Avaliação de Células hematopoeticas

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Universidade do Vale do Paraíba 
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento 
 
 
 
 
Rogério Xavier do Nascimento 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Avaliação do crescimento de unidades formadoras de 
colônias de células progenitoras hematopoéticas humanas 
criopreservadas por longo tempo após irradiação com 
laser de baixa potência em diferentes densidades de 
energia (0,1-2,0J/cm2) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
São José dos Campos, SP 
2006 
 
 
Rogério Xavier do Nascimento 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Avaliação do crescimento de unidades formadoras de colônias de 
células progenitoras hematopoéticas humanas criopreservadas por 
longo tempo após irradiação com laser de baixa potência em diferentes 
densidades de energia (0,1-2,0J/cm2) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dissertação apresentada ao Programa 
de Pós-Graduação em Bioengenharia, 
como complementação dos créditos 
necessários para obtenção do título de 
Mestre em Engenharia Biomédica. 
 
 
 
Orientador: Prof. Dr. Fernando Callera 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
São José dos Campos, SP 
2006 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Autorizo, exclusivamente para fins acadêmicos e científicos a reprodução parcial 
ou total desta dissertação, por processo fotocopiador ou transmissão eletrônica. 
 
 
 
Aluno: 
 
 
Data: 
 
 
 
 
 
 
N198a 
 
 Nascimento, Rogério Xavier 
 Avaliação do crescimento de unidades formadoras de colônias de células 
progenitoras hematopoéticas humanas criopreservadas por longo tempo 
após irradiação com laser de baixa potência em diferentes densidades de 
energia (0,1-2,0J/cm2)/ Rogério Xavier do Nascimento. São José dos 
 Campos: UniVap, 2006. 
 39f..: il.; 31cm. 
 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em 
Bioengenharia do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da 
Universidade do Vale do Paraíba. 2006. 
 
 
 
1. Células-Tronco Hematopoéticas 2. Criopreservação 3. Laser de Baixa 
Intensidade 4. Biologia Molecular 5. Citologia I. Callera, Fernando, 
Orient. II. Título 
 
 CDU: 576.35 
 
 
Avaliação do crescimento de unidades formadoras de 
colônias de células progenitoras hematopoéticas humanas 
criopreservadas por longo tempo após irradiação com 
laser de baixa potência em diferentes densidades de 
energia (0,1-2,0J/cm2) 
 
 
 
 
 
 
 
Rogério Xavier do Nascimento 
 
 
 
 
 
Banca Examinadora 
 
 
Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco (UNIVAP) 
 
 
Prof. Dr. Fernando Callera, (UNIVAP) 
 
 
Prof. Dra. Cristina Soares Pacheco (UNIVAP) 
 
 
Prof. Dr. Mirto Nelson Prandini (UNIFESP) 
 
 
 
 
 
 
 
 
Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco 
Diretor do IP&D 
São José dos Campos, Setembro de 2006 
 
 
 
 
 
 
 
Dedicatória 
 
À minha esposa Patrícia, que sempre esteve ao meu lado durante a elaboração deste 
trabalho e que estará em tantos outros momentos de minha vida. 
 
Às minhas filhas Mariana e Marina, que sempre são motivos de inspiração e orgulho 
para mim. 
 
Aos meus pais João Lage e Edméa, por terem me proporcionado a oportunidade de estar 
aqui. Graças à educação moral, cultural e intelectual que me deram, estou podendo 
atingir meus objetivos. À minha irmã Renata por saber dividir tudo isso comigo. 
 
Ao meu avô Lage, que mesmo estando em outro plano, continua me orientando e me 
amparando nos vários momentos de minha vida. 
 
Ao meu avô Joaquim, que sempre apostou que um dia eu chegaria tão longe assim. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agradecimentos 
 
Mais uma vez à minha esposa Patrícia, que sempre me estimulou a terminar este 
trabalho mesmo nos maiores momentos de desânimo. Sem o seu apoio eu não teria 
chegado até o fim. 
 
Ao Prof. Dr. Fernando Callera, que além de um grande orientador, foi também um 
grande amigo e incentivador. Para mim, um exemplo de pesquisador e médico. Sem sua 
chegada este trabalho não teria passado de um sonho. Muito obrigado! 
 
A Prof. Dra. Cristina Pacheco Soares, pela grande paciência e ajuda prestada na etapa 
do experimento realizado em seu laboratório. 
 
Ao Prof. MSc. Carlos José de Lima, pela ajuda na utilização do laser no meu 
experimento. 
 
A Sra. Ivone (IP&D), pela grande colaboração e incentivo para vencer as burocracias da 
elaboração desta dissertação e a Sra. Rosangela (Biblioteca Central) pela correção final. 
 
Aos meus companheiros de equipe neurocirúrgica, Dr. Cyro Britto, Dr. Carlos Roberto 
Aguilar, Dr. Jair de Araújo, Dr. Wellington Britto e Dr. César Yukita, que me ajudaram 
nos momentos em que precisei me dedicar a este trabalho. 
 
Ao Sr. Geraldo Reis e Sra. Érica da empresa GMReis e a Sra. Lucy, Sr. Hércules e Sr. 
Gleisson da empresa Osteocamp, pelo apoio técnico que me proporcionaram durante a 
realização deste trabalho. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“A sorte favorece a mente bem preparada” 
 (Louis Pasteur) 
 
 
Avaliação do crescimento de unidades formadoras de colônias de células progenitoras 
hematopoéticas humanas criopreservadas por longo tempo após irradiação com laser 
de baixa potência em diferentes densidades de energia (0,1-2,0J/cm2) 
 
