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SDE0922 – GENÉTICA Aula 06: Mutação, Reparo e técnicas de Biologia Molecular Profa Dra Joana Mona e Pinto joanamona@live.estacio.br Genética 2 Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular Plano de aula 6 Conhecer o significado de código genético através de estudos experimentais que permitiram sua demonstração; Relacionar código genético com a expressão gênica ou síntese de proteínas pela célula; Entender como acorre o controle da atividade gênica através de moléculas ou sequências capazes de inibir ou favorece-la; Entender os mecanismos que podem levar ao aparecimento de mutações e como podem ser reparadas, ou não, nas células. Genética 3 Plano de aula 7 Definir é a tecnologia do DNA Recombinate; Descrever as principais ferramentas utilizadas na Tecnologia do DNA Recombinante; Identificar pelo menos três produtos resultantes da Tecnologia do DNA Recombinante. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular Genética 4 Material Didático Capítulo 2 2.10 Mutação e mecanismos de reparo 73 2.11 Fundamentos das tecnologias do DNA recombinante 79 2.11.1 Técnica de eletroforese em gel de agarose 80 2.11.2 Southern blotting 81 2.11.3 Northern blotting 82 2.11.4 Western Blotting 82 2.12 Transformação de E. coli 83 2.13 Reação em cadeia da polimerase (PCR) 84 2.13.1 Transcrição reversa PCR (RT-PCR) 86 2.13.2 Real time RT-PCR 87 2.14 Clonagem de DNA 88 2.14.1 Bibliotecas de DNA 89 2.15 Sequenciamento de DNA 90 Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular REPLICAÇÃO DO DNA Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular Duplicação do DNA Genética 6 Duplicação do DNA é semiconservativa; Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular Duplicação do DNA Genética 7 Duplicação do DNA é semiconservativa; Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular Duplicação do DNA Genética 8 Meselson e Stahl (1958) Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular Mutações Genética 9 As células humanas sofrem, em cada uma delas, cerca de 500.000 lesões moleculares. A taxa de reparo das células diminui conforme a idade da célula, o que provoca um acúmulo de danos ao DNA a um ponto em que a célula terá apenas três destinos possíveis: Entrar em senescência (dormência); Iniciar o processo de morte celular chamado de apoptose; A célula torna-se cancerosa. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 9 Mutações e mecanismos de reparo Genética 10 A diversidade de sequências de DNA podem se originar de eventos como a ação de transposons e erros na replicação ou na recombinação; Entretanto, o fator mais importante de variação se origina de falhas no reparo do DNA. Por mais fiel que possa ser a DNA polimerase II, o genoma é muito extenso. Mesmo em condições normais de funcionamento, haverá incorporação de bases incorretas. A maioria delas é corrigida por mecanismos de reparo, mas o DNA também está sujeito ao ataque de agentes exógenos e endógenos. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 10 Mutações e mecanismos de reparo Genética 11 Ataque de agentes exógenos: A ação da radiação ionizante, como os raios gama e raios X que podem causar quebras de fita simples ou dupla no esqueleto de açúcar e fosfato; Radiação ultravioleta, boa parte dos raios ultravioletas é absorvida pela atmosfera terrestre (cerca de 99%), uma fração de UV B atinge a superfície terrestre e é o agente principal de dano ao DNA, pois provoca uma ligação cruzada entre pirimidinas (citosina e timina); Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 11 Mutações e mecanismos de reparo Genética 12 Ataque de agentes exógenos: Compostos químicos ambientais, que incluem toxinas como a aflotoxina que pode ser encontrada em alguns fungos que parasitam o amendoim, e compostos químicos presentes na fumaça de cigarros – podem causar uma ligação cruzada entre as bases dentro da mesma fita ou entre fitas diferentes. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 12 Mutações e mecanismos de reparo Genética 13 As alterações no DNA podem também serem produzidas pela incorporação de nucleotídeos errados durante a replicação do DNA. Os mecanismos de revisão de bases corrigem a grande maioria dos erros de pareamento, mas alguns podem ainda persistir gerando variação na sequência ou gerar células cancerosas dependendo de em qual gene ela ocorra e, dentro dele, em qual posição na sequência. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 13 Mutações e mecanismos de reparo Genética 14 Em células humanas, existem pelo menos seis tipos diferentes de reparo de DNA. Corrigem bases anormais modificadas quando presentes em apenas uma das fitas, utilizando a fita complementar normal como base para a correção das bases. Quando ocorrem danos nas duas fitas, são necessários outros mecanismos. