Resumo de Coloração Histologia

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COLORACION GIEMSA
FUNDAMENTO
La tinción de Giemsa es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos,cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Este método tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las rickettsias localizadas dentro de las células huéspedes. La coloración de giemsa se emplea también para teñir frotis de sangre en el examen para protozoos
Estos poliorganismos adquieren una coloración diferencial y se ven dentro del citoplasma de la célula huésped. La técnica de Giemsa está formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte básico y la eosina como tinte ácido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromático, de ahí que muchas estructuras se tiñan de púrpura y no de azul. El pH de la solución de coloración es crítico y se debe ajustar idealmente según diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9.
REACTIVO: GIEMSA
PROCEDIMIENTO:
Desparafinar e hidratar.
Aplicar solución de trabajo de Giemsa durante 10 minutos.
Deshidratar con alcohol absoluto, 3 cambios.
Aclarar con xilol, 3 cambios.
RESULTADOS:
Citoplasma: Rosa
Núcleos: Azul
Eritrocitos: Rosa - Naranja
Gránulos De Las Células Cebadas: Púrpura
Bacterias: Azul
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COLORACIÓN DE GRAM
FUNDAMENTO
De gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.
COLORACION DE GRAM
OBJETIVOS
• Utilización de técnicas sencillas para la observación de microorganismos
• Conocer o manejo del microscopio óptico para la observación de bacterias (importancia del objetivo de inmersión)
•	Conocer	y		manejar	las	unidades	de	medida	de	las	células	y	establecer comparaciones		entre tamaños de procariotas y de eucariotas
• Reconocer los distintos modelos de pared bacteriana.
MATERIALES
Mechero Bunsen o de Alcohol
Asa de Siembra o aguja enmangada
Pinzas
Portaobjetos
Muestras bacterianas de origen natural: Yogur, Sarro Dental, Suelo, etc.
Palillos
Microscopios
Aceite de inmersión
Soporte de Tinciones
Goteros
Pinzas
Agua destilada
Colorantes para Tinción: Solución de cristal Violeta Lugol Safranina Etanol 95%
PROCEDIMIENTO
PASOS PARA LAS MUESTRAS :
1. En unas gotas de agua colocadas sobre un portaobjetos, disuelve una pequeña cantidad de yogur con ayuda de un palillo higiénico. Haz lo mismo con la muestra de sarro dental extraído de la boca de alguien.2. Prepara una fina extensión (frotis), en otros portas, dejándolos secar.3. Fija este frotis dándole varios pases a los portas sobre la llama del mechero, con la muestra hacia arriba.
TINCIÓN:
Cubre ambos frotis con cristal violeta durante 3 min. Se retirará el colorante mediante un suave lavado con agua, deslizando el agua sobre el porta, para non desprender la muestra. Se 2. cubrir ahora con Lugol durante 1 min., y después se realizará otro lavado suave. Todas las células se teñirán de violeta.
Se retirará el colorante con etanol, goteándolo por el portaobjetos, hasta que las gotas que salen no tengan casi color. Las células Gram- pierden el colorante violeta y quedarán incoloras. Las Gram + seguirían violeta.
3. Añade una gota de agua a la preparación y cubre las preparaciones 2 min. con safranina (colorante de contraste). Finalmente, lava el colorante con agua. Este colorante sólo entrará en las bacterias Gram –, que quedarán rojas y las Gram + seguirán violetas.
Seca las preparaciones sobre papel de filtro y obsérvalas con microscopio utilizando el objetivo de inmersión (Observar (100×) Lugol). En esta tinción diferencial las bacterias Gram – aparecen ROJAS y las Gram + VIOLETA.
Tinción negativa
Colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo de un portaobjeto, colocar una
gota de muestra.
2. Realizar frotis.
3. Dejar secar.
Bibliografía: http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.com/p/tincion-de-gram_20.html
RESULTADO:
Gram –: ROJAS
Gram +: VIOLETA.
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COLORACION DE GROCOTT
La plata metanamina de Grocott es un método de tinción especial más empleado para hongos. La reacción tintorial está basada en que, en presencia de ácido peryódico, los polisacáridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehídos; éstos, a su vez, reducen el complejo nitrato-plata metanamina produciendo una coloración de café a negra, debido al depósito de plata reducida en los lugares de localización de los aldehídos.
También se utiliza para la identificación de la melanina.
OBJETIVO:
Demostrar Hongos.
