Aula 1 Célula tronco hematopoiética e heterogeneidade das células do sangue

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Célula tronco hematopoiética – e heterogeneidade das células do sangue
Célula tronco
Capacidade de diferenciação
Capacidade de povoamento (autorrenovação)
A célula tronco é a primeira que “chega” quando vai se formar o sangue, permitindo que ocorra o pool de célula para preencher aquela região. Para isso, ela não só deve ser capaz de se diferenciar, mas de se multiplicar também (autorrenovação).
ÁREAS DA HEMATOLOGIA
Hemoterapia
Transplantadores de célula-tronco hematopoiéticas
Aplicação com máquinhas e doação de sangue
Hematologia benignna
Área de coagulação
Área de oncohematologia (linfomas, leucemias e mielomas) – tumores líquidos
A célula tronco hematopoiética é feita com o doador e com o receptor vivos, diferentemente da maioria dos transplantes. Não envolve cirurgia também.
Oncologia hematológica tumores líquidos (diferentemente dos comuns tumores sólidos da clínica) 
Célula tronco é coletável a partir do sangue periférico, mesmo que ela esteja principalmente dentro da medula óssea.
Essa célula tronco tem uma função muito importante, que é produzir sangue.
PANCITOPENIA todas as séries (vermelha, branca e numero de plaquetas) reduzidas. No caso do paciente mostrado em sala de aula, foi por conta de quimioterapia, que matou as células tronco.
Após um transplante, as séries voltaram a número normais devido à normalização da hematopoiese.
Celula tronco pode ser administrada via veia periférica ou pelo cateter (mais comum), se alojando então 
Nem todas as células tronco são hematopoiéicas, como a célula tronco mesenquimal, célula tronco neurológica, bem como a muscular.
Hoje tenta-se desenvolver órgãos e sangue artificial.
Características gerais das células tronco
São células indiferenciadas que são “produtoras de células” necessárias para geração, homeostasia e reparo tecidual.
Divisão por longos períodos
Autorrenovação
Diferenciação
Capacidade de migração
Divisão simétrica (auto-renovação) e assimétrica (diferenciação)
Zigoto: Célula tronco totipotente
Massa celular interna do blastocisto: células tronto pluripotente: produz todas as células do corpo menos placenta.
Célula pluripotente somática
Célula tronco hematopoiética: Multipotente. Capaz de produzir especificamente algum tipo de tecido. No caso, tecido sanguíneo. Apresenta certo nível de diferenciação e de especialização, mantendo as características de autorrenovação.
Dr. Donnalll Thomas: pai do transpate de medula óssea. Prêmio Nobel de medicina.
Conceitos importantes
Célula tronco é diferente de célula tronco hematopoiética
Célula tronco hematopoiética (CTH) é multipotente.
A maioria dos estudos com CTH foram feitas em animais
Onde o sangue é produzido?
Feto (antes dos dois meses): saco vitelínico
Hematopoiese definitiva inicia-se em uma região AGM (aorto-gonodo-mesonefro) e migra para fígado/baço (2 a 7 meses) Medula ósessa (5 a 9 meses) e também parte da placenta.
Nas crianças: medula óssea vermelha (quase todos os ossos)
No adulto: medula óssea vermelha (ossos chatos e epífises de ossos longos)
Dia 19 do embrião: formação das Ilhotas de sangue próximo do saco vitelínico vem de um precursor, o hemangioblasto – supõe-se que o precursor do sangue e do vaso seja o mesmo. Este surge a partir do mesoderma primário e estimulado por uma proteína: Indian Hedgehog, que transforma o mesoderma em hemagioblasto a partir de uma proteína formada, a BMP4 (bone morphogenic protein 4)
1ª onda: hematopoiese primitiva
Essa primeira onda de sangue não é definitiva. É uma primeira onda para manter a produção, principalmente de células vermelhas. Não são produzidos, por exemplo, leucócitos e plaquetas. Aqui não há, por exemplo, produção de plaquetas, apenas de eritoblastos. Se você extrair células das ilhotas de sangue do embrião, composta tanto por células sanguíneas quanto endoteliais, e injetar no sangue periférico, ela não consegue manter a hematopoiese no paciente. 
