Programa Protein Purification Andrew Booth

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Protein Purification Andrew Booth- simulação de cinética enzimática 15 28 31 34 37 40 42
Faculty of Biological Sciences University of Leeds UK
Não tem a estrutura da proteína, tem que separar sem saber a estrutura dela
Quando você tem uma proteína desconhecida, você tem poucas informações sobre ela, o único método é tentativa e erro.
Então temos que pensar, vou testar um Ph para saber se a proteína precipita, se ela não precipitar,posso subir esse Ph, se precipitou mais , então eu vou descer..
Se você consegue saber se a proteína é estável de 4 a 10, por exemplo, se vc colocar um Ph muito alto ela vai precipitar, porque geralmente as proteínas são solúveis em meio ácido.
A atividade enzimática da proteína 17 é estável por várias horas a temperaturas próximas à 50°C , com Ph entre 4 e 10,
É interessante fazer um gel antes separar, que aí vc consegue mostrar como mudou o perfil, o antes e o depois, dessa forma é possível mostrar se teve diferença ou não de um para o outro
FOTO GEL 1D E 2D
Gel 1D: (Separa por diferença de massa/ sentido vertical) Você pega sua amostra de proteínas, ferve com SDS (um SDS se liga a um resíduo de aminoácido) o SDS tem muita carga negativa, então você aplica no gel, e aplica um campo positivo, logo as proteínas vão migrar para o polo positivo pois estão com cargas negativas.
Como elas estão todas desenoveladas, porque foram fervidas, estão com a mesma carga, ou seja, tem o mesmo número de cargas negativas por resíduo de aminoácido, então a carga não importa. Por exemplo, se tiver duas proteínas, e uma dela tiver 10 aminoácidos e a outra tiver cinco aminoácidos, a força que elas estão recebendo do campo elétrico é a mesma, porque elas tem um carga negativa por resíduo de aminoácido. Então o que está separando elas no 1 PAGE? As proteínas menores vão migrar primeiro, e as proteínas maiores vão ser retidas.
Gel 2D (Separa por carga/sentido horizontal) Antes de ferver com SDS, você aplica nas proteínas um isoeletrofocalizador (um gel que tem moléculas com Ph diferentes, quando vc aplica a proteína e deixa isoeletrofocalizando, as moléculas vão migrando para o ponto onde elas ficam neutras, no ponto isoletrico delas, então a proteína não está desnaturada). A malha do gel é super fina, o que está fazendo ela migrar é basicamente a força eletrostática. Depois vc pega esse gel e coloca no 1D.
Dizer que está separado por carga, é a mesma coisa que dizer que está separado por pH porque a proteína vai migrando até a hora que ela fica neutra, uma proteína que muito positiva só vai ficar neutra em um Ph bem alcalino e uma proteína que bem negativa vai ficar neutra em um ph ácido.
Tratamento com calor
1ª etapa de enriquecimento: Tratamento com calor, nessa etapa não concentramos a proteína, mas o importante é se a atividade dela específica vai mudar ou não.
A precipitação de proteínas não é um problema, pq se vc tiver 100% de proteína precipitada, obviamente a sua enzima também precipitou. Porém, a precipitação de proteínas mantendo um pouco de enzimas é melhor. quanto mais diferenção vc tem uma da outra é melhor.
Aqui você mostra que vc diminuiu a quantidade de proteínas, mas que sua enzima é estável , então continua com a mesma quantidade dela.
O enriquecimento é o seguinte: Você começa com a 959mg de proteína e você tem 2400 unidades da sua enzima, logo sua atividade específica é o quanto de proteína está rendendo à sua atividade enzimática 2440/959: 2,5 é sua atividade específica .
Quando você tratou com calor, você degradou várias outras proteínas que não eram estáveis, aí você dosa novamente proteína, aí vc passa a ter 2400 unidades/399,5=6,00 (atividade específica, a concentação da enzima aumenta) 6/2,5 (que era a tividade do começo)=2,4 então você aumentou, enriqueceu 2,4x sua atividade específica (foto do Lehninger t:17min, descrever aqui).Enfim, com o tratamento com calor você tirou tudo que não era estável à 50°C.
Vamos parar em 500, porque a gente viu que se dobrar o tempo aumenta muito o custo e não muda praticamente nada o enriquecimento, então não vele a pena.
FOTO GEL 1D E 2D
Tratamento com sulfato de amônio
É um bom método de fracionamento inespecífico , não separa nem por tamanho, nem por carga , por atividade , nada disso. É bom usar quando você não tem ideia do que a sua proteína é, aí um fracionamento usando um sal é uma boa opção para você começar.
Ou você precipita 100% da sua enzima e 0 de protéinas e usa o precipitado, ou vc precipita praticamente nada da enzima e muito da proteína, e usa o sobrenadante.
Fizemos vários testes, para ver qual grau de saturação é melhor. Na prática, esse tratamento vai depender do quanto você tem de material, porque se vc tiver pouco material, você não pode nem ficar fazendo teste, pois em cada teste desse, você precisa ver se a atividade da enzima melhorou. 
Conseguimos enriquecer e não perdemos nada de enzima. Tabela no excel
Fazer gel 1D E 2D
Troca Iônica: Técnica branda 
Agora as etapas ficaram difíceis de ver, não vamos ver muitas mudanças nos spots, se você enriqueceu ela e ela está em pequena quantidade, realmente fica difícil de vê-la.
Spot: porque parecem pontos mesmo
Banda: porque parecem bandas!
A parte mais difícil de você pensar o que você vai fazer, porque há várias técnicas pra você separar a partir de agora. 
Definição: Enche a coluna com grupos positivos com grupos positivos, quando vc passar sua amostra de proteínas, alguns grupos negativos vão grudar. Então sua resina deve estar grudada num contra íon. Se a resina tem grupos amina, ele deve estar ligada à um cloreto, por exemplo. Quando você passa sua proteína negativa pela coluna, ela liga coluna e o Cloreto ou fluoreto vai embora. Tinha íons negativos ligados na sua coluna, aí vc passou sua proteína e trocou os íon negativos pela proteína negativa. Ou seja, sua proteína entra na coluna, se liga eletrostaticamente na coluna, elui tudo que não grudou na coluna e depois você faz eluição de tudo que grudou na coluna. Só grudou eletrostaticamente, não vai desnaturar a proteína.
Trocas fortes: para não perder nenhuma proteína. Se vc tem uma trocadora forte de cátions, qualquer cátion que passar vai se ligar à coluna, se vc tem uma trocadora fraca de cátion, pode ser que alguns cátions ela não pegue. Como não sabemos o quão catiônico é a nossa proteína, é melhor usar uma trocadora forte, a s sefarose ou a q sefarose, a diferença é que uma termina com um grupo sulfato e a outra termina com uma amina.
P definir o ph, escolher um ph que não vai a cabar com a estabilidade da sua proteína
S sefarose: ph 4 resina cationica
Q sefarose: ph 10 resina aniônica
Gradiente: é o numero de frações que vc está coletando