DEG 6 Determinacao de estrutura de proteinas

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Degustação de trechos de livros sugeridos 
 
Determinação de estrutura de proteínas 
Fonte: Wilson & Walker. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular 
Biology, 7ed. Página 328- 
 
Massa molecular relativa 
 
Existem três métodos disponíveis para a determinação da massa molecular relativa, Mr, 
frequentemente denominado de “peso molecular”. Os dois primeiros descritos abaixo 
são rápidos e simples e resultam em valores com precisão de 5-10 %. Dependendo do 
objetivo do experimento, necessita-se saber um valor estimado de tamanho da proteína e 
esses métodos em geral são suficientes para tal finalidade. O terceiro método baseado na 
determinação da massa por espectrometria de massa requer pessoas especializadas na 
utilização do instrumento e dão valores de massa com precisão de 0.001 %. Este tipo 
de precisão é essencialmente importante quando se quer determinar modificações pós-
traducionais. 
 
- Eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel 
electrophoresis) 
 
Neste tipo de eletroforese as proteínas são separadas com base no tamanho, o qual por 
sua vez está diretamente relacionado com a massa molecular. Para a determinação da 
massa da proteína, aplica-se uma amostra contendo uma mistura de proteínas com 
massas conhecidas (marcadores de peso molecular) no mesmo gel. Após a eletroforese, 
cora-se o gel e mede-se a distância percorrida por cada proteína marcadora e calcula-se 
a razão entre a distância percorrida pela proteína sobre a distância total da corrida de 
eletroforese. Com esses dados constrói-se uma curva de Log Mr (massa da proteína 
marcadora) vs migração relativa (da proteína marcadora). Determina-se a distância 
percorrida pela proteína e calcula-se a sua migração relativa. Com esse dado, determina-
se a massa molecular utilizando-se a equação da reta obtida na curva padrão. 
 
 
- Cromatografia de exclusão (filtração em gel) 
O volume de eluição da proteína na cromatografia de exclusão é determinado pelo 
tamanho da proteína. Esse volume de eluição tem relação direta com o logarítimo da 
massa molecular da proteína (Log Mr). Com a finalidade de determinar a massa de uma 
proteína, primeiro é necessário construir uma curva de calibração (curva padrão) 
utilizando várias proteínas de massa conhecida. Em geral faz-se a cromatografia de 
exclusão utilizando-se o equipamento de HPLC com colunas cujas dimensões variam de 
1 a 30 cm e fluxos de 1 mL/min. Curvas de calibração lineares são obtidas plotando-se o 
Log Mr vs Kd (eluição relativa). O Kd é calculado seguindo a equação: 
 
Kd = (Ve-Vo) 
 (Vt-Vo) 
 
Onde, Vo é o volume morto (volume necessário para que as moléculas totalmente 
excluídas da coluna saia, em geral é um volume muito pequeno), Vt é o volume 
necessário para que moléculas muito pequenas que entram em todos os poros saiam 
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(volume total da coluna) e Ve é o volume necessário para que a proteína de interesse 
saia. Esse método dá valores de massa com precisão de 10%. 
 
- Espetrometria de massas 
Usando métodos de ionizações brandas, como o electrospray (ESI) ou o MALDI 
(dessorção/ionização a laser assistida por matriz), pode-se produzir íons moleculares 
intactos para proteínas e, portanto pode-se determinar a sua massa molecular de forma 
precisa por espectrometria de massas. Em geral, o ESI produz íons de moléculas com 
massas de até 100 kDa, enquanto o MALDI produz íons de moléculas com massas de 
até 200 kDa. Em ambos, necessita-se de quantidades muito pequenas de amostra 
(pmols). A espectrometria de massa possibilita a determinação de massa com alta 
precisão para proteínas e peptídeos, e este tipo de dado pode ser utilizado para deduzir 
pequenas alterações na estrutura básica da proteína. 
 
Análise de aminoácidos 
 
A determinação da composição de aminoácidos e sua proporção relativa em uma 
proteína pode ser alcançada realizando-se uma hidrólise total da proteína e analisando-
se os aminoácidos livres por técnicas cromatográficas. A hidrólise pode ser feita 
aquecendo-se a proteína em HCl 6 M por 14 h a 110 C, no vácuo. Infelizmente a 
hidrólise ácida destrói ou modifica quimicamente aminoácidos como asparagina, 
glutamina e triptofano. Asparagina e glutamina são convertidas aos seus respectivos 
ácidos aspartato e glutamato e são analisados e quantificados como tal. Triptofano é 
completamente destruído e é melhor determinado espectrofotometricamente na proteína 
intacta. 
Os aminoácidos livres são separados por cromatografia. Atualmente, isto é feito 
derivatizando-se (reação em que o aminoácido é acoplado a um composto que absorve 
luz ou que fluoresce). Reagentes utilizados para tal finalidade incluem o-ftalaldeído e 6-
aminoquilil-N-hidroxisuccinimidyl carbamato (AQC), fenilisotiocianato, etc. 
 
