IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM POSITIVOS ROTEIRO DE P_RATICA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA: INTRODUÇÃO LABORATÓRIO CLÍNICO
CURSO: BIOMEDICINA
PROF.	Dr. RENATO MOTTA NETO
PRÁTICA: IDENTIFICAÇÃO DE COCOS GRAM-POSITIVOS
JUSTIFICATIVA
Os cocos gram-positivos estão amplamente distribuídos na natureza e podem ser isolados de ambientes ou como habitantes comensais de pele, mucosas e outros sítios corpóreos dos seres humanos e animais. Os cocos gram-positivos de importância médica estão classificados em estafilococos, estreptococos e enterococos; eles produzem uma variedade de doenças, incluindo foliculite, furúnculo, carbúnculo, erisipela e celulite, além de pneumonia e bacteremia. Embora as bactérias gram-positivas possam causar infecções por multiplicação local e sistêmica, algumas delas podem multiplicar-se em sítio localizado e exercer ação patogênica por produção de exotoxinas ou enzimas que atuam a distância. As toxinas estafilocócicas são responsáveis por intoxicações alimentares, síndrome de pele escaldada e síndrome do choque tóxico.
Em vista do número crescente de espécies de estafilococos que estão sendo reconhecidas como causadoras de infecções humanas e do achado de resistência a múltiplos agentes antimicrobianos, tanto em isolados usuais quanto em infreqüentes, é imperativo que o microbiologista clínico esteja familiarizado com os métodos atuais de caracterização desses microrganismos. No caso dos estreptococos, as modificações no espectro de doenças e o aumento na resistência a antimicrobianos entre essas bactérias exigem amplo conhecimento desse grupo de microrganismos.
EXECUÇÃO:
Etapa 1: Prova da Catalase
A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e oxigênio. A prova da catalase é utilizada com freqüência para diferenciar membros da família Micrococcaceae de membros da família Streptococcaceae de cocos gram-positivos. Para realização da prova, de preferência não devem se retirar colônias crescidas em ágar-sangue por que os fragmentos do ágar podem acidentalmente se misturar com as colônias e produzir um resultado falso-positivo.
Procedimento:
Com uma alça bacteriológica em agulha ou com um palito de madeira, transfira parte do centro de uma colônia para uma lâmina;
Adicione uma gota de peróxido de hidrogênio a 3% e observe a formação de bolhas.
Interpretação:
Resultado positivo – Aparecimento rápido e produção sustentada de bolhas de gás ou efervescência.
Resultado negativo – Ausência de bolhas de gás.
Etapa 2: Prova da Coagulase
A coagulase é uma proteína com atividade similar à protrombina, capaz de converter o fibrinogênio em fibrina, resultando na formação de um coágulo visível em sistemas adequados. A prova da coagulase é utilizada para identificar Staphylococcus aureus e diferenciá-lo de outras espécies do gênero. A enzima coagulase está presente em duas formas: na forma livre e na forma ligada à célula. A coagulase ligada à célula é detectada pelo método da lâmina e a livre pelo método do tubo.
Prova em lâmina: a coagulase conjugada encontra-se unida à parede celular bacteriana e não está presente em filtrados de cultivos; quando as células bacterianas são suspensas em plasma, formam-se cordões de fibrina entre elas, o que causa agrupamento sob a forma de grumos visíveis.
Prova em tubo: a coagulase livre está presente em filtrados de cultivos; quando uma suspensão em plasma do microrganismo produtor de coagulase é preparada em tubo de ensaio, forma-se um coágulo visível, resultante da reação da coagulase com uma substância do soro, um complexo que, por sua vez, reage com o fibrinogênio para produzir o coágulo de fibrina.
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Procedimento:
Prova em lâmina
Colocar uma gota de água destilada estéril ou solução fisiológica estéril sobre uma lâmina de vidro;
Emulsionar a colônia suspeita na gota de salina ou água (fazer uma emulsão densa);
Colocar uma gota de plasma sobre a emulsão e homogeneizar;
Observar a formação de grumos brancos imediatamente (5 a 20 segundos).