2ª onda: hematopoiese definitiva – começa entre 27º e 40º dia 
Região ventral para-aorta- esplacnopleura/ aorta-gônada-mesonefro Migração ou aparecimento de células tronco hematopoiética. Essas sim podem se manter se for transplantada em outro indivíduo. Essas células tronco hematopoiéticas vão migrar para timo, fígado, baço e medula óssea – região de hematopoiese definitiva do feto. A medula óssea vai ser fundamental na manutenção da hematopoiese na infância e na fase adulta. Aqui já há uma célula especializada.
Medula óssea vermelha mantém a produção de sangue, a hematopoiese. A hematopoiese se distribui pelo organismo. É disso que advem a dificuldade de tratamento – envolve o organismo como um tudo.
Ossos chatos 
Esterno 
Crânio
Costelas
Vertebras
Escapula
Pélvis
Parte esponjosa da epífise dos ossos longos(fêmur e úmero)
Com 5 a 7 anos a MO vermelha dos ossos longos é substituída pela MO amarela, ficando a vermelha restrita às epífises.
Diversidade de locais de produção de sangue demonstra porque pode ser muito difícil tratar sistemas relacionados a esse processo.
Homing: capacidade de migração da célula tronco hematopoiética para seus nichos	
Nichos: além da autorrenovação e da diferenciação, observa-se a capacidade de migração das células hematopoiéticas para os locais onde vão se estabelecer, os nichos hematopoieticos
Importância clinica
Se a medula óssea produzir demais (situações de estresse hematopoiético como a talassemia) pode haver proliferação medular intra-óssea elevada, levando a deformidades ósseas.
Se a medula óssea produzir de menos , como na mielofibrose, ou a produção não é eficaz, como a beta-talassemia maior, o baço e o fígado podem voltar a produzir sangue – homing para antigos órgãos -, o que leva um aumento de tamanho (esplenomegalia/hepatomegalia) hematopoiese extra-medular.
Exames
Biópsia de medula óssea: celularidade melhor que morfologia. Realizada na crista ilíaca do paciente, remoção de um fragmento de 2 cm da medula por meio da introdução da agulha dentro do osso trabecular e analisa-se o fragmento. Serve parar ter uma ideia do povoamento e da arquitetura da medula óssea.
Entra-se com a agulha rodando dentro do osso do paciente, faz-se a medida da peça com um medidor e, para extrair o fragmento ós 	seo de tamanho adequado, roda-se a agulha de modo que o fragmento fica dentro da agulha.
Mielograma: Morfologia melhor do que celularidade. Pode ser retirado da crista ilíaca ou da região esternal, retira-se um espirado medular. Permite uma avaliação do tipo celular, e não da arquitetura do sangue. Avaliar na lâmina a presença de grumos de trabéculas ósseas.
Como avaliar a celularidade adequada por mielograma?
Celularidade = 100 – idade
Ex.: Pessoa de 40 anos, tem que ter 60% de celularidade.
Medula pode ser hipocelular, normocelular e hipercelular.
Hematopoiese
Processo de formação, desenvolvimento e diferenciação dos elementos formadores do sangue
Eritropoiese – formação das hemácias
Granulocitopoiese – formação dos granulócitos
Monocitopoise – formação dos monócitos
Trombopoises – formação das plaquetas
Originam-se das células tronco multipotente e de sua capacidade de renovação.
A célula tronco tem um marcador de superfície, que é o CD34+, sinal de imaturidade. A partir da diferenciação da célula tronco, ela perde o CD34+ e passa a apresentar o CD38+.