RESUMO: Objetivos: Investigar os efeitos do laser de baixa potência (LBP) com 
diferentes densidades de energia (0,1-2,0J/cm2) no crescimento de unidades formadoras 
de colônias (UFC) in vitro de células progenitoras hematopoéticas (CPH) 
criopreservadas por longo tempo. Dados de base: Não há dados referentes aos efeitos do 
LBP em CPH humanas criopreservadas. Métodos: Amostras criopreservadas de CPH 
foram descongeladas após 3 anos a fim de demonstrar o efeito proliferativo do LBP e 
após 5 anos a fim de confirmar o efeito proliferativo do LBP. Culturas foram preparadas 
em placas de petri de 35mm de diâmetro com meio de metilcelulose (concentração final 
de 2x105/ml) e incubadas por 14 dias a 37°C com 5% de CO2. Foi utilizado um diodo 
laser de 685nm com 25mW de potência como fonte de irradiação. As culturas foram 
irradiadas com densidades de energia de 0,1, 0,5, 1,0, 1,5 e 2,0 J/cm2 antes da incubação 
(dez irradiadas e dez controle para cada grupo de densidade de energia). Resultados: 
Um alto número de UFC foi observado na dose de 1,0J/cm2 (Controle 21,3±8,5x105 
células, Irradiado 40,1±10,5x105 células, p<0,001). Nenhuma diferença foi observada 
nas culturas irradiadas com doses de 0,1, 0,5 e 1,5 J/cm2. Um número menor de UFC foi 
demonstrado nas amostras expostas à dose de 2,0 J/cm2 (Controle 21,4±11,9x105 
células, Irradiadas 9,5±9,3x105 células, p=0,013). Amostras de CPH criopreservadas por 
5 anos foram descongeladas para análise de UFC e expostas a uma única dose de 
1,0J/cm2; novamente o grupo irradiado mostrou um número maior de UFC (8,8±7,8x105 
células, Irradiado 18,1±13,1x105 células, p=0,026). Conclusão: Dependendo da 
densidade de energia, o LBP eleva (1,0 J/cm2) ou diminui (2,0 J/cm2) o potencial de 
crescimento de UFC in vitro de CPH criopreservadas por longo período. 
 
Palavras-chave: células progenitoras hematopoéticas, criopreservação, laser de baixa 
potência, unidades formadoras de colônias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Evaluation of growth of colony-forming units of human hematopoietic progenitor cells 
cryopreserved for a long time after irradiation with low power laser at different energy 
densities (0.1 to 2.0 J/cm2) 
 
ABSTRACT: Objectives: To investigate the effects of low power laser irradiation 
(LPLI) at different energy densities(0.1-2.0J/cm2) on the capacity of long-term 
cryopreserved blood progenitor cell (BPC) for growth of colony forming units (CFU) in 
vitro. Background data: There are no data concerning the effects of LPLI on human 
cryopreserved BPC. Methods: Cryopreserved BPC samples were thawed after 3 years in 
order to demonstrate the positive effect of LPLI and after 5 years in order to confirm the 
LPLI proliferative effect. Cultures were plated in quadruplicate 35-mm-diameter petri 
dishes in methylcellulose medium (2x105/ml final concentration) and incubated for 14 
days at 37oC with 5% CO2. A 685nm diode laser with 25mW optical power was used as 
source of irradiation. Cultures were exposed to energy densities of 0.1, 0.5, 1.0, 1.5 and 
2.0 J/cm2 before incubation (ten irradiated and ten controls at each energy density 
group). Results: A higher number of CFU was observed at the dose of 1.0 J/cm2 
(Control 21.3±8.5 x105 cells, Irradiated 40.1±10.5 x105 cells, p<0.001). No differences 
were observed in cultures exposed to doses of 0.1, 0.5 and 1.5 J/cm2. A decreased 
number of CFU was demonstrated in samples exposed to the dose of 2.0 J/cm2 (Control 
21.4±11.9 x105 cells, Irradiated 9.5±9.3 x105 cells, p=0.013). BPC samples 
cryopreserved for 5 years were thawed for CFU assays and exposed to a single dose of 
1.0 J/cm2; once again the exposed group showed a higher number of CFU (Control 
8.8±7.8 x105 cells, Irradiated 18.1±13.1 x105 cells, p=0.026). Conclusion: Dependent 
upon the energy density, LPLI elevates (1.0J/cm2) or decreases (2.0J/cm2) the potential 
of long-term cryopreserved BPC for growth of CFU in vitro. 
 
Keywords: Blood progenitor cell, cryopreservation, low power laser irradiation, colony 
forming units. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lista de Figuras 
 
Figura 1 – Modelo de Karu, modificado por Smith. Ação foto-química do laser visível 
na cadeia redox da mitocôndria. Ação foto-física do laser infravermelho na membrana 
celular. Ambos desencadeiam uma resposta celular, que gera cascata bioquímica de 
reações. ........................................................................................................................... 15 
Figura 2– Meio de cultura de Metilcelulose ................................................................... 24 
Figura 3- Amostras de 5 pacientes Concentração final de 2x105 células .................... 24 
Figura 4 – Culturas nas placas de petri de 35mm ........................................................ 24 
Figura 5 – Incubação das culturas por 14 dias a 37°C com 5% de CO2 em uma 
atmosfera úmida. ............................................................................................................. 24 
Figura 6– Cultura controle .............................................................................................. 26 
Figura 7– Cultura irradiada ............................................................................................. 26 
Figura 8 - Laser semicondutor de InGaAlP .................................................................... 27 
Figura 9 – Irradiação das culturas ................................................................................... 27 
Figura 10– Exemplos de UFC obtidas de culturas expostas ao LBP na dose de 1,0J/cm2 
(A). Exemplos de UFC obtidas de culturas não expostas ao LBP (B). .......................... 28 
 
 
 
Lista de Tabelas 
 
Tabela 1– Análise dos resultados das UFC obtidas das amostras de CPH criopreservadas 
por 3 anos, de acordo com cada grupo de dose de densidade de energia. ...................... 28 
Tabela 2 – Análise dos resultados das UFC obtidas das culturas expostas à densidade de 
energia de 1,0J/cm2 de acordo com o tempo de congelamento ...................................... 29 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS 
 