FIJADOR:
Formol al 10%
COLORACION DE GROCOTT
REACTIVOS
Solución de ácido bórico (solución A):
3,09 g de ácido bórico. 250 cc de agua destilada
Solución	de	tetraborato	sódico
(solución B):
4,77 g de tetraborato sódico. 250 cc de agua destilada.
Solución buffer borato (comprobar que
el pH sea 8.2)
13 cc de solución A. 7 cc de solución B.
Solución de plata metanamina
42,5	cc	de	metanamina
(hexametilentetranamina) 3%.
2,5 cc de nitrato de plata 5%. 12 cc de buffer borato (pH 8.2).
PROCEDIMIENTO
Debe evitarse, durante todo el proceso, el uso de instrumentos metálicos, ya que la plata precipitaría sobre ellos.
Desparafinar e hidratar.
Añadir ácido peryódico 0,5%, 12 minutos.
Lavar con agua destilada.
Sumergir los cortes en la solución de plata metanamina, 1 hora mínimo a 60 ºC; a partir de este tiempo comprobar regularmente al microscopio.
Lavar con agua destilada.
Añadir cloruro de oro 1 minuto.
Lavar con agua destilada.
Añadir tiosulfato sódico 3%, 1-2 minutos.
Lavar con agua corriente.
(rojo
Tinción	de	contraste nuclear, hematoxilina, verde luz...), 1 minuto.
Deshidratar, aclarar, montar.
RESULTADOS
Reticulina, Membranas Basales, Hongos, Mucinas, Glucógeno: Negro.
Fondo: Según Tinción De Contraste.
Nucleos: Marrón Oscuro A Negro
COLORACION DE FITE-FARACO
OBJETIVO:
Demostración de BAAR.
FIJADOR:
Formol al 10%.
REACTIVOS:
Agua 50ml.
Fenol (fundido, a baño maría) 2.5ml.
Alcohol ABS 5ml.
Fucsia Acida0.5gr.
Acido Sulfúrico al 5%
Acido Sulfúrico 5ml.
Agua…95ml.
Verde Brillante al 1%
Verde Brillante 1gr.
Agua 100ml.
Solución Xilol-Aceite de Oliva
Xilol 50ml.
Aceite de Oliva 50ml.
TÉCNICA DE FITE FARACO.
PROCEDIMIENTO:
Xilol-Aceite de Oliva a 60*C 30min.
Lavar en Agua Jabonosa.
Lavar en Agua.
Carbol-Fucsina…20min.
Lavar en Agua.
Decolorar con Acido Sulfúrico (por goteo).
Lavar en Agua.
Verde Brillante 1min.
Secar al Aire.
Aclarar y Montar.
RESULTADOS:
BAAR: Rojo Brillante.
Resto del Tejido: Verde.
COLORACION DE P.A.S
FUNDAMENTO
La tinción de PAS (Periodic Acid-Schiff ) es una de las tinciones más comúnmente utilizada en histología y se utiliza para evidenciar la presencia de grupos aldehídos formados por oxidación previa de los hidratos de
carbono.
El fundamento de la reacción consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido peryodico para incrementar el número de grupos carbonilos (aldehídos o cetonas) presentes en ellos. Posteriormente, se trata la muestra con el reactivo de Schiff que reacciona con dos grupos aldehídicos contiguos dando lugar a una coloración rojo-púrpura característica.
El Kit de PAS se compone de todos los reactivos que intervienen en esta tinción.
REACTIVOS DEL KIT
Kit de PAS DC (*)
Xileno mezcla de isómeros DC (*)
Etabol 96% DC (*)
Etanol AbsolutoDC (*)
Eukitt ®, medio de montaje DC
Componentes del Kit
Reactivo A Ácido peryódico
Reactivo B Reactivo de Schiff
Reactivo C Potasio meta-Bisulfito solución
Reactivo D Solución fijadora
Reactivo E Hematoxilina de Mayer
REACTIVOS
Solución de Acido Peryodico al 5%.
Acido Peryodico… 0.5gr.
Agua… 100ml.
Solución de Acido Clorhídrico 1N.
Acido Clorhídrico…83.5ml.
Agua…916.5ml.
Reactivo de Schiff de Coleman.
Fucsina Básica…1gr.
Agua-Caliente a 60C…200ml.
Llevarlo a Punto de Ebullición.
Dejarlo enfriar y luego agregar
Metabisulfito de Potasio…2gr.