 
Determinação da estrutura primária 
 
Por vários anos o sequenciamento de aminoácidos foi realizado utilizando-se proteínas 
isoladas (purificadas). Isso significa que a maioria dos dados de sequências disponíveis 
de proteínas eram limitadas a aquelas proteínas que podiam ser purificadas em 
quantidades suficientemente grandes para serem sequenciadas. O conhecimento da 
sequência de aminoácidos de uma proteína era (ainda é) um pré-requisito para a 
determinação da estrutura tridimensional da proteína e o conhecimento da função 
proteica. No entanto, atualmente os bioquímicos que trabalham com proteínas ficam 
normalmente satisfeitos com dados de algumas sequências curtas obtidas da região 
amino-terminal ou de uma sequência de um peptídeo interno, produzido pela clivagem 
parcial da proteína por proteases. Os dados do sequenciamento são em geral utilizados 
para: 
- Pesquisar sequências em banco de dados para verificar se a proteína de interesse já foi 
isolada e, portanto pode ser identificada. Para este tipo de busca, sequências muito 
curtas (3-5 resíduos), conhecidos como “sequence tags” são utilizadas. 
- Pesquisar sequências homólogas usando bancos de dados para identificar função de 
proteínas. Por exemplo, a busca pode mostrar sequências com identidade significante 
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com sequências de proteínas quinases conhecidas, sugerindo fortemente que a proteína 
em estudo seja também uma proteína quinase. 
- A sequência pode ser utilizada para desenhar probes de oligonucleotídeos a serem 
utilizados para selecionar clones a partir de bibliotecas de DNA complementar. Desta 
forma, o DNA codificante para a proteína pode ser isolado e a sequência do DNA, e 
portanto a sequência da proteína podem ser determinadas. A obtenção da sequência da 
proteína desta forma é mais trabalhosa e mais demorada do que realizar o 
sequenciamento direto da proteína. 
 
Um outro uso da sequência da proteína é para o controle de qualidade em indústrias 
biofarmacêuticas. Várias companias farmacêuticas produzem produtos que são 
proteínas, por exemplo, hormônios peptídicos, anticorpos, enzimas terapêuticas, 
peptídeos sintéticos. A análise da sequência, especialmente para determinar sítios e 
natureza das modificações pós-traducionais, como glicosilação, é necessário para 
garantir a integridade estrutural destas proteínas. 
 
- Degradação de Edman 
 
Em 1950, Per Edman publicou um método químico para a remoção sucessiva de 
resíduos de aminoácidos a partir da extremidade amino-terminal da proteína ou 
peptídeo. Estas séries de reações foram denominadas de degradação de Edman e o 
método continua sendo o meio químico mais efetivo de remover resíduos de 
aminoácidos de maneira sucessiva a partir de uma cadeia polipeptídica e então 
determinar a ordem em que os aminoácidos estão ligados à partir da extremidade 
amino-terminal de umaproteína ou peptídeo. 
No entanto, o método vem sendo cada vez menos utilizado atualmente e nãos será 
descrito em detalhes aqui. O desenvolvimento da espectrometria de massas nos últimos 
20 anos tornou esta técnica o método de escolha para a determinação da sequência de 
proteínas. 
 
- Clivagem da proteína e produção de peptídeos 
 
Quando se estuda uma proteína existem várias ocasiões em que sua clivagem em 
fragmentos peptídicos menores é necessária. Peptídeos podem ser produzidos por 
clivagem química ou enzimática. Os métodos químicos tendem a produzir fragmentos 
peptídicos muito grandes, pois em geral as reações clivam em aminoácidos menos 
comuns, produzindo 2 ou 3 peptídeos grandes. Métodos enzimáticos tendem a clivar 
ligações peptídicas adjacentes a aminoácidos que são comuns em proteínas (ex. a 
tripsina cliva a cadeia onde tiver lisina ou arginina) produzindo 50 ou mais peptídeos. 
 
- Espectrometria de massas (MS) 
Devido ao absoluto requerimento da produção de íons em fase gasosa a técnica de 
espectrometria de massas por muitos anos ficou restrita à análise de compostos 
pequenos e apolares com massas menores que 500 Da. No entanto, no início da década 
de 80 introduziram-se técnicas de ionização como o electrospray e o MALDI que 
possibilitaram a análise de proteínas por espectrometria de massas. Embora a 
degradação de Edman ainda seja utilizada ocasionalmente, a espectrometria de massas é 
atualmente o método de escolha para a determinação da sequência de aminoácidos. 
Quando peptídeos são fragmentados no espectrômetro de massas, estes são 
fragmentados predominantemente na ligação peptídica (embora outras fragmentações 
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também ocorram, complicando a interpretação do espectro de massas). Isto significa 
que os fragmentos peptídicos gerados diferem sequencialmente da massa de um resíduo 
de aminoácido, podendo a sequência ser deduzida facilmente. Em particular, se há uma 
modificação, ela pode ser observada pelo acréscimo de massa correspondente. O uso da 
espectrometria de massas para a obtenção da sequência de aminoácidos e peptídeos está 
descrito em mais detalhes na Seção 9.5 (Ver Degustação 7). 
A espectrometria de massas em tandem (MS/MS ou MS
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) é cada vez mais utilizado 
para a obtenção de dados de sequência. A proteína digerida (em geral utilizando-se 
tripsina) é introduzida no espectrômetro de massas (com ou sem separação prévia da 
mistura de peptídeos). O íon correspondente a um peptídeo é selecionado no primeiro 
analisador e fragmentado na câmara de colisão e os fragmentos gerados analisados em 
um segundo analisador de massas. O espectro de massa desses fragmentos fornece as 
informações necessárias para a obtenção da sequência daquele peptídeo (Detalhes na 
Seção 9.5).