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 14 Reparo de danos - Apenas uma fita afetada Genética 15 Reparação de base por excisão de base: removem as bases anormais quebrando a ligação base-açúcar, corrigindo os danos mais comuns de DNA, que, em humanos é estimado cerca de 20.000 bases alteradas em cada célula nucleada. Excisão de nucleotídeos: na qual há a remoção dos dímeros de timina (provocado pela ação do UV B); Esse mecanismo remove uma grande parte da sequência ao redor do dano; correção utilizada também nos eventos de quebra de uma única fita de DNA. Mismatch repair: reparo de pareamentos errados, também feito por excisão de nucleotídeos; Reversão direta de dano ao DNA: mecanismo de reparo menos frequente; (EX.:retiradas de grupos metil de guaninas que foram erroneamente metiladas) Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 15 Reparo de danos - apenas uma fita afetada Genética 16 Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 16 Reparo de danos – Duas fitas afetadas Genética 17 Recombinação homóloga: uma fita do cromossomo homólogo invade o DNA danificado, servindo como modelo para o reparo; União de extremidades não homólogas: grandes complexos de várias proteínas são montados nas extremidades das fitas de DNA danificadas e a DNA ligase refaz a ligação entre as extremidades não importando a sequência. Mecanismo de redução de danos - sempre haverá uma perda da sequência nas extremidades da fita. Menos prejudicial do que deixar as fitas rompidas sem reparo. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 17 Reparo de danos – duas fitas afetadas Genética 18 Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular Reparo de danos – duas fitas afetadas Genética 19 Outro mecanismo é responsável pela correção de erros de incorporação de bases durante a replicação do DNA. Dependente de pelo menos cinco enzimas em humanos e, quando as células são deficientes neste tipo de reparo, elas apresentam taxas de mutação de 100 a 1 000 vezes maiores do que o normal. Em humanos, esta deficiência causa a Síndrome de Lynch, que aumenta o risco de muitos tipos de câncer, particularmente cânceres no intestino grosso (cólon). Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 19 Genética 20 Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR E CLONAGEM 20 Tecnologias do DNA recombinante Genética 21 O DNA era o componente celular mais difícil de ser analisado; Sua sequência de nucleotídeos de enorme tamanho; Analisada por meios indiretos: sequência de proteínas e análise genética; A partir da década de 70 novas tecnologias foram desenvolvidas permitindo o isolamento e a purificação de genes específicos num processo chamado de clonagem gênica. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 21 Tecnologias do DNA recombinante Genética 22 Muitas das técnicas que surgiram para o conhecimento da molécula de DNA são provenientes da Microbiologia, Bioquímica, Imunologia eGenética Microbiana. O DNA tornou-se mais fácil de ser analisado, sendo possível isolar regiões específicas, obtê-las em grande quantidade e determinar a sua sequência numa velocidade de milhares de nucleotídeos por dia. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 22 Tecnologias do DNA recombinante Genética 23 A biologia molecular passou por uma revolução entre as décadas de 1970 e 1980; Foram desenvolvidas metodologias de manipulação genética, através de técnicas como a transformação genética de Escherichia coli, as técnicas de corte e união de moléculas de DNA e a reação de polimerase em cadeia. Tecnologia do DNA recombinante: ampla aplicação! Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 23 Tecnologias do DNA recombinante Genética 24 Aplicações: Estudo de mecanismos de replicação e expressão gênica; Determinação da sequência de um gene e consequentemente da proteína que ele codifica; Desenvolvimento de culturas microbianas (produção de substâncias úteis em grandes quantidades: insulina humana, hormônio de crescimento, vacinas e enzimas industriais); Possível realizar investigação de paternidade; Diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas através da análise de DNA. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 24 A clonagem do DNA Genética 25 A clonagem do DNA envolve a separação de um gene ou um segmento de DNA específico de um cromossomo maior, para depois ser ligado a uma pequena molécula de DNA- vetor que por fim, é adicionada a uma cultura celular onde será replicando milhares ou milhões de vezes por meio do aumento no número de células ou da criação de cópias múltiplas do DNA clonado em cada célula. O resultado é a amplificação seletiva de um gene ou segmento particular de DNA. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular Clonagem de organismos ≠ clonagem de DNA 25 A clonagem do DNA Genética 27 A clonagem do DNA de qualquer organismo pode ser dividida em cinco etapas gerais: 1- Cortar o DNA em localizações específicas; 2- Selecionar uma molécula de DNA capaz de auto-replicação; 3- Unir fragmento de DNA ao DNA vetor (plasmídeo); 4- Transferir o DNA recombinante (plasmídeo recombinante) para uma célula hospedeira; 5- Selecionar ou identificar as células hospedeiras que contenham o DNA recombinante. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 27 A clonagem do DNA Genética 28 a) Enzimas: endonucleases de restrição e as DNA ligases. As endonucleases de restrição (também conhecidas como enzimas de restrição) - encontradas naturalmente em bactérias; utilizadas para realizar cortes nas cadeias de nucleotídeos (tanto do RNA quanto do DNA). Essas enzimas reconhecem e clivam o DNA em sequencias de DNA específicas, chamadas de sequencias de reconhecimento ou sítios de restrição, para gerar um conjunto de fragmentos menores. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 28 A clonagem do DNA Genética 29 a) Enzimas: endonucleases de restrição e as DNA ligases. As DNA ligases fazem a união entre o fragmento de DNA a ser clonado e o vetor de clonagem (plasmídeo). b) Vetores de clonagem: o vetor funciona como um veículo que transporta o gene para o interior da célula hospedeira (em geral uma bactéria). Uma molécula de DNA deve dispor de várias características de modo a ser capaz de agir como um veículo para a clonagem de genes. A característica mais importante é que deve ser capaz de se replicar dentro da célula hospedeira, de modo que se possam produzir numerosas cópias de DNA recombinante, sendo capazes de passar para as células filhas. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 29 A clonagem do DNA Genética 30 b) Vetores de clonagem: funciona como um veículo que transporta o gene para o interior da célula hospedeira (em geral uma bactéria). Uma molécula de DNA deve dispor de várias características de modo a ser capaz de agir como um veículo para a clonagem de genes. A característica mais importante é que deve ser capaz de se replicar dentro da célula hospedeira, de modo que se possam produzir numerosas cópias de DNA recombinante, sendo capazes de passar para as células filhas. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 30 31 A clonagem do DNA Genética 32 Um veículo de clonagem também precisa ser relativamente pequeno. Os Plasmídeos: são moléculas de DNA circular que se replicam separadamente do cromossomo bacteriano (trás genes extras). Podem ser introduzidos nas células bacterianas (geralmente uma Escherichia coli) por um processo denominado transformação. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 32 A clonagem do DNA Genética 33 Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular Para assegurar que houve o corte e a união das fitas: a técnica de eletroforese de DNA em gel de Agarose é utilizada. Assim, o recombinante pode ser introduzido na célula hospedeira. Técnica de eletroforese em gel de Agarose Genética 34 Consiste na passagem de fragmentos de DNA em um gel, que possui poros que filtram os fragmentos de DNA dependendo do seu peso molecular, ao serem submetidos a um campo elétrico. (Como o DNA possui carga negativa, decorrente do fosfato de sua estrutura, ele tende a migrar para o polo positivo do campo elétrico) Capacidade de separar fragmentos de uma centena de pares de bases até 20 kb. Para fragmentos menores, pode-se utilizar a poliacrilamida, que possui poros ainda menores. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 34 A clonagem do DNA Genética 35 A estratégia usual é usar um plasmídeo que, além do gene de interesse, tenha também um gene que as células hospedeiras requeiram para o crescimento sob condições específicas. Ex.: um gene que confere resistência a um determinado antibiótico. Apenas as células transformadas pelo plasmídeo recombinante podem crescer na presença daquele antibiótico, selecionando desta forma as células de interesse. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 35 A clonagem do DNA Genética 36 A expressão de genes clonados produz grandes quantidades de proteína, e isso se torna de objeto de interesse quando a proteína possui valor comercial, terapêutico ou de pesquisa. Podemos, através desta tecnologia, produzir grandes quantidades de proteínas comercialmente úteis, planejar microrganismos para tarefas especiais e construir plantas ou animais com características úteis na agricultura e medicina. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 36 Tecnologia do DNA Recombinante Genética 37 Tecnologia do DNA Recombinante tem sido aplicada em diversas áreas, em todas elas somando grandes benefícios. Produção de substâncias úteis (farmacêuticas ou não), cultivo de bactérias especializadas e melhoramento genético artificial de plantas e animais importantes sob ponto de vista econômico. Sua aplicação também se estende à área médica: onde pode ser usada até mesmo para corrigir ate mesmo defeitos genéticos humanos. Uma das grandes novidades do uso da tecnologia é a sua utilização na perícia forense, onde tem sido um instrumento de investigação criminal e para identificação de restos humanos. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 37 Transformação de E. coli Genética 38 Uma técnica importante para a amplificação de fragmentos de DNA é a transformação, que consiste na introdução de um DNA estranho em uma célula bacteriana capaz de recebê-lo (célula competente). As primeiras tentativas de transformação de E. coli não obtiveram sucesso e, até então, acreditava-se que a bactéria E. coli era refratária (não aceitava) à transformação. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 38 Transformação de E. coli Genética 39 No início da década de 1970, Higa e Mandel descobriram que um tratamento com CaCl2 (cloreto de cálcio) permitia que as células de E. coli recebessem plasmídeos de DNA. Muitas bactérias possuemsistemas de restrição, é responsável pelo reconhecimento e degradação de DNA não nativo. Assim, normalmente são usadas linhagens de E. coli deficientes deste sistema de modo que possam ser utilizadas como hospedeiras transformáveis. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 39 Transformação de E. coli Genética 40 Outra técnica que pode ser usada para a transformação é a eletroporação, que se baseia em pulsos de alta voltagem podem induzir as membranas plasmáticas a se fundirem e a também captarem DNA exógeno. Uma porcentagem destas células torna-se estavelmente transformada e pode ser selecionada se um marcador genético adequado está incluso ao fragmento de DNA captado pelas células. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 40 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Genética 41 Uma das técnicas mais importantes para a engenharia genética é a reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês polymerase chain reaction); A reação envolve dois iniciadores oligonucleotídeos: PRIMERS (17 a 30 nucleotídeos de comprimento) - os quais flanqueiam a sequência de DNA que se deseja amplificar; Os iniciadores pareiam com os lados opostos do DNA após a sua desnaturação e orientam a síntese do DNA pela polimerase na região entre os iniciadores. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 41 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Genética A reação de extensão cria uma região alvo com duas fitas, e cada uma delas pode ser desnaturada para o segundo ciclo de hibridação e extensão. O terceiro ciclo produz duas moléculas de fita dupla que compreendem precisamente a região alvo em dupla hélice. Repetindo este processo, há um rápido acúmulo exponencial da sequência desejada e, após 22 ciclos, pode-se alcançar uma amplificação na magnitude de 106 vezes. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 42 42 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Genética 43 A técnica de PCR pode ser utilizada no diagnóstico de uma grande variedade de doenças, entre elas leucemia e linfomas, uma vez que estas doenças são decorrentes de modificações da estrutura do DNA. A técnica pode ser utilizada na detecção e identificação de infecções bacterianas e virais. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 43 Bibliotecas de DNA Genética 44 Todo o genoma de um organismo pode ser clonado. Uma coleção de clones de DNA pode ser chamada de biblioteca de DNA; Pode-se utilizar também o cDNA para a montagem de uma biblioteca que representará o transcriptoma da célula em estudo - No caso das bibliotecas de cDNA, essas portam cópias de DNA complementar de uma população de mRNA de um determinado grupo de células ou tecido. Vantagens : o DNA eucariótico - ao utilizar o mRNA, suas sequências não terão os íntrons, facilitando a análise. Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular 44 Bibliotecas de DNA X Bibliotecas de cDNA Genética 45 Aula 06: Mutação, reparo e técnicas de biologia molecular AVANCE PARA FINALIZAR A APRESENTAÇÃO. VAMOS AOS PRÓXIMOS PASSOS? Leitura do livro didático: 3. Padrões de herança monogênica 3.1 Padrões de herança monogênica; 3.2 Heredograma; 3.3 Herança autossômica e ligada ao cromossomo X; 3.3.1 Padrões de herança autossômica recessiva; 3.3.2 Padrões de herança autossômica dominante; 3.4 Herança ligada ao cromossomo X; 3.4.1 Padrão de herança recessivo e dominante em desordens ligadas ao X; 3.4.1.1 Desordens recessivas ligadas ao X; 3.4.1.2 Desordens dominantes ligadas ao X; 3.5 Padrões de herança pseudo-autossômica; 3.6 Herança ligada ao cromossomo Y 46
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