Para transplante, o ideal é CD34+ porque a renovação dessas células é mais intensa, o que permite a renovação e posteriormente o povoamento.
As células do sangue podem ser identificadas no sangue a partir da expressão das proteínas de membrana, que são identificadas a partir da Citometria de Fluxo. O citômetro percebe um anticorpo, que se ilumina, marcando a proteína. 
Ex.: Anticorpo anti-CD34 liga-se ao CD34 e é marcado na citometria de fluxo.
Fontes de célula tronco hematopoiética
Sangue periférico (aferese)
Medula óssea
Cordão Umbilical
Conceitos em transplante de CTH
Na prática, usa-se as células tronco para transplantes
Condicionamento: regime de preparação que objetiva erradicas células malignase suprimir as células imunocompetentes do hospedeiro. 
Mobilização: deslocamento de parte das células tronco para o sangue periférico, a fim de que possam ser extraídas. Por quimioterapia e/ou GCSF.
Homing: Capacidade que a CTH tem de migrar direccionalmente e encontrar seu nicho
Pode ser fisiológico ou experimental ou clínico
Enxertia: Reconstituição hematopoiética dos elementos sanguíneos
A célula tronco é transplantada para sangue periférico e depois entra na medula óssea. Ela vai pela corrente sanguínea e vai fazer a migração para a medula óssea a partir de quimioatratotes. Células do estroma e osteoblastos produzem SDF 1, que atrai a célula tronco a partir do receptor CXCR4. Ela identificará que o gradiente dessa substancia esta aumentada na medula óssea, migrando para la - a célula tronco se aloja onde há mais SDF 1, já que haverá mais interação com o CXCR4. O nome desse espaço é nicho hematopoiético.
As células do estroma podem ser induzidas a atrair células tronco e liberam SDF 1 em situações de estresse ou trauma, onde necessita-se um recrutamento de mais células tronco. Quimioterapia, infecção, queimadura, inflamação são circunstâncias que podem gerar estresse.
Tráfego Bidirecional: Medula Óssea ↔ Periferia
Homing
“Steady state egress” (“Saída em estado estacionário”): a célula tem um pequeno fluxo de entrada e de saída
Recrutamento induzido por estresse
Mobilização clínica (TMO)
Homing é regulado por SDF 1 (que é o mesmo que CXCL 12). É produzido por todas as células do endotélio e também pelos osteoblastos. Atrai CXCR4 exibido pelas células tronco hematopoiéticas.
A célula tronco se fixa no seu nicho. Ela tem auto-renovação estimulada a partir da mobilização.
Mecanismos Reguladores do Destino da CTH:
Etapas: adesão, rolamento e cruzamento da barreira endotélio medular, migração para nicho periendostal e ancoragem no nicho.
O nicho atrai a célula tronco e a mantém fixada, em estado quiescente, sem se multiplicar. Para que ela se auto-renove, a célula tronco deve vencer a barreira de fixação, isto é, se soltar do endotélio. 
O endotélio expressa ligantes como VCAM1 e as seletinas, que se ligam à célula tronco, ancorando-a – processo de adesão.
O nicho hematopoiético fica na região endostal	 - região delimitada pelos osteoblastos e vasos. É lá que a célula tronca inicia o processo de diferenciação e de autorrenovação. 
Além do SDF, outros atraentes, são o ácido hialurônico/osteopontina (produzidos pelo CD44) – importante para os osteoblastos, principalmente para fixar a célula tronco de medula ossea.
Nicho hematopoiético: regula negativamente proliferação e diferenciação, visando manter pool de CTH quiescente, com potencial para migrar e desenvolver.
Elementos
Osteoblastos
Células tronco – no espaço periendostal, ou seja, delimitado osteoblasto e pela presença de vasos e pela presença de outras células.
Células com características de fixação.
Células com função de liberar essa célula e induzir a multiplicação. 