Acido Clorhídrico 1N…10ml.
Dejarlo aclarar durante 24Hrs y luego agregar: Carbón Activado…0.5gr.
PROCEDIMIENTO:
Desparafinar é hidratar.
Acido Peryodico 5min.
Lavar en Agua.
Reactivo de Schiff 40min.
Lavar en Agua Caliente 10min.
Hematoxilina 3-8min.
Lavar en Agua.
Deshidratar, Aclarar y Montar.
Bibliografía: http://es.scribd.com/doc/40784447/Tecnicas-histoquimicas
PROCEDIMIENTO 2
Una vez los cortes hayan sido desparafinados y rehidratados, enjuagar con agua destilada
Depositar sobre el corte 10 gotas de Reactivo A. Dejar reaccionar durante 10 minutos.
Lavar con agua destilada.
Depositar sobre el corte 10 gotas de Reactivo B. Dejar reaccionar durante 20 minutos.
Lavar con agua destilada.
Depositar sobre el corte 10 gotas de Reactivo C. Dejar reaccionar durante 2 minutos.
Escurrir el portaobjetos.
Sin lavar, depositar sobre el corte 10 gotas de Reactivo D. Dejar reaccionar durante 2
minutos.
Lavar con agua destilada.
Depositar sobre el corte 10 gotas de Reactivo E. Dejar reaccionar durante 3 minutos.
Hacer virar en agua corriente durante 5 minutos.
Deshidratar utilizando la serie creciente de alcoholes.
Aclarar con Xileno.
Montar con medio de montaje.
Observar al microscopio.
RESULTADOS:
Núcleo : VIOLETA-NEGRO
Polisacáridos Simples (Glucógeno), Mucopolisacáridos Neutros, Mucoproteínas, Membrana Basal, Glucolípidos : ROJO-PÚRPURA
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COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, usada para la identificación de microorganismos patógenos, como M. tuberculosis o el género Apicomplexa (coccidios intestinales) entre otros.
Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes: Franz Ziehl, un bacteriólogo, y Friedrich Neelsen, un patólogo.
FUNDAMENTO
Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos.
Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tinción de contraste.
TÉCNICA
Los reactivos necesarios para su realización son los siguientes:
ácido periódico 58% carbol fucsina de Ziehl culina (fucsina fenicada). Preparar mezclando en el orden dado:
0,5 g fucsina básica
50 cc agua destilada
5 cc etanol absoluto
28,5 g cristales de fenol derretidos
hematoxilina
alcohol ácido 1%:
alcohol de 35º
ácido clorhídrico
PROCEDIMIENTO
El procedimiento es el siguiente:
desparafinar e hidratar los cortes
ácido periódico 5%, 10 min
lavar con agua destilada
fucsina fenicada, 15 min
decolorar en alcohol ácido al 50%
lavar con agua destilada
hematoxilina, 10 min
azulidificar con, por ejemplo, carbonato
de litio
deshidratar,	aclarar	y	montar preparaciones
VARIANTE CLÁSICA O "EN CALIENTE“
Éstas variantes son para preparaciones citológicas.
Hacer un frotis de la muestra.
La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al portaobjetos. Un frotis muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso puede desprenderse del portaobjetos durante la tinción.
Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción con los extendidos hacia arriba. Nunca tiña más de 12 portaobjetos a la vez.
Dejar el frotis sobre el puente de tinción.
Aplicar fucsina-fenicada.
Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos. Mantenga el calor durante este período.
Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos).
Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tiña la pared
celular de la bacteria. No deje que hierva o se seque el colorante.
Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría hasta que toda la tinción libre quede lavada. Lave suavemente de manera que el extendido no se barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua.
Decolorar con alcohol-ácido.
Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como alcohol ácido y manténgalo sobre el portaobjetos durante 7 minutos. Si no se decolora suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teñido. Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua. Si los portaobjetos aún están rosa, aplique una cantidad adicional de la solución decolorante de 1 a 3 minutos.
Aplicar azul de metileno (1 minuto).
Enjuagar con agua
Observación
EN "FRÍO" (TINCIÓN DE KINYOUN)
fenol	y
Hacer un frotis.
Dejarlo en el puente de tinción.
Aplicar	fucsina-fenicada	(solución	con mayor concentración de fucsina).
Dejar en vasos coplin durante 20 minutos.
Decolorar con alcohol ácido.
Lavar con agua del grifo.
Contrastar con azul de metileno
RESULTADOS