Aula coombs

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Coombs Direto e Indireto
Profa. Rafaela Ceron
Biomedicina - UTP
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História:
Robert Coombs, juntamente com Arthur Mourant e Robert Russell, imunologistas, desenvolveram e publicaram em 1945 métodos para detectar anticorpos.
Em 1956 Robert Coombs fundou a Sociedade Britânica de Imunologia.
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O que é:
O teste de Coombs é uma técnica altamente sensível, na qual demonstra a presença de anticorpos mesmo em pequena quantidade, que atuam contra os eritrócitos.
Pode ser DIRETO ou INDIRETO
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INTERFERENTES:
Transfusão de sangue anterior;
Gravidez recente;
Medicamentos: acetofenetidina, ácido etacrínico, ácido flufenâmico, ácido melenâmico, α-metildopa, AINE, cefalosporinas, cefalotina, cefaloridina, cefapirina, cefazolina, clorodiazepóxido, cimetidina, ethosuximida, fenacetina, levodopa, penicilinas, ρ-aminossalicilato, procainamida, quinidina, quinina, tetraciclina
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Doenças
Anemia hemolítica auto-imune idiopática ou induzida por medicamentos;
Leucemia linfocítica crônica;
Mononucleose infecciosa;
Infecção micoplasma;
Sífilis
Lupus eritematoso sistêmico;
Eritroblastose fetal (DHRN)
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DHRN
Mulheres Rh-, sensibilizadas anteriormente, têm um filho de sangue Rh+
A sensibilização pode ocorrer por transfusão de sangue ou gestação anterior, ambas com sangue Rh+ envolvido.
Destruição das hemácias do feto ou do recém-nascido;
Na gestação ocorre passagem, da mãe para o filho e vice-versa, pela placenta apenas de substâncias presentes no plasma.
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No momento do parto, a placenta se descola e as hemácias do feto podem passar para o sangue da mãe, fazendo com que entre 15 e 20 dias a mãe comece a produzir anticorpo.
Na 1ª gestação o filho pega a doença se a mãe participou de transfusão recebendo sangue Rh+, anteriormente.
Na 2a gestação, se o filho for Rh+ novamente, a mãe já se encontra sensibilizada com o anticorpo Anti-Rh no seu plasma que irá passar para o feto, provocando a destruição de suas hemácias.
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Eritrócitos
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PREVENÇÃO EF
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Coombs DIRETO
Detecta a presença de anticorpos fixados sobre as hemácias. Tecnicamente, baseia-se no fato de que os anticorpos que recobrem as hemácias podem ser identificados pela adição de anticorpos anti IgG humana (Soro de Coombs)
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INTERPRETAÇÃO
Ocorrendo ausência de aglutinação o teste é negativo – Teste de Coombs direto negativo
	Não tem anticorpos ligados ao eritrócito 
Ocorrendo aglutinação o teste é positivo - Teste de Coombs direto positivo
 Tem anticorpos ligados ao eritrócito
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***Se aglutinar é sinal que o bebê já tinha anticorpos anti-D maternos da classe IgG que atravessaram a placenta e se ligaram às suas hemácias promovendo sua lise e fagocitose, e haverá necessidade de transfusão sangüínea. Se não aglutinar, é porque não houve passagem de anticorpos maternos anti-D através da placenta.
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Coombs INDIRETO
Detecta anticorpos circulantes não ligados, na amostra de soro. É importante para a avaliação de gestantes Rh- (avaliação de sensibilização), em pacientes com Rh- para avaliação da variante Du e nas fases pré-transfusionais, em pacientes já transfundidos, em que pode ter ocorrido sensibilização para Rh e outros sistemas.
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INTERPRETAÇÃO
Ocorrendo ausência de aglutinação o teste é negativo – Teste de Coombs indireto negativo
	Não tem anticorpos circulantes no plasma. 
Ocorrendo aglutinação o teste é positivo - Teste de Coombs indireto positivo
	Tem anticorpos circulantes no plasma
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Procedimento COOMBS Direto
Pesquisa de anticorpos (gamaglobulinas) já
fixados às hemácias.