%: percentual 
λ: comprimento de onda 
µm: Micrômetro 
ºC: graus Celsius 
AH: Albumina Humana 
AsGaAl: Arsenieto de Gálio-Alumínio 
ATP: Adenosina Trifosfato 
Ca++: Cálcio 
cm: Centímetro 
CPH: Células Progenitoras Hematopoéticas 
DE: Densidade de Energia 
DMSO: Dimetilsulfóxido 
DNA: Ácido Desoxirribonucléico 
DP: Densidade de Potência 
FA: fosfatase alcalina 
GM-CSF: Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor 
He-Ne: Hélio-Neônio 
HES: Hidroxietilstarch 
Hz: Hertz 
IC: Irradiação Contínua 
InGaAlP: meio ativo composto dos elementos químicos Índio(In), Gálio(Ga), 
Alumínio(Al) e Fósforo(P) 
IP: Irradiação Pulsada 
J: Joules 
Kg: Kilograma 
LBP: Laser de Baixa Potência 
mOsm: Miliosmol 
mW: Miliwatts 
nm: Nanômetro 
UFC: Unidades Formadoras de Colônias 
UFC-E: Unidades Formadoras de Colônias de Eritrócitos 
UFC-GEMM: Unidades Formadoras de Colônias de Granulócitos, Eritrócitos, 
Macrófagos e Megacariócitos 
UFC-GM: Unidades Formadoras de Colônias de Granulócitos e Macrófagos 
UFC-MK: Unidades Formadoras de Colônias de Megacariócitos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 14 
1.1 Irradiação Laser .................................................................................................... 14 
1.2 Criopreservação de Células Progenitoras Hematopoéticas .................................. 16 
1.3 Ensaio clonogênico de células tronco hematopoéticas ......................................... 18 
2 OBJETIVOS ................................................................................................................ 21 
3 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 22 
3.1 Coletas das Células Progenitoras Hematopoéticas ............................................... 22 
3.2 Criopreservação .................................................................................................... 22 
3.3 Análise Clonogênica ............................................................................................. 23 
3.4 Culturas Clonogênicas .......................................................................................... 26 
4 RESULTADOS ........................................................................................................... 28 
5 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 30 
6 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 34 
 
 
 
 
 
 
 
 
14 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
 1.1 Irradiação Laser 
 
O termo Laser é o acrônimo de Light Amplification by Stimulated Emission of 
Radiation (Luz Amplificada pela Emissão Estimulada de Radiação). Esta radiação é 
eletromagnética não ionizante, sendo um tipo de fonte luminosa com características 
bastante distintas daquelas encontradas em uma luz fluorescente ou de uma lâmpada 
incandescente. 
 
A Radiação laser é quase monocromática porque emite radiações em uma banda 
estreita. Apresenta coerência espacial e temporal onde as ondas propagam-se com a 
mesma fase no espaço e no tempo. Sua baixa divergência permite a obtenção de alta 
densidade de energia concentrada em pequenos pontos. Com o auxílio de dispositivos 
ópticos, sua radiação pode ser polarizada. Por essas características especiais esse tipo de 
luz pode ser aplicado em terapêuticas importantes como a fotoestimulação e a terapia 
foto dinâmica, assim como em cirurgias com vantagens muito superiores ao uso do 
bisturi convencional. 
 
O comprimento de onda (λ) é fator determinante na interação laser-tecido. 
Corresponde à distância percorrida pela onda em uma oscilação completa, sendo medida 
em nanômetros (nm) e a freqüênciade suas oscilações em hertz (Hz). O comprimento 
de onda dos lasers comerciais pode variar desde o infravermelho médio até o 
ultravioleta e depende fundamentalmente do seu meio ativo. É o meio ativo, em geral, 
que dá o nome ao laser determinando sua pureza espectral e seu comprimento de onda, 
conferindo características diferentes de emissão e de possível ação biológica. A 
monocromaticidade do laser determina a absorção seletiva por parte dos cromóforos 
com resposta afim a um ou vários λ. 
 
A irradiância é sinônimo da densidade de potencia (DP), que é definida como 
sendo a potencia óptica de saída do laser em Watts, dividida pela área em cm2. 
15 
 
 ORGANELAS IMPLICADAS E REAÇÃO BASE 
CASACATA DE RESPOSTA FOTOQUÍMICA 
 
 
 
 MITOCÔNDRIAS LUZ FOTO-REAÇÃO 
 (pool de DNA) VISÍVEL 
 
 
 
 CITOPLASMA 
 (ATP) 
 
 
 
 MEMBRANA CELULAR TRADUÇÃO DE SINAL E 
 AMPLIFICAÇÃO 
 
 
 
 CITOPLASMA 
 (Ca++ ) 
 
 
 
 NÚCLEO 
 
 
 FOTO-RESPOSTA 
 
 Proliferação ou diferenciação celular 
 ou síntese de proteínas 
 
 
 LUZ 
INFRAVERMELHA 
Multiplicando a irradiância pelo tempo de exposição em segundos, pode-se obter a 
fluência ou densidade de energia (DE) em Joules/cm2. 
 
A célula tem um período de vida segundo o tecido onde ela está localizada e seu 
estado fisiológico. Ao oferecer a célula uma baixa intensidade de energia, esta irá 
utilizá-la de maneira que estimule sua membrana, ou suas mitocôndrias. Dessa forma 
estaremos induzindo a biomodulação, ou seja, a célula buscará um estado de 
normalização da região afetada. 
 
A energia dos fótons de uma radiação laser absorvida por uma célula, será 
transformada em energia bioquímica e utilizada em sua cadeia respiratória. KARU 
(1988), descreveu um mecanismo de ação diferente para os lasers emitindo radiação na 
faixa visível e no infravermelho próximo, como demonstra a figura 1. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1 – Modelo de Karu, modificado por Smith. Ação foto-química do laser visível na 
cadeia redox da mitocôndria. Ação foto-física do laser infravermelho na membrana celular. 
Ambos desencadeiam uma resposta celular, que gera cascata bioquímica de reações. 
Fonte: Karu (1988) 
 
16 
 
A luz laser visível induz uma reação fotoquímica, ativação direta da indução da 
síntese de enzimas (BOLOGNANI et al., 1993; OSTUNI et al., 1994; BOLTON et al., 
1995) e essa luz tem como primeiro alvo os lisossomas e as mitocôndrias das células. 
As organelas absorvem luz infravermelha, porém apenas as membranas destas 
apresentam resposta a este estímulo. As alterações no potencial de membrana causadas 
pela energia de fótons no infravermelho próximo (PASSARELA et al., 1984; 
FRIEDMANN et al., 1991) induzem a efeitos fotofísicos e fotoelétricos, causando o 
choque que se traduzem intracelularmente com um incremento na síntese de ATP. 
 
