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Aula de Bioquímica Avançada Tema: Sinalização Celular Prof. Dr. Júlio César Borges Depto. de Química e Física Molecular – DQFM Instituto de Química de São Carlos – IQSC Universidade de São Paulo – USP E-mail: borgesjc@iqsc.usp.br Princípios da Sinalização Celular ORGANISMOS UNICELULARES Células respondem a estímulos do meio: disponibilidade de oxigênio, nutrientes, etc ORGANISMOS MULTICELULARES Células enviam sinais umas às outras células mediante centenas de tipos de moléculas extracelulares. Célula ??? Morrer Viver Dividir Proliferar Diversos sinais simultâneos Especialização celular Interação celular Movimento celular Proliferação celular ���� A partir da integração dos sinais, as células devem decidir o que fazer ���� As células-alvo possuem proteínas receptoras. ���� As proteínas-receptoras reconhecem o 1º Mensageiro e respondem de forma específica. ���� Alta especificidade e sensibilidade Célula sinalizadora Princípios da Sinalização Celular TRANSDUÇÃO DE SINAL CÉLULAS SINALIZADORAS MOLÉCULA SINAL: 1º MENSAGEIRO PROTEÍNAS RECEPTORAS (CÉLULAS ALVO) EMITE SINAL ALTERAÇÃO DO COMPORTAMENTO CELULAR Princípios da sinalização celular Transdução de sinal Maneira pela qual a célula recebe um determinado tipo de sinalização e o transmite para diversas vias, que poderão ser novamente transformadas, até chegar a função efetora – Dividir, proliferar, morrer .... 1º mensageiro - Proteínas - Peptídeos - Aminoácidos - Nucleotídeos - Ácidos graxos - Esteroides - Gases Transdução de sinal Uma dada célula responde a um conjunto limitado de sinais - Depende de seu próprio conjunto de moléculas efetoras ���� Diferentes moléculas-sinais extracelulares alteram o comportamento da célula-alvo. ���� Células diferentes respondem de modo diferente ao mesmo tipo de sinal. A informação transmitida pelo sinal depende de como a célula-alvo recebe e interpreta o sinal. Integração da sinalização Intracelular TRANSDUÇÃO INICIAL TRANSMISSÃO AMPLIFICAÇÃO INTEGRAÇÃO DISTRIBUIÇÃO RESPOSTA CELULAR Receptores celulares específicos ���� responsáveis em disparar processos celulares conforme a disponibilidade de moléculas executoras - RESPOSTA DIFERENCIADA DEPENDENTE DO TIPO CELULAR Sinalização Celular Moléculas-sinal extracelulares: 1º Mensageiro ���� Receptores específicos Leveduras – unicelulares – sinalização feita por poucos tipos de moléculas Células de animais superiores – Centenas de diferentes tipos de moléculas Maioria das moléculas é secretada por exocitose. Outras são liberadas por difusão através da membrana plasmática e outras ficam expostas ao meio extracelular, mas permanecem ligadas a superfície da célula sinalizadora (proteínas de membrana) Emissão do sinal Independente da natureza do sinal, a célula-alvo responde por meio de uma proteína específica: RECEPTOR. � Local onde a molécula sinalizadora se liga de forma específica iniciando uma resposta nas células- alvo. � Alta especificidade � Proteínas modulares � Múltiplas isoformas tecido-específicas � Pontos de convergência/divergência de sinais Sinalização Celular Moléculas-sinal extracelulares���� 1º Mensageiro ���� Características químicas Influencia as características estruturais do RECEPTOR Grandes e hidrofílicas Pequenas e hidrofóbicas ���� Ligante tem que penetrar na célula- alvo para ativação ���� Ativa receptores citoplasmáticos e/ou nucleares ���� Maior parte dos receptores ���� Proteínas transmembrana que ao se ligarem a molécula sinalizadora são ativados e geram uma cascata de sinais intracelulares alterando o comportamento da célula. Tipos de Sinalização Extracelular � Endócrinos: liberados no plasma ���� ação a “longa distância” � Neuronais ���� ação mediada por neurotransmissor �Autócrinos: liberados no espaço extracelular ���� ação na mesma célula que os libera �Parácrinos: liberados no espaço extracelular ���� ação local em outras células Hormônios: 1º mensageiro Conjunto de moléculas responsáveis pela manutenção e coordenação das funções em um organismo complexo. Mensageiros químicos secretados no plasma ou interstício celular para regular a atividade de outras células ou tecidos do organismo. Função Tecido/célula/sistema alvo Pressão arterial sistema vascular Volume sanguíneo sistema vascular e rins Balanço eletrolítico sistema vascular e rins Embriogênese embriões Diferenciação sexual órgãos sexuais e organismo Desenvolvimento e reprodução órgãos sexuais e organismo Fome cérebro Comportamento alimentar cérebro e sistema digestivo Digestão cérebro e sistema digestivo Distribuição de combustíveis fígado Sinalização de longa distância Liberação do 1º mensageiro: Tipos de sinalização a longa distância Sinalização neuronal Sinalização Endócrina ���� Distribuição muito rápida – 100 m/seg ���� Concentração alta do neurotransmissor ���� Efeito localizado ���� Maior precisão e rapidez � Distribuição lenta � depende da difusão no fluxo sanguíneo � Concentração baixa de hormônios � Efeito disperso Vias de Sinalização Intracelular Hormônios Sistema neuroendócrino Tipos de Sinalização Extracelular � A transmissão dos sinais em relação a distância Distâncias Secreção de sinais (Ex: Hormônios) Sinalização endócrina Mediadores locais (Ex: Inflamação) Sinalização parácrina Secreção de neurotransmissores (Ex: Acetilcolina) Sinalização neuronal Contato direto, sem liberação de sinais (Ex: desenvolvimento embrionário) Sinalização dependente de contato Curtas Longas Transdução de sinais A resposta celular a um sinal pode ser rápida ou lenta A Especificidade da ação depende da interação do 1º mensageiro com receptores celulares 1) Liberação de 2º mensageiro no citoplasma ���� modificações covalente reversíveis de proteínas alvo - Ativação/inativação de enzimas efetoras 2) Abertura de canais - Efeito direto 3) Modulação da expressão gênica - Pode ser ação decorrente da integração conjunta com 2º mensageiro ou receptores nucleares Sistemas de amplificação de sinal As vantagens do uso de 2º mensageiros ���� Efeito “Cascata de sinalização” 1) Amplificação de sinal - Um pequeno sinal pode produzir amplas respostas celulares 2) Difusão do sinal por todos os compartimentos celulares - Modulação de toda célula para a nova situação celular 3) Comunicação cruzada - Integração com outros sinais Transdução de sinais: características gerais Alta conservação dos mecanismos de transdução de sinais biológicos ���� Tipos de sinais biológicos ���� milhares ���� Maquinaria de transdução conta com alguns tipos básicos de componentes proteínas Resumindo Modulação da Célula-alvo Célula sinalizadora Sinal (1º mensageiro) Ex: hormônio Proteína receptora Distância 1. Parácrina 2. Dependente de contato 3. Endócrina 4. Neuronal 1. Intracelular 1. Canais iônicos 2. Receptores enzimáticos 3. GPCR ���� Proteínas G 4. Guanilil-ciclase 2º mensageiros cAMP IP3 DAG Ca2+ cGMP Tiroquinases - Óxido nítrico - Hormônios esteroides - Hormônios tireoidianos 2. Superfície Transdução do sinal Hormônios 1os Mensageiros Tipos de hormônios Hormônios Tipos de hormônios Hormônios Tipos de hormônios: continuação Hormônios Hormônios peptídicos Ação dependente de receptores de membranas e segundos mensageiros Ex:Insulina e glucagon: metabolismo de carboidratos Angiotensina II e bradicinina: pressão e volume sanguíneo Hormônios Hormônios catecolamínicos Ação dependente de receptores de membranas e segundos mensageiros Produzidos na medula