Colocar em um tubo de hemólise uma gota de suspensão de hemácias do paciente a 5%
Lavar as hemácias do tubo por três vezes com solução salina à 0,9%. Desprezar o sobrenadante, secando as bordas do tubo na última lavagem para retirar toda a solução. 
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3. Acrescentar duas gotas do Soro Anti-IgG (Soro de Coombs). Misturar bem. 
4. Centrifugar a 3 400 rpm por 15 segundos. 
5. Agitar suavemente o tubo para pesquisar a presença ou não de aglutinação.
6. Visualizar em lâmina no microscópio
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Considerações sobre o teste
O teste de Coombs direto positivo pode não estar associado a Anemia hemolítica auto-imune e ainda assim não ser falso-positivo.
3% dos pacientes que recebem penicilina e 15% dos que recebem alfa-metildopa podem desenvolver Coombs direto positivo mas só 1% destes indivíduos terão Anemia hemolítica Auto-imune.
 6 a 8% dos pacientes internados em hospitais podem ter CD positivo sem manifestações clinicas de destruição acelerada das hemácias (Garratty G, Transfusion Medicine Review 1987; 1:47-57)
Com os reagentes atuais , cuja sensibilidade é maior para detectar moléculas de imunoglobulinas e Complemento, a possibilidade de encontrarmos teste de Coombs direto positivo sem hemólise é maior. 
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Procedimento COOMBs indireto
Reagentes: 
* TRIACEL®, contém suspensões a 3% de glóbulos vermelhos humanos do grupo O, individuais. O frasco I contém glóbulos com o fenótipo R1 R1 (DCe / DCe) ou R1 r (DCe / dce) e o frasco II contém glóbulos com o fenótipo R2 R2 (DcE / DcE) ou R2 r (DcE/dce), todos extensivamente fenotipados para os antígenos de diferentes sistemas de grupos sanguíneos.
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*Albumina bovina 2%, é uma proteína que atua aumentando a constante dielétrica do meio, diminui o potencial Zeta, facilitando a aglutinação. (Deve ter aspecto límpido e não determinar aglutinação quando testada frente a hemácias não sensibilizadas).
* PeG® - polietilenoglicol é um meio de baixa força iônica. Esta combinação leva ao aumento da sensibilidade na detecção de anticorpos irregulares IgG. 
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Identificar 2 tubos
Em um tubo adicionar 100 µL de soro da paciente Rh negativo a ser testado
Adicionar em seguida 100 µL de hemácias O Rh positivas (TRIACEL);
Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente;
Encher o tubo com aproximadamente 2,0mL de solução salina para retirar excesso de anticorpos não ligados;
Centrifugar o tubo a 1.000rpm por 2 minutos à temperatura ambiente;
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7. Desprezar o sobrenadante na pia com cuidado para não jogar fora o botão de hemácias;
8. Adicionar em seguida 100µL de anti-IgG humana (soro de Coombs);
9. Centrifugar o tubo a 1.000rpm por 2 minutos à temperatura ambiente;
10. Visualizar em lâmina no microscópio.
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Pesquisa de Anticorpos Irregulares em Polietilenoglicol (Bio PEG®)
Identificar os tubos: I, II (ambos devem ser identificados com o número da amostra teste); 
Em cada tubo, adicionar 2 gotas de plasma do paciente e 1 gota da suspensão de hemácia a 5%, respectivamente;
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Acrescentar 2 gotas de Bio PEG®, homogeneizar e não centrifugar; 
Incubar a 370C por 15 minutos; 
NÃO centrifugar (pois este potencializador forma um precipitado de proteínas que impede a observação da aglutinação antes da lavagem); 
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Lavar as hemácias 3 vezes com salina (sempre que desprezar os sobrenadantes, agitar os tubos para que ocorra o desprendimento total do botão formado no fundo do tubo; só depois acrescentar novamente a salina); 
Decantar completamente o sobrenadante final, desprender o botão formado e adicionar 1 gota de soro antigamaglobulina anti-IgG;
Homogeneizar e centrifugar por 15 segundos a 3400 rpm; 
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9. Examinar a aglutinação das hemácias e registrar os resultados de acordo com a ausência ou presença de aglutinação, anotando sempre a intensidade de aglutinação