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Cultura de Células Luana Borba luanaborba@biof.ufrj.br biocelxerem2016.2@gmail.com Senha: biocelxerem UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO POLO DE XERÉM DISCIPLINA: BIOLOGIA CELULAR 2016.2 Por quê cultivar células? Para estudar as células nós precisamos cultivá-las! O que é o cultivo de células? Cultivar células consiste em manter vivas células retiradas de um organismo. etc... Para que cultivar células? Cultura de células Bioengenharia Diferenciação celular Metabolismo celular Interação celular Terapia celular Transplantes de tecidos Produção de hormônios Diagnóstico laboratorial Produção de vacinas Estudos de análises de citotoxicidade Estudos de biocompatibilidade Breve Histórico - Início no princípio do século XX com Harrison (1907) e Carrel (1912) método para estudar o comportamento de células animais fora do organismo, em um meio controlado. Harrison Carrel Breve Histórico - Nos primeiros experimentos: Cultivo de células a partir de tecidos fragmentados mecanicamente em frascos contendo fluidos dos animais de onde provinham os tecidos. Harrison queria provar que as fibras nervosas eram formadas a partir de células nervosas. Era necessário observar essas células fora do organismo para comprovar sua teoria. Breve Histórico Experimento de Harrison: Harrison mimetizou as condições básicas necessárias para o crescimento da célula, utilizando células do tubo medular de um embrião de sapo e sua linfa fresca. Harrison teve o cuidado de manter as condições assépticas. Harrison observou sua preparação ao microscópio todos os dias.. Suas considerações sobre a possibilidade de se manter in vitro células vivas por mais de uma semana foram um marco para a cultura de células. Breve Histórico Em 1912, Alexis Carrel desenvolveu um modelo a partir de células cardíacas de embrião de galinha para o cultivo de células. Carrel descobriu a necessidade da troca de fonte de nutrientes contidos nos frascos. Essa renovação constante de nutrientes em cultivo permitiu que as células pudessem ser cultivadas por períodos ainda maiores do que os utilizados por Harrison. Breve Histórico - Em 1916, Peton Rous e Fred Jones desenvolveram o método de subcultivo para explantes empregando tripsina em tecidos de aves e mamíferos. - Em 1923, Carrel e colaboradores desenvolveram os primeiros frascos de cultura, circulares e de vidro, chamados frascos-D. - Em 1948, Keilova adicionou o uso de antibióticos em culturas de células. - Entre 1952-1959, Eagle, Sanford, Leibovity e Dulbecco desenvolveram os meios básicos para cultivo (Eagles basal medium, Eagles minimum essential medium, L15, Dulbecco’s modified Eagle’s medium,...). Breve Histórico - Em 1952, George Gey cultivou células de tecido tumoral humano (carcinoma cervical) estabelecendo a linhagem HeLa, utilizada até hoje em todo o mundo. Breve Histórico Em 1961, Leonard Hayflick e Paul Moorehead verificaram que as células param de se proliferar após um número finito de vezes. Breve Histórico Em 1962, Leonard Hayflick desenvolveu a linhagem de células WI-38, utilizada até hoje para produção de vacinas. Em 1962, Nakamura e colaboradores estabeleceram a linhagem VERO, oriunda de rim de macaco-verde africano (Cercopithecus aethiops). Essa célula é uma das poucas, na atualidade, aprovadas para uso em produção de vacinas pela OMS. Breve Histórico Tipos de cultura: cultura primária e secundária Cultura primária estabelecida a partir do crescimento de células oriundas de um fragmento de tecido obtido por desagregação mecânica ou enzimática. Essas células possuem as características do tecido de origem, podem crescer em cultura por um determinado período de tempo e são denominadas células primárias. - Células