Quando utilizamos cultura de células em monocamadas, a luz laser incide e 
conserva sua polaridade e coerência. A absorção de fótons por parte da célula, seja 
diretamente por captação ao nível de cromóforos mitocondriais ou por ação em sua 
membrana celular, produz estimulação ou inibição de atividades enzimáticas e de 
reações fotoquímicas. Estas ações determinam alterações fotodinâmicas de reações em 
cascata durante processos fisiológicos sob terapia (FUNK et al., 1992; LOEVSCHALL; 
ARENHOLT-BINDSLEV et al., 1994). 
 
1.2 Criopreservação de Células Progenitoras Hematopoéticas 
 
A atual teoria da Criopreservação determina que é a formação de gelo durante o 
processo de refrigeração que causa o dano celular (KAROW;WEBB, 1965). Este dano 
pode ser classificado em duas categorias. Em níveis rápidos de refrigeração, cristais de 
gelo podem se formar dentro das células, os quais resultam em rompimento mecânico 
da célula e sua morte imediata. Em níveis mais lentos de refrigeração, a formação de 
cristais de gelo ocorre preferencialmente no espaço extracelular, o que resulta em 
aumento da osmolalidade à medida que a água livre é incorporada ao crescimento dos 
cristais de gelo. Esta perda da água livre resulta em: 1) concentração de solutos 
extracelulares que não penetram livremente na membrana celular, 2) extrema 
hiperosmolalidade, e 3) lesão por desidratação. A desidratação progressiva da célula vai 
acontecer se o grau de velocidade do resfriamento for lento o suficiente para permitir 
que a água mude para o espaço extracelular e seja incorporada aos cristais de gelo em 
crescimento. 
17 
 
 
A Criopreservação de células de mamíferos tornou-se possível com a descoberta, 
em 1949, das propriedades crioprotetoras do glicerol (POLGE et al., 1949). Em 1959, as 
propriedades crioprotetoras do dimetilsulfoxido (DMSO) foram relatadas 
(LOVELOCK; BISHOP, 1959). Glicerol e DMSO são crioprotetores coligativos que 
previnem a lesão por desidratação moderando a concentração aumentada de solutos 
extracelulares não penetráveis durante a formação de gelo e diminuindo o volume de 
água absorvida pelos cristais de gelo a uma determinada temperatura. 
 
A desidratação celular ocorre porque alguns solutos, como íons de sódio, não 
penetram livremente a membrana celular. Por essa razão, à medida que cristais de gelo 
se formam fora da célula durante o processo de refrigeração, o sal se torna concentrado 
e água sai da célula. O DMSO protege deste efeito porque ele livremente penetra na 
célula. Altas concentrações de DMSO dentro ou fora da célula impedem o efeito dessa 
desidratação porque há mais moléculas de DMSO do que do sal na solução (10% de 
DMSO é equivalente a 1400mOsm). Deste modo, a diferença de osmolalidade entre o 
interior e o exterior da célula é menor em qualquer temperatura depois que a 
cristalização do gelo começa. 
 
As propriedades coligativas não explicam a crioproteção alcançada pelo 
congelamento celular em soluções de macromoléculas como o hidroxietilstarch (HES). 
Soluções de crioprotetores poliméricos de alto peso molecular contém relativamente 
poucas partículas e não penetram livremente na célula. Estes crioprotetores podem 
proteger a célula pela formação de uma cápsula vítrea viscosa (vitrificação) que retarda 
o movimento da água, dessa forma prevenindo a desidratação progressiva à medida que 
a água é incorporada aos cristais de gelo no espaço extracelular (TAKAHASHI et al., 
1988). 
 
A criopreservação permite o armazenamento e a viabilidade das células 
progenitoras hematopoéticas (CPH) por longo período de tempo sem a perda 
progressiva que ocorre durante armazenamento não congelado. Muitos laboratórios de 
criopreservação usam técnicas similares de criopreservação com diferenças mínimas na 
18 
 
concentração dos crioprotetores, volume dos componentes, e temperaturas de 
armazenamento (ATTARIAN et al., 1996; AREMAN et al., 1990). As etapas 
envolvidas na criopreservação são o processamento de pré-congelação, preparação e 
adição das soluções crioprotetoras, resfriamento e armazenamento. CPH coletadas do 
sangue periférico, da medula óssea ou do cordão umbilical são comumente congeladas e 
armazenadas usando-se as mesmas técnicas. A técnica geral inclui criopreservação em 
uma solução de DMSO (10%), uma fonte de proteína plasmática (albumina humana) 
com ou sem HES, refrigeração contínua a taxa de 1 até 3°C por minuto, e 
armazenamento a -80°C ou mais. Variações nesta técnica incluem a concentração na 
qual as células são congeladas, a quantidade e fonte de proteína plasmática, e as técnicas 
de refrigeraçãousadas (ATTARIAN et al., 1996; AREMAN et al., 1990). Muitas destas 
variações provavelmente têm pequenos efeitos na sobrevivência das CPH, como 
mostrado pela consistente enxertia dos componentes criopreservados (PRETI et al., 
1994). Entretanto, a criopreservação resulta em uma perda substancial na proporção de 
CPH (GORIN, 1986) e o retardo na enxertia pode ocorrer se o componente a ser 
congelado tem quantidades limítrofes de CPH. 
 
1.3 Ensaio clonogênico de células tronco hematopoéticas 
 
A produção das células sanguíneas é um processo complexo envolvendo 
proliferação celular, diferenciação, morfogênese, maturação funcional e morte celular 
(METCALF, 1984). As células tronco hematopoéticas residentes na medula óssea, 
possuem a capacidade única de auto-renovação e diferenciação nos diferentes tipos de 
células sangüíneas. A partir das células tronco hematopoéticas as células se 
comprometem com uma das três linhagens distintas conhecidas como mielóide, linfóide 
ou eritróide em resposta aos fatores de crescimento humoral e citocinas específicas 
presentes na medula óssea (GRIBALDO, 2002; DIODOVICH et al., 2004). 
 