Nestin+ Célula tronco mesenquimal: produz adipócitos, ossos e cartilagem.
Quando faz-se uma cirurgia que precisa de uma grande cicatrização, utiliza-se fragmentos de medula óssea para capturar o Nestin+ e utilizá-lo para produzir tecido adiposo, ósseo ou de cartilaginoso.
Grande interação com a célula tronco hematopoiética
Regula negativamente a proliferação e diferenciação (interações e adesão)
Mantem o pool de CTH quiescentes com potencial para depois migrar e se desenvolver, funcionando como um reservatório de células
Ela tem uma proteína (Nestin) que brilha verde na bioluminescência
Fica no espaço perivascular
Invervação do sistema nervoso central (simpático)
Receptores beta 2 e beta 3 adrenérgicos.
Ficam próximas à CTH
Expressam genes de retenção no nicho
Disfunção autonômica – diabéticos
Têm dificuldade em inibir o efeito de Nestin+ 
Dificuldade, portanto, em liberar as células tronco hematopoieticas
Pior resposta à cicatrização e infecção
Estimuladas por macrófagos – na ausência dele a Nestin+ para de funcionar
Uma das estratégias para liberar as células tronco na circulação periférica é tirando os macrófagos do nicho.
A Nestin+ com a invervação, uma vez que há estimulo de invervação ou eu dou para o paciente uma substância chamada GCSF, há redução da ação da Nestin+ para que a célula tronco saia do nicho e possa se multiplicar.
Macrófago na medula óssea – osteomac produz uma substância não identificada que mantem o funcionamento de Nestin+ e de osteoblastos. Ele sai por estímulo de fatores de crescimento , como m M-CSF ou o G-CSF. 
Nestin+ é uma célula tronco mesenquimal com grande importância na manutenção de um pool de células tronco. Os mecanismos para inibição dela, a fim de permitir diferenciação e multiplicação são, ativação do SNS, estresse, uso da fatores estimuladores de colônia.
CAR – célula reticular produtora de CXCL12 ou SDF 1.
Função de produzir SDF1 e atrair a célula tronco para seu nicho hematopoiético
Sistema nervoso simpático inverva a Nestin+. 
Há mais mobilização de células tronco no período noturno (receptor beta3) ou em situação de estresse (receptor beta 2). Ou seja, o Nestin+ está segurando menos a célula tronco de madrugada, porém o exame é feito no período da manhã por fins práticos.
Fator estimulante de colônia de granulócitos – Granulokine - Estimula a célula tronco a se diferenciar, estimula o receptor beta 2 de Nestin+ então tende a liberar a célula tronco. Este fator estimulador de colônia faz com que osteomac desapareça, estimulando, mais uma vez, a liberação da célula tronco. 
Cálcio
Uma das características da célula-tronco e uma das coisas que faz com que ela migre para a célula óssea é que, além de detectar SDF 1, ela é sensível a Ca2+. Isso explica porque em um primeiro momento não é possível fazer com que células-tronco migrem para os ossos nos fetos mais jovens – baixa formação óssea.
Indivíduos nos quais as células tronco são incapazes de reconhecer o Ca2+ tem menos células tronco.
A quantidade de cálcio é mais alta na linha de osteoclastos. 
PTH – paratormônio: Estimula a Nestin a formar osteoblasto e estimula o osteoclasto a remodelar o osso.
Osteoblasto forma, junto com Nestin, o ancoramento da célula tronco. Já o osteoclasto, com sua capacidade de remodelamento, é capaz deliberar a célula tronco do ponto onde ela está fixada.
PTH 
Estimula a célula Nestin à formação de osteoblasto – formação de mais nichos, garantindo maior presença de células tronco.
Estimula osteoclasto a remodelar osso – liberação dessas células tronco do nicho para auto replicação e diferenciação
Resultado: PTH aumenta o pool de células. Poderia ser utilizado para melhorar a enxertia dos pacientes.