adrenal Papel importante na neurotransmissão e metabolismo energético Noradrenalina/norepinefrina Adrenalina/epinefrina Hormônios Os efeitos da Epinefrina e Glucagon no metabolismo do Glicogênio - Cascatas de sinalização - Amplificação de sinal Hormônios Hormônios eicosanoides Ação dependente de receptores de membranas e segundos mensageiros - mediadores celulares locais ���� inflamação, febre, dor e agregação plaquetária Hormônios Hormônios esteróides Ação dependente de receptores nucleares ���� modulação da expressão gênica cortisol TestosteronaAldosterona Estradiol Hormônios Hormônios vitamina D Ação dependente de receptores nucleares ���� modulação da expressão gênica Hormônios Hormônios Retinoides Ação dependente de receptores nucleares ���� modulação da expressão gênica Hormônios Hormônios Retinoides Ação dependente de receptores nucleares ���� modulação da expressão gênica Hormônios Hormônios Tireoides Ação dependente de receptores nucleares ���� modulação da expressão gênica Produzido na tireoide Estimulam o metabolismo energético Hormônios Óxido nítrico Radical livre estável Síntese dependente da NO-sintase Ação local por intermédio da guanilato-ciclase ���� segundo mensageiro GMPc Hormônios Hormônios Hormônios Transdução de sinais Os 6 mecanismos básicos A redundância mecanística permite fazer generalizações 1) Receptores acoplados a Proteínas G GPCR: G protein-coupled recpetors ~1/2 dos fármacos atuam sobre GPCR Sistema de transdução de sinal formado por 3 componentes: 1) Receptor de membrana plasmática com 7 segmentos transmembrana - Receptor hepta-helicoidais 2) Proteína G que alterna entre forma ativa (GTP) e inativa (GDP) 3) Proteína G-GTP ativa uma enzima que libera 2º mensageiros Protótipo de funcionamento GPCR ���� Receptor β-adrenérgico Receptor adrenalina 4 tipos básicos: α1, α2, β1, β2 Adrenalina = epinefrina � Dispara sinais de alarme - Mobiliza energia metabólica - Aumenta capacidade cardiovascular “lutar ou fugir” Agonista: simula ligante natural Antagonista: bloqueia efeito do ligante natural = Fármaco 1) Receptores acoplados a Proteínas G GPCR: G protein-coupled receptors ~1/2 dos fármacos atuam sobre GPCR ���� ~1000 genes em humanos ���� ~150 órfãos (sem ligantes descritos) ~350 para hormônios e outras moléculas endógenas ~ 500 para receptores olfativos e gustativos ���� moléculas exógenas ���� Alta conservação estrutural e funcional - Aminas de baixa massa molecular ���� adrenalina - Peptídeos opióides - Proteínas - Peptídeos - Eicosanoides - Receptores de luz 1) Receptores acoplados a Proteínas G Proteína G ���� Ancorada a membrana via palmitoil ���� Gs- estimulatória ���� Forma inativa ���� Heterotrímero αβγ Gsαβγ(GDP) ���� Ativação do receptor - dissociação da Gsα(GDP) - Dissociação do GDP - Ligação do GTP ���� Ativação da Adenilil- ciclase Receptor β-adrenérgico ���� Protótipo do grupo ���� Presente no músculo esquelético, fígado e adipócitos - Degradação de glicogênio e triacilgliceróis Adenilil-ciclase ���� proteína de membrana ���� forma cAMP na face citoplasmática 1) Receptores acoplados a Proteínas G 1) cAMP ativa a PKA induzindo a dissociação da cadeia catalítica ativa da cadeia regulatória inibitória 2) Fosforilação indiscriminada de proteínas diversas como Glicogênio Fosforilase Kinase (degradação de glicogênio) e Glicogênio Sintase kinase (inibição da síntese de glicogênio) ���� Susceptível a cascata de amplificação de sinal 1) Receptores acoplados a Proteínas G ���� Todo sistema de transdução de sinal tem um mecanismo de término de resposta Mecanismos de desligamento da ativação dos receptores β-adrenérgicos 1) Depende da dissociação do Gsα–GTP da adenilil ciclase 2) Atividade GTPase intrínseca