Prova em tubo
Colocar 0,5 ml de plasma sem diluição no tubo de vidro;
Colocar uma alçada do crescimento bacteriano diretamente no plasma contido no tubo;
Homogeneizar com a própria alça, não agitar;
Incubar em banho-maria a 37ºC por 4 horas;
Não agitar o tubo, apenas incliná-lo suavemente para verificar a formação de coágulo. Se não houver formação de coágulo em 4 horas, incubar por 24 horas em banho-maria a 35ºC.
Interpretação:
Prova em lâmina
Resultado positivo – formação de grumos dentro de 5 a 20 segundos.
Resultado negativo – não há formação de grumos.
Prova em tubo
Resultado positivo – formação de coágulo ou formação de coágulo parcial (qualquer formação de coágulo é considerada positiva).
Resultado negativo – não há formação de coágulo (a solução fica líquida).
Etapa 3: Fermentação de Manitol
Staphylococcus aureus, ao contrário das espécies coagulase-negativas, é capaz de fermentar manitol. O meio utilizado é o ágar sais-manitol, o qual, devido a sua alta concentração de sais, inibe o crescimento de outros microrganismos (exceto enterococos) e isola, de modo seletivo, estafilococos. A fermentação de manitol libera ácidos que, ao diminuir o pH, mudam a cor do indicador vermelho-de-fenol de rosa para amarelo.
Procedimento:
Retirar uma colônia do meio de cultura com uma alça bacteriológica em agulha e semeá-la sobre a superfície inclinada do meio fazendo movimentos em zigue-zague;
Incubar o tubo a 35ºC e examinar com 24 horas.
Interpretação:
Resultado positivo – mudança do meio de rosa para amarelo.
Resultado negativo – a cor do meio permanece inalterada.
Etapa 4: Sensibilidade à Novobiocina
Os estafilococos coagulase-negativos podem ser divididos em espécies sensíveis e resistentes à novobiocina. Como as espécies resistentes à novobiocina diferentes de Staphylococcus saprophyticus são encontradas com pouca freqüência em amostras biológicas humanas, a prova de sensibilidade à novobiocina representa um método útil para identificar Staphylococcus saprophyticus.
Procedimento:
Preparar uma solução de microrganismos em caldo de maneira que a suspensão tenha turvação equivalente ao padrão 0,5 de MacFarland;
Utilizando um swab, distribuir parte da suspensão bacteriana sobre a metade de uma placa de ágar sangue;
Colocar um disco de novobiocina sobre a área semeada. Pressionar o disco com pinça flambada, para o disco aderir à superfície do ágar;
Incubar a 35ºC por 18 a 24 horas.
Interpretação:
Halo de até 12 mm ao redor do disco de 6 mm indica resistência à novobiocina e identifica o microrganismo como Staphylococcus saprophyticus.
Etapa 5: Prova de Tolerância ao Sal
A prova de tolerância ao sal (caldo com 6,5% de NaCl) é utilizada para diferenciar as espécies de Enterococcus dos estreptococos do grupo D não-enterococos S. bovis e S. equinus. 
Procedimento:
Semear duas ou três colônias em caldo com 6,5% de NaCl;
Incubar o tubo a 35ºC e examinar com 18 a 24 horas.
Interpretação:
Resultado positivo – turvação do meio indicando crescimento bacteriano.
Resultado negativo – meio permanece inalterado.
Etapa 6: Prova de Bíle-Esculina
Baseia-se na capacidade de certas bactérias hidrolisarem esculina em presença de bílis (4% de sais biliares ou 40% de bílis). A hidrólise da esculina no meio resulta na formação de glicose e de esculetina, a qual reage com íons férricos (fornecidos pelo componente inorgânico do meio, o citrato férrico), formando um complexo negro difusível.
Procedimento:
Retirar uma colônia do meio de cultura com uma alça bacteriológica em agulha e semeá-la sobre a superfície inclinada do meio fazendo movimentos em zigue-zague;
Incubar o tubo a 35ºC e examinar com 24 a 48 horas.
Interpretação:
Resultado positivo – enegrecimento difuso de mais da metade da área inclinada do meio.
Resultado negativo– a cor do meio permanece inalterada.
