TÉCNICAS MOLECULARES

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TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
BIOLOGIA MOLECULAR
O QUE É?
Ramo da Biologia que explora a vida em escala molecular.
QUAL O OBJETIVO?
Compreender a maquinaria dos sistemas biológicos (com especial foco no estudo da estrutura e função do material genético)
COMO ATUA?
Através de investigações moleculares, possibilita encontrar: novas maneiras de desenvolver tratamentos, fabricação de remédios, detecção de doenças, melhoramento genético e ainda outras soluções alternativas para problemas de saúde com base no DNA.
DNA
Estrutura composta por nucleotídeos;
Existe no interior do núcleo celular, nas mitocôndrias e nos plastos;
Contém a informação genética dos seres orgânicos;
Possuem as informações para produção das proteínas.
A molécula que contém a informação hereditária é o DNA.
Mas como o DNA passa as “coordenadas” para o organismo?
DOGMA DA BIOLOGIA MOLECULAR
COMO SURGIU?
Postulado por Francis Crick em 1958.
O QUE É?
Sistema que explica como ocorre o fluxo de informações do código genético.
COMO OCORRE?
o fluxo da informação genética segue o seguinte sentido: DNA → RNA → PROTEÍNAS.
TÉCNICAS MOLECULARES
O QUE SÃO?
Um campo de estudo que abrange várias áreas da Biologia e da Química (em especial a Genética e Bioquímica).
QUAL O OBJETIVO?
Obter, identificar e caracterizar determinados genes.
Na Microbiologia, pode se isolar organismos patogênicos (ou de seus genes), como vírus e bactérias.
COMO SÃO EXECUTADAS?
Existem vários métodos clássicos para a obtenção dos ácidos nucléicos a partir de amostras biológicas em geral (com pequenas variações entre si,).
DNA
Extrair
Identificar
Visualizar
Amplificar
O QUE É?
É a difusão de moléculas de DNA idênticas, utilizando a propagação natural das células para formar indivíduos geneticamente idênticos ao inicial;
COMO OCORRE?
O experimento de clonagem gênica consiste em introduzir o gene dentro de células bacterianas e isolá-las em colônias. As células de cada colônia são idênticas entre si;
QUAIS AS APLICAÇÕES?
Obter uma quantidade maior de um ou mais genes de interesse.
CLONAGEM
A clonagem consiste em duas etapas básicas:
Ligação entre um fragmento de DNA (Inserto) com outra molécula de DNA (vetor) para formar uma “quimera” (molécula de DNA recombinante)
A molécula quimera é transportada para dentro de uma célula hospedeira (geralmente uma bactéria), ocorrendo o processo de transformação. 
A célula que recebeu o DNA recombinante é chamada de “CÉLULA TRANSFORMADA”, a qual sofre muitos ciclos de divisão, produzindo várias cópias do DNA recombinante
1996 - 2003
ISOLAMENTO DO DNA
Remoção de contaminantes
Qualidade e pureza de DNA
Os passos básicos envolvidos na extração do DNA consistem de:
Lise celular;
Remoção de lipídios;
Remoção de proteínas;
Remoção do RNA;
Precipitação/Eluição de DNA.
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
DNA
Primers
Taq DNA polimerase
MgCl2
dNTPs
Tampão
Amplificação in vitro de fragmentos de DNA específicos;
A técnica consiste em ciclos repetitivos;
Cada ciclo está dividido em três passos:
Desnaturação
Anelamento
Extensão
Tubo de ensaio
Termociclador
Aquecimento:
Separação da fita dupla
Resfriamento:
Anelamento dos primers
Aquecimento:
Amplificação da fita pela DNA polimerase
Cada fita gera duas cópias
ELETROFORESE
Técnica usada para separar fragmentos de DNA de acordo com seu tamanho.
As amostras de DNA são carregadas em poços (cavidades) localizados numa das extremidades de um gel, e uma corrente elétrica é aplicada para fazê-las avançar pelo gel; 
Amostra
Corante
Marcador: Ladder
DNA padrão
Gel
Fixador
ELETROFORESE
PCR EM TEMPO REAL
Grande avanço nos métodos moleculares de auxílio diagnóstico;
Utiliza um equipamento com sistema de monitoramento da emissão da fluorescência;
O resultado é visualizado em Tempo Real durante a amplificação da sequência de interesse;
Gera resultados quantitativos com maior precisão;
Vantagens: facilidade de quantificação, rapidez, melhor controle de qualidade no processo, menor risco de contaminação.
PCR EM TEMPO REAL
OBRIGADO!