleotídeos, primers.
Reduz a temperatura para 54°C, temperatura em que os primers se anelam.
Aumenta a temperatura para 72°C, temperatura ideal para funcionamento da TAQ polimerase, que começa a sintetizar a outra fita.
Esse ciclo é repetido inúmeras vezes, tendo resultado exponencial. 
Explique o que são bibliotecas genômicas.
É uma coleção de fragmentos de DNA de uma determinada espécie de organismo, obtidos a partir da ação de endonucleases/enzimas de restrição, ligados ao setores apropriados e clonados após terem sido inseridos num hospedeiro. É suposto que uma biblioteca seja representativa de todos os genes do organismo, sendo muitoútil quando se pretende isolar um gene específico. Assim, torna-se claro que quando se quer clonar um determinado gene ou o cDNA (DNA complementar) das mensagens por ele codificadas (mRNA) é necessário a construção de colecções de genes recombinantes. 
O estudo genómico de tantas espécies ao longo do tempo, levou à necessidade da construção de bibliotecas de DNA. Estas são colecções de fragmentos de DNA de um organismo, clonados em vectores, geralmente vírus ou plasmídeos, e armazenadas em células hospedeiras (E. coli). A denominação destas bibliotecas varia conforme a natureza do DNA, ‘biblioteca de DNA genómico’ ou ‘biblioteca de cDNA’. Em ambos os casos o DNA é bastante complexo surgindo a necessidade de produzir um número elevado de clones para assegurar que se obtém todas as partes do genoma.
Explique algumas técnicas de sequenciamento de DNA, citando as antigas e as modernas.
O sequenciamento do DNA é uma série de processos bioquímicos tem por finalidade determinar a ordem dos nucleotídeos (adenina, guanina, citosina e timina) em uma amostra de DNA. 
DEGRADAÇÃO DE BASES (Alam Maxam / Walter Gilbert – 1977) 
	
	Neste método a molécula inicial é clivada directamente. O primeiro passo consiste em marcar radioactivamente o DNA alvo, ou seja, a molécula a sequenciar. Para tal, são usados isótopos radioactivos, tais como 32P e 35S. De seguida, separam-se as duas cadeias de DNA. Distribui-se por 4 tubos, um para cada família. Em cada tubo irão ocorrer alterações químicas específicas para uma base (A, C, G ou T). As moléculas são clivadas. Por exemplo, no tubo em que o tratamento foi direccionado para a adenina, após a clivagem, a extremidade do fragmento de DNA marcada com o radioisótopo, apresentará uma base que corresponde à que precede a adenina.
O passo seguinte é idêntico ao método de Sanger. Cada família é separada em gel de electroforese e a sequência é lida a partir do próprio gel. Os fragmentos menores são clivados mais próximo da extremidade 5’ enquanto que os fragmentos maiores são clivados mais próximo da extremidade 3’.
DIDESOXI (Sanger - 1978) :
Moléculas de cadeia simples são o ponto de partida para a aplicação desta técnica.
É ligado um oligonucleótido curto a cada uma das moléculas. Este oligonucleótido actua como um primer na síntese de uma nova cadeia polinucleotídica. O alongamento da cadeia é catalisado pela DNA polimerase que requer como substrato, deoxinucleótidos trifosfatados livres: dATP, dGTP, dTTP e dGTP.
Para além destes é adicionado à reacção, um dideoxinucleótido (ddATP) para bloquear o crescimento da cadeia, limitando o seu comprimento. Este nucleótido modificado não apresenta o grupo hidroxil necessário para estabelecer a ligação com o nucleótido que lhe segue. Assim, a terminação da cadeia ocorre logo que este nucleótido é introduzido.
São feitas quatro reacções, uma para cada ddNTP. O resultado são quatro famílias distintas de novas cadeias polinucleotídicas. Uma cadeia termina com ddATP, outra com ddCTP, etc.
No passo seguinte, cada família é carregada num poço de um gel de electroforese.
A sequência da molécula de DNA original, pode então ser lida directamente a partir das bandas que surgem no gel.
Em primeiro lugar, localiza-se a banda que mais migrou. Esta banda representa o fragmento mais pequeno de DNA, ou seja, a cadeia que inseriu o dideoxinucleótido na primeira posição do molde.
De seguida, procura-se a banda que corresponde à molécula de DNA cujo comprimento é um nucleótido maior que a anterior. O procedimento repete-se até ao topo do gel.