da Gsα sobre o próprio GTP - Existem proteínas ativadores da atividade GTPase (GAP) intrínseca da Gsα Comutador binário autolimitante Estímulo da Gsα(GTP) sobre a Adenilil-ciclase é autolimitada pela sua atividade GTPase intrínseca A Gsα(GDP) se reassocia ao Gsβγ e ao receptor de membrana 3) Hidrólise do cAMP ���� fosfodiesterase de nucleotídeo cíclico 4) Fosfoproteínas-fosfatases atuam sobre as proteínas fosforiladas pela PKA 1) Receptores acoplados a Proteínas G Dessensibilizarão de receptores β-adrenérgicos Processo que sequestra os receptores em vesículas no citoplasma. ���� Depende da fosforilação da face citoplasmática do receptor pela β-ARK (β- adrenergic receptor kinase) - Família GRK (G-protein coupled kinases) ���� Bloqueio da interação com a Proteína G ���� Recrutamento da β-arrestina e Clatrina ���� Sequestro em vesículas citoplasmáticas cAMP é um 2º mensageiro multifuncional Vários sistemas de transdução usam o cAMP ���� cAMP ativa a CREB (cAMP response element binding protein) ���� ativa transcrição gênica Reúnem Balsas lipídicas - Receptor-proteína Gsαβγ - Adenilil ciclase - PKA - cAMP fosfodiesterase - Fosfoproteína fosfatase - Outras ���� Proteína G-inibitória ���� inibição da adenilil ciclase - Estruturalmente similar a Gsαβγ - GIαβγ(GDP) interage com receptores específicos ���� [cAMP] reflete a integração de ambos os sistemas � Resposta ao cAMP pode ser breve e localizada - Efeito dos complexos envolvendo proteínas de ancoragem da PKA (AKAP5) 1) Receptores acoplados a Proteínas G GPCR podem estar acoplados a Fosfolipase C (PLC) Respondem a ativação de hormônios diversos Ação conjunta de 2º mensageiros ���� Diacilglicerol (DAG) ���� Ativa isoenzima da PKC ���� Inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) ���� libera Ca2+ Ca2+ ���� Ativa isoenzima PKC 1) Receptores acoplados a Proteínas G Acoplados resposta via Fosfolipase C (PLC) Efeito do Ca2+ ���� dependente da Calmodulina (CaM) ���� sensor ubíquo de Ca2+ � Ativa a CaM-kinase Efeito do Ca2+ ���� interconexão com cAMP - Estimula a adenilil ciclase - Estimula a cAMP-fosfodiesterase Efeitos locais/temporais 2) Receptores Tirosina-kinases (RTK) ���� Domínio extracelular de interação com o ligante ���� Domínio citoplasmático com atividade kinase - Conectados por um único segmento transmembrana - Atividade Tyr-kinase intrínseca ���� fosforilação cruzada � Receptor da Insulina: INSR ���� Protótipo da classe - Dímero - Regulação de metabolismo e expressão gênica - Interação com a Insulina ���� fosforilação cruzada - Saída da sequência auto-inibitória do sítio ativo - Sítio ativo livre para interagir com proteínas citoplasmáticas O INSR ativo fosforila e ativa o IRS-1 (Insulin receptor substrate-1) O IRS-1 (Pi-Tyr) funciona como ponto de nucleação para complexo de proteínas 2) Receptores Tirosina-kinases (RTK) ���� Possuem atividade kinase intrínseca: Receptor da Insulina: INSR Montagem do complexo envolve proteínas contendo o domínio SH2 ���� liga Pi-Tyr ���� Gbr2 - Reconhece Pi-Tyr da IRS-1 - Proteína conectora - Contém domínio SH3 - Liga proteínas ricas em Pro ���� Sos - É fator de troca de nucleotídeos (GEF) - Induz troca de GDP/GTP na Ras ���� Ras - Protótipo das pequenas proteína G - Ligada a GTP ���� ativa a proteína kinase Raf1 ���� uma MAPK (mitogen-activated protein kinase) - Raf1 fosforila e ativa a MEK (uma MAPK kinase - MAPKK) - MEK fosforila e ativa a ERK (uma MAPKK kinase - MAPKKK) ���� Cascatas das MAPK 2) Receptores Tirosina-kinases (RTK)���� Possuem atividade kinase intrínseca: Receptor da Insulina: INSR Ativação de enzimas contendo o domínio SH2 ���� Fosfoinositídeo-3-kinase – PI3K - Reconhece Pi-Tyr da IRS-1 - Atua sobre fosfatidilinositol-4,5- fosfato (PIP2) - Formação do fosfatidilinositol- 3,4,5-fosfato (PIP3) - O PIP3 ativa a PDK1 ���� fosforila a Akt (PKB) ���� Insulina inibe a enzima que inibe a Glicogênio Sintase - Síntese de glicogênio ���� PKB - Disponibiliza o Glut4 - Fosforila Ser e Thr de proteínas alvo ���� inativa GSK3 ���� Glicogênio sintase kinase 3 - GSK3 não fosforilada ���� Fosforila a Glicogênio Sintase - Redução da síntese de glicogênio 2) Receptores Tirosina-kinases (RTK) ���� Possuem atividade kinase intrínseca: Outros exemplos ���� Envolvem dimerização dependente do 1º mensageiro - Usam proteínas que interagem com Pi- Tyr via domínios SH2 - Permite ampla integração de sinal � Envolvem dimerização dependente do 1º mensageiro - Citocina Eritropoitina - Modulação da expressão gênica direta e indireta via cascata das MAPK Integração de vias Insulina versus Adrenalina ���� Metabolismo é entrelaçado e estratificado Integração do sinal da insulina ���� Insulina induz sequestro de receptores β-adrenérgicos devido a fosforilação do C- terminal do receptor via IRS-1 e PKB ���� Fosforilação receptores α2- adrenérgicos permite nucleação do complexo via SH2 e ativação da cascata das MAPK ���� modulação da expressão gênica 3) Receptores Guanilil-ciclases Ação via cGMP e Proteínas Kinases G (PKG) � cGMP transmite diferentes mensagens para diferentes tecidos - Rins e intestino ���� retenção de água - Relaxamento do músculo cardíaco Fator natriurético atrial (ANF) - Secretado pelos átrios cardíacos - Excreção renal de sódio - Excreção de água - Vasodilatação Efeito do cGMP é revertido pela cGMP- fosfodiesterase (cGMP-PDE) - O Sildenafil (Viagra) inibe a isoforma peniana ���� vasodilatação ���� ereção prolongada Guanilil ciclase citosólica ���� ativada por óxido nítrico (NO) - cGMP reduz tônus cardíaco - Via da ação da nitroglicerina - Tratamento da angina pectoris Proteínas adaptadoras ���� Tema recorrente Fosforilação criam sítios de ancoragem em proteínas multivalentes Proteínas multi-domínios que participam de circuitos proteicos � Interação específica de Pi-Tyr - Interação específica mediada pela sequencia adjacente da Pi-Tyr ���� Exemplos: - domínio SH2 - PTB (Phosphotyrosin-Binding protein) � Auto-inibição via fosforilação interna Proteínas adaptadoras ���� Tema recorrente Proteínas multi-domínios que participam de circuitos proteicos � Módulos de interação recorrentes - Múltiplos domínios de interação comuns em diferentes proteínas ���� Em humanos - 87 proteínas contendo o domínio SH2 - 24 proteínas contém o domínio PTB ���� Muitas contém o domínio SH3 - liga PIP3 na face interna da membrana formado em resposta a PIK3 e IRS-1 - Proteínas multivalentes Proteínas adaptadoras ���� Tema recorrente Circuitos proteicos, proteínas de ancoragem e balsas lipídicas EX: A cascata das Raf (MAPK), MEK (MAPKK) e Erk (MAPKKK) depende da proteína de ancoragem KSR � Possibilita resposta combinatória � Regulação da intensidade de resposta via fosforilação no sítio de ancoragem Ex: Raf � Proteínas Tyr-fosfatases também contém domínios de interação comuns aos envolvidos nos circuitos de ativação - Ex: domínio SH2 4) Receptores acoplados a canais iônicos ���� Convertem sinais QUÍMICOS em sinais ELÉTRICOS - Funcionam de maneira simples e direta - Responsáveis pela transmissão rápida de sinais (sinapses do sistema nervoso) - Contração muscular, secreção hormonal, processos sensoriais, memória, etc. Potencial de membrana Polarização da membrana decorrente a diferente concentração de íons ���� Gradiente de concentração de íons e potencial elétrico são mantidos a custas de ATP - Na+K+-ATPase � Gradiente/potencial elétrico rompido pela abertura de Canais iônicos passivos específicos