Além dos precursores hematopoéticos, a medula óssea é constituída também pelo 
estroma medular: células endoteliais, células acumuladoras de lipídios, macrófagos e 
células fibroblásticas, formando assim o microambiente medular (PARENT-MASSIM 
et al., 2001). O estroma medular tem como função a regulação da maturação e 
19 
 
diferenciação dos precursores hematopoéticos por meio de contato direto entre as 
células do estroma e células primitivas ou de forma indireta por meio da liberação dos 
fatores de crescimento. A integridade destes dois sistemas, bem como a associação entre 
eles, são fatores cruciais para a manutenção da homeostase hematopoética (LORD & 
TESTA, 1988; DELLMANN, 1993). 
Devido à grande capacidade proliferativa do tecido hematopoético, as células da 
medula óssea são alvos freqüentes da ação de diferentes agentes tóxicos 
(YAMAGUCHI et al., 1994). Desta forma, a avaliação da integridade da hematopoese é 
um parâmetro importante para o entendimento dos mecanismos envolvidos na alteração 
da produção de células sanguíneas e como estas mudanças coletivamente podem 
influenciar o sistema imunológico. 
 
Os ensaios clonogênicos, simulando a hematopoese, são sistemas de cultura de 
células progenitoras hematopoéticas, geralmente em meio semi-sólido (ágar ou metil-
celulose), amplamente empregado na hematologia experimental e clinica por mais de 30 
anos. In vitro, em presença do meio de cultura e de uma mistura de citocinas específicas 
para cada linhagem celular, as células progenitoras formam colônias de células 
diferenciadas fenotipicamente. A este conjunto de células deu-se o nome de unidades 
formadoras de colônias (UFC) (QUEIROZ, 1988). As UFC são, teoricamente, 
originárias de uma única célula sendo, portanto, consideradas clonadas (PARENT-
MASSIN, 2001). Os ensaios clonogênicos de células progenitoras podem resultar em 
UFC comprometidas com a linhagem de granulócitos e macrófagos (UFC-GM), com a 
linhagem eritróide (UFC-E) ou com a linhagem megacariocítica (UFC-MK) (PARENT-
MASSIN 2001; MALERBA et al., 2004). 
 
Os ensaios clonogênicos mais freqüentemente estudados são os efeitos agudos de 
quimioterápicos sobre as UFC-GM. Uma vez que as células progenitoras são 
heterogêneas e considerando a cinética de seu desenvolvimento e principalmente o 
número de colônias obtidas, o ensaio clonogênico permite a distinção entre as diferentes 
expressões do efeito tóxico; estes efeitos tóxicos podem apresentar-se como destruição 
das células, bloqueio, atraso ou aumento no número de mitoses revelando, em última 
análise, aumento ou diminuição do número de UFC. Portanto, em um ensaio utilizando-
20 
 
se um determinado quimioterápico, a quantificação da mielotoxicidade é feita a partir 
do número de UFC-GM sobreviventes em função do nível de exposição ao agente 
tóxico na presença de concentrações máximas do fator estimulador de colônias de 
granulócitos e macrófagos (“Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor” GM-
CSF) (METCALF 1984; GRIBALDO 2002; PESSINA et al., 2003; DIODOVICH et 
al., 2004). 
 
Uma vez que a mielotoxicidade pode resultar tanto do efeito direto da droga 
sobre os progenitores hematopoéticos quanto do seu efeito sobre as células do estroma 
medular ou expressão de citocinas/receptores, diferentes ensaios clonogênicos têm sido 
desenvolvidos e propostos para a avaliação da integridade da hematopoese (PARENT-
MASSIN et al., 1993; GRIBALDO et al., 1996; PESSINA et al., 1998; PESSINA et al., 
1999; PESSINA et al., 2003). Todos estes testes são modificações da técnica original 
descrita por BRADLEY e METCALF (1966), e também desenvolvida e modificada por 
outros autores (DEXTER et al., 1973; DEXTER ; TESTA, 1976; DEXTER ; 
SPOONCER, 1987). 
 
Na hematologia clínica os ensaios clonogênicos são mais comumente 
empregados para predizer o tempo de recuperação medular em pacientes submetidos ao 
transplante de medula óssea (DELDAR et al., 1988; DELDAR ; STEVENS, 1993; 
DELDAR, 1994; DELDAR, HOUSE ; WIERDA, 1995). Por outro lado, na área 
experimental, estes ensaios podem ser aplicados para avaliar a hematopoese frente a 
diferentes condições patológicas como o estresse físico, a presença de agentes 
microbianos assim como de células neoplásicas de várias linhagens e como mencionado 
anteriormente, para avaliar o efeito de drogas, principalmente os agentes 
quimioterápicos (VALADARES et al., 1998; MALACRIDA et al., 1997; DANTAS ; 
QUEIROZ 1999; QUEIROZ et al., 2001; VALADARES; QUEIROZ 2002; QUEIROZ 
et al., 2004). 
 
 
 
 
21 
 
2 OBJETIVOS 
 
Baseados nos efeitos da criopreservação em CPH em associação com os efeitos 
da irradiação laser em tecidos e células o presente estudo foi delineado de modo a se 
investigarem os efeitos do laser de baixa potência (LBP) em diferentes densidades de 
energia na capacidade de crescimento de UFC in vitro de CPH criopreservadas por 
longo período de tempo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
3 MATERIAL E MÉTODOS 
 
 3.1 Coletas das Células Progenitoras Hematopoéticas 
 
 Utilizaram-se dados referentes a coletas de CPH realizadas para transplante de 
medula óssea autólogo no Serviço de Hematologia e Hemoterapia de São José dos 
Campos entre setembro de 1999 e junho de 2001. Todos os pacientes incluídos neste 
estudo foram submetidos a biopsias de medula óssea de crista ilíaca bilateral que não 
mostraram evidência microscópica de doença no momento da colheita das CPH. Além 
disso, estudos citogenéticos e de imunofenotipagem foram normais nestes pacientes. 
CPH foram mobilizadas com 10µg por Kg de peso corpóreo do receptor com fator de 
crescimento humano para granulócitos (Filgrastima; Roche Brasil, Rio de Janeiro, RJ) 
em doses diárias por sete dias consecutivos. As células eram coletadas através de uma 
via venosa central inserida 2 dias antes da coleta de CPH. Precauções de assepsia foram 
realizadas tanto para a inserção do cateter quanto para a coleta das CPH. As CPH foram 
coletadas com um separador celular de fluxo contínuo (Fresenius AS104 separador 
celular, Fresenius Hemocare, Redmond, WA). A cada coleta, foram processados três 
vezes o volume total sangüíneo através do separador celular com uma meta mínima de 
2,0x106 células CD34+ por Kg ou mais que 2,0x108 células mononucleares por Kg. A 
contagem celular foi realizada com um contador automático de células (Coulter T890, 
Beckman Coulter, Inc. Fullerton, CA). A quantificação das células CD34 positivas(CD34+) foi realizada como descrito anteriormente (GRATAMA et al., 2001). Cada 
coleta durou de 4 a 5 horas por dia. As doses alvo foram atingidas após três dias de 
coletas (aféreses). 
 