PIROSEQUENCIAMENTO ROCHE 454:O pirosequenciamento é uma nova técnica da Biologia Molecular, na qual a síntese de DNA ocorre através de um complexo de reações que inclui enzimas (ATP sulfurilase e luciferase) e substratos (adenosina 5’ fosfossulfato e luciferina). O grupo pirofosfato, liberado durante a adição de um nucleotídeo, resulta na produção de luz detectável. Portanto, quando um novo nucleotídeo é incorporado em uma cadeia crescente de DNA através da DNA polimerase, pirofosfato é gerado de maneira estequiométrica, resultando na produção de ATP. O ATP produzido leva à conversão enzimática da luciferase com emissão de fótons. À medida que os componentes da reação diminuem, um novo ciclo de reagentes é introduzido e então a incorporação de nucleotídeos específicos é avaliada de maneira sequencial.A técnica baseia-se no sequenciamento e na síntese de DNA, fornecendo dados em minutos, assim como o mesmo conceito da reação de PCR Real Time, que é a obtenção de resultados rápidos.
ILLUMINA: baseia-se no conceito de “sequenciamento por síntese” o qual requer que as sequências a serem determinadas sejam convertidas numa biblioteca de sequenciamento especial, permitindo a amplificação e imobilização das sequências para serem submetidas à sequenciamento. Para este propósito, dois adaptadores diferentes são adicionados às terminações 5’ e 3’ de todas as moléculas. A biblioteca de cadeia dupla é desnaturada para obter DNAs de cadeia única. Estas cadeias simples são dispostas em concentrações muito baixas pelos canais de uma célula de fluxo. Esta “flow cell” possui na sua superfície dois tipos de oligonucleotídeos imobilizados complementares aos dois adaptadores, utilizados para produzir a biblioteca de sequenciamento. Estes oligonucleotídeos hibridizam com as moléculas das cadeias das bibliotecas. Por síntese reversa, começando pela zona hibridizada, a nova molécula que está sendo criada encontra-se covalentemente ligada à flow cell.Esta nova molécula dobra-se e liga-se a outro oligonucleotídeo complementar ao segundo adaptador que não está ligado à placa, podendo ser usado para sintetizar uma segunda cadeia ligada também covalentemente à placa. Este processo de dobra da molécula e de síntese reversa, chamada de amplificação em ponte, é repetida várias vezes e cria aglomerados de milhares de cópias da sequência original, muito próximos na célula de fluxo.Estes aglomerados distribuídos aleatoriamente contêm cópias idênticas da mesma sequência. Deste modo as bibliotecas estão prontas para serem sequenciadas.
Explique detalhadamente como ocorre o Southern Blot, Northern Blot e Western Blot.
Southern blot- (DNA)  é uma técnica de biologia molecular utilizada para conferir se uma determinada sequência de DNA encontra-se ou não presente em uma amostra de DNA analisada. Isto é realizado por meio de um realce da eletroforese em gel de agarose. Nos permite obter informação sobre a massa molecular e a quantidade relativa de uma determinada sequência de DNA obtida por imagem através da autoradiografia ou autofluorescência. 
Northern Blot- (RNA) estuda o perfil de expressão de mRNA (ácido ribonucleico mensageiro). Analisa a localização, o momento exato e a quantidade de mRNA esta presente em determinada amostra. É a forma mais simples de determinar quando um gene está presente em um sistema vivo. Assim como o DNA, o RNA também é separado pela técnica de Southern Blot. Uma diferença entre ambas as técnicas, é a adição de formaldeído no gel de agarose (funciona como desnaturante) na técnica em questão. Da mesma forma como no Southern Blot, a sonda hibridizadora pode ser feita tanto de DNA quanto de RNA. 
Western Blot (PROTEÍNAS) usa basicamente os principios das técnicas de Southern Blot e Northern Blot, mas é aplicado a proteínas e sua separação usando a eletroforege em gel obrigatóriamente precisa de gel de poliacrilamida na presença de dodecilo sulfato de sódio (SDS), um tipo de detergente. 
O que significa tecnologia do DNA recombinante? Comente as principais aplicações.
Os pesquisadores querem estudar um gene humano que produz uma proteína que não se sabe a função.
Os pesquisadores “recortam” (utilizando enzimas de restrição), do DNA humano, o gene de interesse.
Esse fragmento de DNA contendo o gene é multiplicado por PCR para obtermos várias cópias do mesmo fragmento (ou da mesma informação).
A mesma enzima que clivou o gene do DNA humano é utilizada para clivar o plasmídio bacteriano.Lembre-se que o fragmento de DNA, ao ser clivado, gera pontas adesivas que são complementares ao plasmídio se este for clivado com a mesma enzima.