induzida por ligantes ou variação de potencial elétrico transmembrana � Fluxo de íons continua até consumir a força propulsora provida pelo gradiente de íons e potencial de membrana. - É especifico para cada íon - É influenciado pelo tempo de abertura e fechamento de um dado canal iônico 4) Receptores acoplados a canais iônicos Canal de membrana controlados por voltagem � Sinalização no sistema nervoso central - Potencial de ação em extremidades do neurônio - Liberação de neurotransmissores na fenda sináptica - Potencial elétrico passado adiante ���� Ação conjunta de 3 canais iônicos controlados por voltagem 1) Onda de despolarização abre canais de Na+ ���� entrada de Na+ 2) Despolarização atrasada de canais de K+ ���� saída de K+ - Participa da repolarização 3) Despolarização final abre canais de Ca+ ���� entrada de Ca+ - Ca+ age como 2º mensageiro 4) Exocitose de vesículas de acetilcolina ���� neurotransmissor na fenda sináptica - Ativação de receptores na membrana pós-sináptica - Abertura de canais iônicos 4) Receptores acoplados a canais iônicos Funcionamento do canal iônico de Na+ sensível a voltagem ���� 1840 resíduos ���� 4 domínios contendo 6 α- hélices transmembrana formando um canal central em funil específico para Na+ - Filtro de seletividade loop entre hélice 5 e 6 ���� α-hélice 4 é carregada +++ e funciona como sensor de abertura ���� Inativação depende de mecanismo de “bola de corrente” que bloqueia o canal - Comprimento da “corrente” determina o tempo de abertura do canal 4) Receptores acoplados a canais iônicos Funcionamento do canal iônico de Na+, K+ e Ca+ ativado por acetilcolina ���� Receptor nicotínico de acetilcolina - Sensível a nicotina - Sinapses e junções neuromuscular ���� Receptor formado por 5 subunidades ���� α2βγδ - Cada subunidade tem 4 segmentos α- hélices transmembrana (M1-M4) - A hélice M2 é anfipáticas com Leu voltadas para o centro do poro � A isoformas α contém o sítio de interação para acetilcolina � Acetilcolina induz uma rotação no segmento M2 de cada subunidade levando as Leu para o lado, abrindo o poro. Outros neurotransmissores com receptores similares: Serotonina, glutamato e glicina A despolarização da membrana neuronal depende da integração dos diversos sinais que o neurônio recebe Transdução sensorial na visão, olfato e paladar Envolvem integração de GPCR e canais de membranas � 2º mensageiros intracelulares regulam canais iônicos acoplados a receptores específicos � Disparam despolarização/polarização da membrana de neurônios acoplados � Guardam semelhanças estruturais e funcionais com GPCR hormonais - Ativação dependente da percepção de luz ou composto exógeno - Modulação da concentração de um 2º mensageiro - Supressão do sinal devido a ação autolimitante da Proteína Gα 5) Integrinas: Receptores Bidirecionais Dímeros αβ ���� Genoma indica 8 genes e 18 genes β ���� 24 integrinas identificadas ���� Interações macromoleculares seletivas - Desenvolvimento embrionário, coagulação, angiogênese, sistema imune, diferenciação celular, crescimento e metástase tumoral Sinalização “de fora para dentro” e “de dentro para fora” ���� liga citoesqueleto a matriz extracelular ���� integra intra- e extracelular - Influencia diretamente a adesividade celular Ligantes extracelulares - Colágeno - Fibrinogênio - Fibronectina - Outras Ligantes intracelulares - Proteínas do citoesqueleto - Talina - α-actinina - Vinculina - Paxilina - outras 6) Receptores nucleares ���� Ação hormônios esteroides, tireoidianos e retinóide- Livre trânsito pela membrana plasmática ���� pequenos e hidrofóbicos - Ativação da transcrição de genes específicos ���� Presença de sequências HRE: elementos de resposta hormonal específicos