3.2 Criopreservação 
 
As CPH foram criopreservadas usando-se uma mistura crioprotetora de 10% de 
dimetilsulfoxido (DMSO), 6% de HES e 4% de albumina humana (AH) utilizando-se 
um congelamento não programado a -85°C em freezer de nitrogênio (AYELLO et al., 
23 
 
1998). A viabilidade celular foi realizada pelo teste de corante azul de Trypam e teste de 
exclusão e valores superiores a 70% foram considerados ótimos. 
 Amostras criopreservadas de pacientes que recidivaram em um período de 2 
anos após a coleta das células ou que não atingiram as doses alvo de CD34+ e células 
mononucleares após três dias de aférese foram excluídos. Amostras descongeladas com 
viabilidade celular menor que 70% também foram excluídas. 
 
3.3 Análise Clonogênica 
 
A análise clonogênica (AYELLO, 1998; DURAN, 1999) das CPH foi realizada 
usando-se um meio de metilcelulose preparado comercialmente (Methocult GF4434, 
Stem Cell Technologies, Vancouver, Britsh Columbia, Canadá) contendo citoquinas 
recombinantes que possibilitam o crescimento de unidades formadoras de colônias 
eritrocíticas (UFC-E), unidades formadoras de colônias de granulócitos e macrófagos 
(UFC-GM) e unidades formadoras de colônias de granulócitos, eritrócitos, macrófagos 
e megacariócitos (UFC-GEMM) (Figura 2). Amostras de cinco pacientes foram 
escolhidas aleatoriamente. Um frasco congelado de cada unidade de CPH foi 
descongelado depois de 3 anos para análise de unidades formadoras de colônias (UFC). 
O frasco congelado foi submerso em banho maria a 37°C e rapidamente descongelado. 
Amostras foram retiradas do frasco descongelado, pegando-se um volume previamente 
calculado de acordo com o total de células nucleares e células CD34+ contidas nas 
unidades de CPH antes da criopreservação. Um volume entre 0.050 e 0.100 ml de CPH 
descongeladas foi diretamente semeada no meio de cultura (concentração final de 
2x105) (Figura 3). 
24 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2– Meio de cultura de 
Metilcelulose 
Figura 3- Amostras de 5 pacientes 
Concentração final de 2x105 células 
 
 
Culturas foram preparadas em placas de petri de 35mm de diâmetro e incubadas 
por 14 dias a 37°C com 5% de CO2 em uma atmosfera úmida (Figuras 4 e 5). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4 – Culturas nas placas de petri de 
35mm 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5 – Incubação das culturas por 14 dias 
a 37°C com 5% de CO2 em uma atmosfera 
úmida. 
 
Colônias, definidas como agrupamentos de mais de 40 células, foram contadas 
em um microscópio invertido. UFC foram calculadas pela soma de UFC-E, UFC-GM e 
UFC-GEMM. O crescimento de colônias foi relatado como a média da contagem de 
colônias x 105 células nucleares semeadas de cada amostra duplicada de CPH. 
 
26 
 
3.4 Culturas Clonogênicas 
 
 Para cada paciente duas culturas clonogênicas foram expostas ao laser de baixa 
potência (LBP) e duas serviram de controle (Figuras 6 e 7). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6– Cultura controle 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7– Cultura irradiada 
 
A irradiação foi feita com um laser semicondutor de InGaAlP como meio ativo 
acoplado com uma fibra óptica de 600µm de diâmetro operando em 685nm em um 
modo de onda contínuo (potência óptica de 25mW) (Figura 8). A fibra óptica foi 
posicionada verticalmente a fim de produzir um foco de 35mm de diâmetro. As perdas 
de energia não foram consideradas significantes. As culturas celulares foram irradiadas 
diretamente de cima para baixo com uma incidência perpendicular na superfície da 
amostra e expostas a densidades de energia de 0,1, 0,5, 1,0, 1,5 e 2,0 J/cm2 antes da 
incubação (Figura 9). O tempo de exposição foi de 38, 192, 385, 577 e 770 segundos 
por cultura, respectivamente. Para cada grupo de densidade de energia um total de dez 
culturas expostas e dez culturas controle foram estudas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
27 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8 - Laser semicondutor de InGaAlP 
 
 
 Figura 9 – Irradiação das culturas 
 
 O teste U de Mann-Whitney foi usado para comparar os grupos. Um valor de 
“p” menor que 0.05 foi considerado significativo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
4 RESULTADOS 
 
 Um alto número de UFC foi observado na dose de 1,0J/cm2 (Figura 10). 
Nenhuma diferença foi observada nas culturas expostas às doses de 0,1, 0,5 e 1,5 J/cm2. 
Por outro lado, um número menor de UFC foi demonstrado nas amostras expostas às 
doses de 2,0J/cm2 (Tabela 1). 
 
 A B 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10– Exemplos de UFC obtidas de culturas expostas ao LBP na dose de 1,0J/cm2 (A). Exemplos de 
UFC obtidas de culturas não expostas ao LBP (B). 
 