A seguir o plasmídio clivado é misturado com os fragmentos de DNA (contendo o gene) e uma enzima chamada ligase “cola” os fragmentos ao plasmídio, produzindo o chamado DNA recombinante. Isso feito, o DNA recombinante é introduzido em uma bactéria hospedeira.
A bactéria hospedeira é colocada em um meio nutritivo seletivo, apenas aquelas que possuem o DNA recombinante crescem, formando colônias. Após muitas gerações de bactérias, o produto da expressão dos genes, as proteínas humanas, são purificadas das bactérias (são separadas das proteínas das bactérias).
Esse método produz uma grande quantidade de proteínas humanas possibilitando assim, seu estudo. 
aplicações: industria alimentar( arroz dourado- diminue a deficiencia de vitamina A), indústria farmacêutica (insulina), industria agrícola( alimentos trasngênicos )
Estudo dirigido –MET/MEV- Microscopia eletrônica
Explique como é formada a imagem no MET e cite os detalhes da preparação das amostras. 
No microscópio eletrônico, os elétrons são emitidos por um filamento aquecido de tungstênio chamado catódio. Em virtude de os elétrons serem partículas carregadas que poderiam colidir com moléculas de ar e assim ser absorvidas e defletidas, todo sistema óptico do microscópio eletrônico deve operar no vácuo. 
O feixe de elétrons passa através de uma série de lentes eletromagnéticas iguais às lentes de vidro do microscópio óptico. 
As lentes eletromagnéticas servem para focalizar o feixe de elétrons e a força do campo magnético produzido pelas lentes pode ser mudada, alterando a quantidade de corrente que passa através dos espirais de fio das lentes. Dessa maneira, o condensador focaliza o feixe sobre o objeto. À medida que os elétrons abandonam o preparado, eles são focalizados na lente objetiva e se obtém uma imagem aumentada. 
A imagem é mais aumentada por uma ou duas lentes projetoras. Uma vez que os feixes de elétrons são invisíveis ao olho nu, a imagem é revelada fazendo com que os elétrons sejam projetados sobre uma tela fluorescente ou uma película fotográfica. 
Infelizmente, os feixes de elétrons possuem um poder de penetração muito fraco, de modo que tem que ser feitos cortes muito delgados do espécime (0,02 – 0,1 micrômetros). Devido a sua pequena espessura, os cortes têm um contraste muito pequeno; assim eles precisam ser corados com metais pesados que absorvam elétrons (tais como o urânio e o chumbo) para aumentar o contraste. 
FIXAÇÃO: Consiste em matar o tecido vivo, e preservar-lo. É adicionado o gluteraldeído.
PÓS-FIXAÇÃO: Consiste em estabilizar as bicamada lipídicas, com tetróxido de ósmio.
DESIDRATAÇÃO: substituição de toda a água presente por cetona ou álcool.
INCLUSÃO: o solvente é substituido por uma resina (parafina, etc) que forma um bloco sólido.
ULTRAMICROTOMIA: Esse bloco é cortado várias vezes em uma espessura finíssima. (50-100nm de espessura)
CONTRASTAÇÃO: o método de constratação não são corantes e sim metais pesados.
Explique como é formada a imagem no MEV e cite os detalhes da preparação das amostras.
Examina a superfície do tecido, de modo que o feixe de elétrons não atravessa o espécime. Um feixe eletrônico estreito é dirigido sobre a superfície do espécime, ‘varrendo-a’ de um lado para outro regularmente. 
Quando o feixe atinge a superfície do espécime esta emite elétrons secundários. Os elétrons secundários são captados por detectores, os quais criam um sinal elétrico, que é projetado em uma tela de televisão. 
O feixe de varredura, atingindo a superfície, desloca-se em sincronia com o feixe que produz a imagem no monitor. Desse modo, uma imagem tridimensional da superfície do espécime pode ser construída no vídeo. Podem obter-se micrografias fotografando a imagem.  
FIXAÇÃO: Consiste em matar o tecido vivo, e preservar-lo. É adicionado o gluteraldeído.
PÓS-FIXAÇÃO: Consiste em estabilizar as bicamada lipídicas, com tetróxido de ósmio.
DESIDRATAÇÃO: substituição de toda a água presente por cetona ou álcool.
SECAGEM AO PONTO CRÍTICO: consiste em remover todo o solvente por ar, mas sem que a célula se deforme. Primeiramente esse solvente é substituido por CO2 líquido (em uma câmara com temperatura- 0-5°C e pressão atmosferica reguladas) , e seguida eleva-se a temperatura (31°C 73atm) e esse CO2 passa para o estado gasoso. 
COBERTURA COM METAL PESADO: a amostra é coberta com um metal pesado como ouro ou platina que ajudará na reflexão dos elétrons.