que ainda não perderam as características do tecido de origem, mas possuem alta proliferação. - Podem ser mantidas em cultura por um grande período de tempo (quando comparado às células primárias). - Muitas linhagens celulares contínuas podem ser propagadas sem perder suas características por até oitenta passagens! Tipos de cultura: linhagem contínua Essas células são muito utilizadas em pesquisa e na produção de vacinas, como é o caso da linhagem MRC-5, oriunda de tecido de pulmão de feto humano e utilizada na produção da vacina de rubéola. Apresentam características genéticas modificadas, deixando de ser semelhantes morfologicamente e geneticamente ao tecido original. Isoladas a partir de tumores. Alta taxa de multiplicação mantidas em cultura indefinidamente. Exemplos: Linhagem de células epiteliais –HeLa, células de carcinoma de rato‐ CACO‐2 Tipos de culturas: linhagem transformada Tipos de culturas: células aderentes e não-aderentes Células aderentes crescem aderidas a um substrato Células não-aderentes crescem em suspensão Exemplos: células hematopoiéticas, bactérias, fungos, protozoários... Diferentes tipos celulares podem ser cultivados Principais requerimentos para o cultivo de células de mamífero Células podem ser cultivadas em diferentes superfícies plásticas. Temperatura: 37°C Umidade: 95% CO2: 5% Condições de esterelidade (capela de fluxo laminar, materiais autoclavados, meios filtrados, etc.) Principais requerimentos para o cultivo de células de mamífero Obs: O CO2 é importante para manter o pH 7,0-7,6 Também são adicionados agentes tamponantes ao meio de cultura Exemplos: bicarbonato de sódio e HEPES A medida que as células crescem em cultura, ocorre produção de metabólitos que alteram o pH do meio. Esta variação pode ser prejudicial para a célula. Meio de cultura É uma mistura de moléculas necessárias à nutrição da célula. Composição: ◦ água ◦ sais inorgânicos; ◦ açúcares; ◦ aminoácidos; ◦ ácidos orgânicos; ◦ proteínas; ◦ hormônios; ◦ fontes de carbono; ◦ vitaminas; ◦ lipídeos; ◦ fontes de nitrogênio; ◦ micronutrientes (íons orgânicos e minerais), etc. Principais requerimentos para o cultivo de células de mamífero + antibióticos e antifúngicos O meio de cultura deve ter osmolaridade e pH adequados para o tipo celular em estudo. Meios de cultura mais comuns: BME – Basal de Eagle EMEM – Mínimo de Eagle DMEM – Dulbecco – 4x aminoácidos , vitaminas GMEM – Glasgow – 2x aminoácidos , vitaminas + glicose e bicarboanto RPMI – Roswell Park Memorial Leibovitz – fibroblastos Alfa MEM – varios propósitos Ham´s F10 – embriões de galinha Ham`s F12 – complexo de suplementos Ham´s F14 – estudo de neurônios sensoriais IMDM – Iscove MCDB – fibroblastos humanos KO-DMEM Principais requerimentos para o cultivo de células de mamífero Principais requerimentos para o cultivo de células de mamífero Exemplos de aplicações da cultura de células na Biologia Celular Clonagem reprodutiva e terapêutica Figura 8.6 Biologia Molecular da Célula, 2008. Exemplos de aplicações da cultura de células na Biologia Celular Figura 8.5 Biologia Molecular da Célula, 2008. Células-tronco Exemplos de aplicações da cultura de células na Biologia Celular Produção de células híbridas Figura 8.7 Biologia Molecular da Célula, 2008. Exemplos de aplicações da cultura de células na Biologia Celular Produção de anticorpos Figura 8.8 Biologia Molecular da Célula, 2008. https://www.youtube.com/watch?v=z_aK6pH3_G8 Vídeo 1: Cultura de células de mamífero https://www.youtube.com/watch?v=xJannNQPors Vídeo 2: Cultivo de bactérias em meiosólido Bibliografia Capítulo 8 – Manipulação de proteínas, DNA e RNA. Biologia Molecular da Célula (5 edição, 2007 ou 6 edição, 2015).
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