 
Tabela 1– Análise dos resultados das UFC obtidas das amostras de CPH criopreservadas por 3 anos, de 
acordo com cada grupo de dose de densidade de energia. 
 UFC (x 105 células) 
Densidade de 
Energia (J/cm2) 
Densidade de 
Potência (mW/cm2) Irradiadas Controle P 
0,1 2,6 25,6 ± 10,6 (n=10) 
24,0 ± 9,7 
(n=10) 0,729 
0,5 2,6 21,6 ± 14,8 (n=10) 
20,4 ± 11,9 
(n=10) 0,844 
1,0 2,6 40,1 ± 10,6 (n=10) 
21,3 ± 8,5 
(n=10) <0,001 
1,5 2,6 11,4 ± 3,8 (n=10) 
14,4 ± 7,3 
(n=10) 0,295 
2,0 2,6 9,5 ± 9,3 (n=10) 
21,4 ± 11,5 
(n=10) 0,013 
 
29 
 
A fim de confirmar o efeito proliferativo, amostras com unidades de CPH 
criopreservadas por 5 anos foram descongeladas para análise de UFC e expostas a uma 
única dose de densidade de energia de 1.0J/cm2; novamente o grupo exposto mostrou 
um número maior de UFC (Tabela 2). 
 
Tabela 2 – Análise dos resultados das UFC obtidas das culturas expostas à densidade de energia de 
1,0J/cm2 de acordo com o tempo de congelamento 
 
 UFC (x105 células) 
Tempo de Congelamento (anos) Irradiadas Controle P 
3 40,1 ± 10,6 (n=10) 
21,3 ± 8,5 
(n=10) <0,001 
5 18,1 ± 13,1 (n=10) 
8,8 ± 7,8 
(n=10) 0,026 
30 
 
5 DISCUSSÃO 
 
 Existem muitos estudos sobre os efeitos fotobiológicos in vitro e in vivo de 
culturas celulares ou tecidos biológicos, após a utilização da irradiação do laser de baixa 
potência. Fontes de laser de baixa potência, como o laser de hélio-neônio (He-Ne) com 
comprimento de onda de 632,8 nm, demonstraram produzir efeitos fotobiológicos com 
evidente interferência nas funções imunológicas. Culturas de células sanguíneas 
mononucleares humanas foram irradiadas várias vezes em duas intensidades 
selecionadas e então estimuladas com diferentes agentes mitogênicos. Após 30 minutos 
de irradiação laser (18,9 J cm-2) níveis significativamente aumentados de todas as 
citocinas foram determinados; por outro lado, culturas irradiadas por 60 minutos ou 
mais (37,8 J cm-2) apresentaram níveis de citocinas significativamente diminuídos 
(FUNK et al., 1992). 
 
 Outro estudo avaliou a possibilidade de uma influência estimulatória da 
irradiação do laser de baixa intensidade na proliferação de células endoteliais de veia 
umbilical humana (CEVUH). Culturas de CEVUH foram irradiadas todos os dias com 
um diodo laser de 670 nm (intensidade: 10-65 mW cm-2, dose: 2-8 J cm-2) durante um 
período de 6 dias. A proliferação celular foi avaliada quantitativamente com um 
hemocitômetro. Observou-se um efeito dose-dependente e intensidade-dependente da 
irradiação do laser na proliferação das CEVUH. Doses entre 2 e 8 J cm-2 induziram uma 
proliferação celular estatisticamentesignificativa (SCHINDL et al., 2003). 
 
 Os efeitos de freqüências pulsáveis do laser de baixa potência em formações 
nodulares ósseas em células de calvária de ratos in vivo também foram avaliados. 
Células osteoblásticas isoladas de calvária fetal de ratos foram irradiadas com uma 
energia baixa de laser Ga-Al-As (830nm, 500mW, 0.48-3.84J/cm2) em quatro modos 
diferentes de irradiação: irradiação contínua (IC), e 1, 2, e 8 Hz de irradiação pulsada 
(IP-1, IP-2, IP-8). A irradiação do laser nos quatro grupos estimulou significativamente 
a proliferação celular, formação dos nódulos ósseos, atividade da fosfatase alcalina (FA) 
e expressão genética da FA, se comparada com o grupo não irradiado. Notavelmente, as 
irradiações IP-1 e IP-2 claramente estimularam estes fatores, quando comparados com 
31 
 
os grupos IC e IP-8, e a irradiação IP-2 foi o melhor estímulo para formação de nódulos 
ósseos nas condições experimentais presentes, o que comprova que a irradiação de laser 
em baixas freqüências é um importante fator que afeta as respostas biológicas na 
formação óssea (UEDA; SHIMIZU, 2003). 
 
 Ainda na área da reparação óssea, um estudo de 1987 já demonstrava a 
regeneração em fraturas ósseas após o tratamento com laser. Este estudo experimental 
foi realizado em fraturas de tíbia de camundongos, que tiveram sua reparação 
controlada histologicamente após uma exposição de laser de 632 nm (laser de HeNe, 
com doses de 2,4 J). Através de microscopia óptica, nos animais tratados, foram 
observados aumento na vascularização e uma rápida formação de tecido ósseo com uma 
densa rede trabecular quando comparado com o grupo controle, o qual apresentava 
apenas tecido condral e uma pobre vascularização, correspondendo a um estágio inicial 
da consolidação óssea. Concluiu-se que o laser deve modular o funcionamento dos 
osteócitos (TRELLES; MAYAYO, 1987). Oito anos após este estudo, em 1995, um 
novo trabalho experimental com tíbias de ratos mostrou uma regeneração óssea mais 
rápida e eficiente após a utilização do laser de HeNe (BARUSHKA et al., 1995). 
 
 Uma série de trabalhos citados sugerem a atuação do laser de baixa potência na 
biomodulação celular. 
 