Não é usado na prática clínica por conta do custo e dos efeitos colaterais, mas seria possível.
Osteoclasto, mediante estresse, rompe as coenxinas 43 e 45 e inibe a expressão de SDF-1. 
Adipócito: É possível que os adipócitos também possuam estímulo para ancorar as células tronco, já que indivíduos com poucos adipócitos ou com lipodistrofia tem uma atividade mais intensa de células tronco.
A célula tronco precisa de nutrientes propícios para não sofrer estresse. A célula tronco é uma célula primitiva em termos de mecanismos de defesa e de preservação. São mecanismos piores que nas células mais maduras. A hipóxia é uma forma de preservar a célula tronco, porque ela consegue manter a proteção da célula tronco contra o estresse oxidativo e promove quiescência. A célula tronco é capaz de detectar a hipóxia a partir de receptores para HIF1-alfa, o que aumentará SDF 1 e o homing da CTH para a medula óssea.
Hipóxia também está relacionada ao aumento da produção de osso e de vasos, o que aumenta a disponibilidade de nicho.
CAR – célula responsável pela produção de SDF1 
Fatores que interferem no homing/pega
Alguns pacientes, após o transplante de célula tronco, não “enxergam” essas células. Então o paciente fica com a medula destrída, de modo que deve-se estimular a enxertia daquelas células.
Deleçãodo receptor sensor = menor pool de CTH
Estimulo = elevação do CTH
Fatores que interferem no homing/pega: irradiação/QT x CTH (condicionamento mielobrativo)
Enxertia está relacionado com o tipo de condicionamento, e este deve ser um que destrua as células do paciente e que faça outras coisas como destruir a barreira endotélio-medular (aumenta GCSF – fator estimulador de granulócito - que estimula a reprodução de granulócitos, aumentando mobilização e homing - a quimio torna o nicho mais receptivo para CTH e aumenta a expressão de SDF-1)
Lembrado que a célula deve ser CD34 – se não, provavelmente não expressara CXCL4 para reconhecimento por SDF1.
Homing envolve a presença de um ambiente receptivo, espaço dentro desse ambiente, célula suficiente para ocupar esse espaço, a célula ter características de identificação do SDF1 e o nicho deve ser alterado pelo estimulação de GCSF que aumenta a replicação, impedindo que as células que chegam fiquem quiescentes. 
Mobilização
Existe uma capacidade fisiológica de mobilização das CTHs, por estimulação dos fatores estimuladores de colônia em razão de estresse.
Para transplante, é necessário estimular fatores formadores de colônia para pegar célula tronco no sangue periférico
Aférese – coleta de célula-tronco a partir do sangue da veia.
Injeta-se fator de colônia no paciente, que ativa um neutrófilo o qual produz enzimas que inativam o SDF1 – via catepsina G e elastase – e diminuem a a ação da VCAM. O bloqueio da célula tronco faz com que a célula tronco identifique essa queda e ela mesmo vai expressar proteínas como MMP-9, e vai passar a degradar SDF 1 e expressar CD26, que faz com que ela se livre desse nicho e caia na corrente sanguínea para que ela possa ser coletada (processo denominado mobilização).
Neutrófilo – estimulado por granulokin ou estresses de modo geral. 
Estímulo de neutrófilo – infecção e inflamação ou artificialmente, granulokine.
Mecanismos dentro da célula troco de auto-renovação e mecanismos de diferenciação
Gene PU1 diferenciação mieloide (células brancas)
Gene GATA 1 diferenciação eritropoietica (plaquetas e hemácias)
Aplicação prática do conhecimento 
Dá-se granulokin pro paciente, inibindo a formação do macrófago e do nestin+, de modo que a célula tronco hematopoiética vai se multiplicar e vai cair na corrente sanguínea periferica e pode ser captada por aférese.
Plerixafor é uma droga que inibe o CXCR4, o que impede o reconhecimento de SDF1.