Etapa 7: Sensibilidade à Optoquina
A sensibilidade à optoquina é utilizada para diferenciar S. pneumoniae de outros estreptococos viridans. Esse teste é realizado em ágar-sangue. A optoquina é solúvel em água e se difunde com facilidade nos meios de ágar. Nessa prova são utilizados discos de papel de filtro impregnados com optoquina em uma prova de difusão. As células de S. pneumoniae que rodeiam o disco sofrem lise, devido à variação da tensão superficial, e é produzida uma área de inibição.
Procedimento:
Colher três ou quatro colônias isoladas do microrganismo e estriar em uma metade a um terço da placa de ágar sangue;
Com auxílio de um swab esterilizado ou uma alça, espalhar sobre toda a metade da placa;
Colocar um disco de optoquina no terço superior da área semeada. Pressionar o disco com pinça flambada, para o disco aderir à superfície do ágar;
Incubar a 35ºC por 18 a 24 horas em jarra com vela ou em estufa com 5% a 7% de CO2.
Interpretação:
Halo de 14 mm ou mais ao redor do disco de 6 mm indica sensibilidade à optoquina e identifica o microrganismo como Streptococcus pneumoniae.
Estreptococos viridans e os do grupo D são em geral resistentes à optoquina.
Etapa 8: Sensibilidade à Bacitracina e ao Sulfametoxazol-Trimetoprim
A sensibilidade a baixas concentrações de bacitracina e à sulfametoxazol-trimetoprim (SUT) proporciona um método sensível e econômico para identificação presuntiva de estreptococos β-hemolíticos dos grupos A e B. Os estreptococos do grupo A são sensíveis a concentrações relativamente baixas de bacitracina e são resistentes ao SUT. Os estreptococos do grupo B são resistentes a ambos os antibióticos. Outros estreptococos β-hemolíticos apresentam sensibilidade variável à bacitracina, mas são usualmente sensíveis ao SUT.
Procedimento:
Colher três ou quatro colônias isoladas de estreptococos β-hemolíticos e estriar até o centro da metade de uma placa de ágar-sangue;
Com auxílio de um swab esterilizado ou uma alça, espalhar sobre toda a metade da placa;
Com auxílio de pinças esterilizadas, colocar um disco de bacitracina e um disco de SUT sobre a área semeada, cuidando para que os discos fiquem uniformemente separados. Pressionar os discos para melhor aderência à superfície do agar;
Incubar a 35ºC por 18 a 24 horas.
Interpretação:
Sensível (S): qualquer tamanho de halo ao redor de qualquer dos discos.
Resistente (R): crescimento até a borda do disco.
BAC	SUT	IDENTIFICAÇÃO
S	R	Presumivelmente do grupo A
R	R	Presumivelmente do grupo B
S/R	S	Nem A nem B
Etapa 9: Prova CAMP
Prova utilizada para identificação presuntiva de estreptococos β-hemolíticos do grupo B. A atividade hemolítica da β-hemolisina produzida pela maioria das cepas de Staphylococcus aureus é intensificada por uma proteína extracelular formada por estreptococos do grupo B. A interação da β-hemolisina com esse fator produz “hemólise sinérgica”, que pode ser facilmente observada em uma placa de ágar-sangue.
Procedimento:
Semear, em uma única linha reta, a cepa de S. aureus produtora de β-hemolisina no centro da placa de ágar-sangue;
Cuidando para não tocar na estria de estafilococos, estriar o estreptococo a ser identificado em sentido perpendicular. Realizar essas semeaduras de tal modo que, após incubação, o crescimento dos dois microrganismos não os junte. A estria de estreptococo deve ter 3 a 4 cm de comprimento.;
Incubar a placa a 35ºC por 18 a 24 horas.
Interpretação:
A área de intensificação de lise é observada quando a β-hemolisina secretada por estafilococos e o fator CAMP secretado por estreptococos do grupo se intersectam, denotando uma área de hemólise em forma de ponta de flecha.
RESULTADOS
	
	Catalase
	Coagulase
	Manitol
	Novobiocina
S/R
	NaCl 6,5%
	Bílis-Esculina
	Optoquina
S/R
	BAC / SUT
S/R / S/R
	CAMP
	Espécie/grupo
sugestivo
	CULTURA 1
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	CULTURA 2
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	CULTURA 3
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	CULTURA 4
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	CULTURA 5
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
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