 A análise das unidades formadoras de colônias pode ser usada para elucidar um 
número de problemas que têm desafiado pesquisadores por muito tempo. Este sistema 
de cultura auxilia o crescimento e diferenciação de progenitores hematopoéticos 
reconhecidos pela formação de UCF características. Por exemplo, é possível investigar 
as interações dos fatores que afetam as comunicações célula-célula influenciando a 
hematopoese. Ademais, este método permite determinar os efeitos sinérgicos que têm 
influência específica na diferenciação das células sangüíneas e no controle regulatório 
que são responsáveis pela definição das diferentes linhagens hematopoéticas. Além do 
mais, os efeitos tóxicos de vários agentes terapêuticos na diferenciação de células 
sangüíneas podem ser explorados usando-se esta análise (ALLIERI et al., 1990; 
KOBARI et al., 1990; ALLIERI et al., 1991). Entretanto, há uma considerável 
32 
 
variabilidade individual no número de UFC e os ensaios clonogênicos com meio de 
metilcelulose podem variar consideravelmente entre diferentes laboratórios. De fato, 
este método é criticamente dependente das condições de cultura utilizadas, incluindo o 
tipo de soro e citoquinas associadas para estimulação. Entretanto, a utilização de 
reagentes padronizados e comercialmente disponíveis, como usado no presente estudo, 
tem levado a uma grande reprodutibilidade dos resultados de UFC. Além disso, nós 
demonstramos que nas mesmas condições de cultura o LBP, dependente da densidade 
de energia do LBP, eleva (1,0J/cm2) ou diminui (2,0J/cm2) o potencial de CPH 
criopreservadas por longo período para o crescimento de UFC in vitro. VACEK et al 
(1990), demonstraram que uma exposição única de uma suspensão celular de medula 
óssea murina a irradiação do laser de He-Ne eleva o potencial de células tronco 
hematopoéticas para o crescimento de UFC-GM. Analisados em conjunto, estes dados 
sugerem que o aumento na capacidade de crescimento de UFC de CPH criopreservadas 
por longo tempo expostas ao LBP é um fenômeno particular e não uma interferência do 
meio de cultura. 
 
 Os efeitos do armazenamento por longo período de tempo a –85°C usando uma 
mistura de DMSO, HES e AH como um crioprotetor no potencial clonogênico in vitro 
de CPH humanas autólogas, tem sido descrito. Demonstrou-se que o armazenamento de 
CPH a –85°C por períodos superiores a 3 anos é possível e é associado a um declínio 
gradual no potencial clonogênico (AYELLO, 1998; DURAN, 1999). Nossos dados 
relativos ao número de UFC em amostras criopreservadas e descongeladas após 3 e 5 
anos estão em concordância com estes estudos. Entretanto, quando irradiadas com 
densidade de energia de 1,0J/cm2, CPH criopreservadas por longo tempo (3 e 5 anos) 
apresentaram um aumento no crescimento de UFC em comparação com o crescimento 
das células controle em condições ideais de cultura. Os mecanismos envolvidos neste 
fenômeno são pouco entendidos. Estudos in vitro têm discutido os efeitos proliferativos 
do LBP nos modelos biológicos; foi demonstrado recentemente que o LBP, além de 
promover biomodulação positiva, atua no restabelecimento da homeostase celular 
quando as células são mantidas sob condições de stress nutricional, previne apoptose 
em células CHO K-1 (CARNEVALLI et al., 2003) e aumenta a contagem de células 
tronco em planárias durante a regeneração tecidual (SOUZA et al., 2005). Também foi 
33 
 
demonstrado o efeito do LBP na morfologia e potencial das membranas mitocondriais 
em células Hep-2 sugerindo uma interferência funcional nestas organelas 
(BORTOLETTO, 2004; KUJAWA, 2004). Por outro lado, culturas irradiadas com 
densidade de energia de 2,0J/cm2 apresentaram um crescimento diminuído de UFC 
sugerindo um efeito tóxico ou inibitório nesta faixa de densidade de energia. Apesar 
destes dados, comparações com nossos dados deveriam ser cuidadosamente 
considerados desde que em cada estudo citado acima diferentes comprimentos de onda e 
densidades de energia de irradiação laser foram usadas a fim de investigar seus efeitos 
nas funções celulares in vitro. Entretanto, é razoável considerar que os efeitos do LBP 
nesta faixa de densidade de energia (0,1-2,0 J/cm2) no potencial clonogênico de CPH 
criopreservadas não estão relatadas a uma simples cascata metabólica, mas sim a uma 
complexa rede de caminhos que se influenciam mutuamente de uma maneira que parece 
ser proliferativo ou inibitório. Baseado nestes dados, um fenômeno possível a ser 
considerado é a ocorrência de apoptose. Apoptose é uma forma morfologicamente 
distinta de morte celular que tem um papel crítico na homeostase das células tronco 
hematopoéticas. A apoptose envolve um sinal, a interpretação deste sinal, a estimulação 
das vias da cascata do sinal e a integração destas vias com a estimulação ou supressão 
dos genes envolvidos. O que tem se tornado claro é que a apoptose é um sistema de 
elementos que controlam a resposta celular, alguns dos quais estimuladores e outros 
inibidores, podendo ocasionar a morte celular. Conseqüentemente uma hipótese 
razoável é que o LBP atua como um elemento de controle e, dependendo da densidade 
de energia, promove ou inibe a apoptose. Baseados nestes aspectos acreditamos que 
novos estudos usando-se mais doses próximas ao valor crítico (1,0J/cm2) e mais doses 
acima de 2,0J/cm2 a fim de se observar uma clara tendência de aumento ou diminuição 
dos efeitos com a dose de irradiação, bem como de uma possível associação direta entre 
a proporção de células apoptóticase a dose de irradiação, deveriam ser planejados. 
 
 
 
 
 
 
34 
 
6 CONCLUSÕES 
 
Com base nos objetivos propostos, este estudo demonstrou os efeitos do LBP em 
diferentes densidades de energia na capacidade de proliferação de UFC in vitro 
provenientes de CPH criopreservadas por longo tempo. Concluiu-se que, dependendo 
da densidade de energia, o LBP eleva (1.0J/cm2) ou diminui (2,0J/cm2) o potencial de 
crescimento de UFC de CPH criopreservadas por longo período de tempo. 
35 
 
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	“A sorte favorece a mente bem preparada”
	1 INTRODUÇÃO
	1.1 Irradiação Laser
	1.2 Criopreservação de Células Progenitoras Hematopoéticas
	1.3 Ensaio clonogênico de células tronco hematopoéticas
	2 OBJETIVOS
	3 MATERIAL E MÉTODOS
	3.1 Coletas das Células Progenitoras Hematopoéticas
	3.2 Criopreservação
	3.3 Análise Clonogênica
	3.4 Culturas Clonogênicas
	4 RESULTADOS
	5 DISCUSSÃO
	6 CONCLUSÕES