Regulação da Expressão Gênica

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Controle da Expressão Gênica
Prof. Sergio Crovella
crovelser@gmail.com
Por que é importante controlar a
expressão dos genes???
Alguns produtos gênicos só
são necessários em algumas
condições ambientais.
Gastos desnecessários de
energia.
Evolução de mecanismos regulatórios ‐ Síntese de
produtos gênicos apenas quando são necessários
(melhor utilização da energia do organismo).
Organismos procariontes
Oportunistas nutricionais –
obter nutrientes no ambiente
Obtenção  X  Produção
Alto gasto energético
Enzimas necessárias para
produção somente quando
não houver nutriente
disponível no ambiente.
As bactérias podem obter energia de diferentes tipos de
açúcares (glicose, lactose, galactose, xilose).
É necessário um conjunto de enzimas para processar cada
um desses açúcares.
Se a célula produzisse simultaneamente todas as enzimas,
ela gastaria muito mais energia do que obteria pela
degradação dessas fontes de carbono.
A célula criou mecanismos para “desligar” a transcrição de
todos os genes codificantes de enzimas que não são
necessárias em determinado momento, e “ligar” os genes
codificantes das enzimas que são.
A regulação da síntese de um transcrito gênico e seu
produto protéico
CONTROLE DA
EXPRESSÃO GÊNICA
Controle da expressão em procariontes pode ocorrer
em vários níveis:
•  Transcrição
•  Processamento do mRNA
•  Tradução
•  Pós‐tradução
Procariontes
Regulação ‐ Transcrição gênica
RNA  polimerase
Impedida ou reduzida
Induzida
Expressão
Gênica
Mecanismos de controle:  1) positivo
                                                2) negativo Genes reguladores
1) Positivo: o produto do gene regulador (proteína ativadora)
se liga ao DNA facilitando a transcrição.
2) Negativo: o produto do gene regulador (proteína
repressora) se liga ao DNA inibindo a transcrição.
Como isso acontece???
O que possibilita as proteínas reguladoras (repressoras
ou ativadoras) poder ou não ligar‐se ao seu sítio alvo
no DNA é a presença ou ausência de moléculas
efetoras.
Ligam‐se às proteínas reguladoras e causam mudanças na
estrutura destas, resultando em alterações em sua atividade.
Alterando a sua capacidade de se ligar aos sítios alvos no DNA.
São geralmente pequenas moléculas tais como aminoácidos,
açúcares e metabólitos similares.
Sistema lac
François Jacob e Jacques Monod (1961) – Regulação do
metabolismo da lactose.
Óperon lac
•  Permease (Y): transportar a lactose para a célula.
• β- galactosidase (Z): quebra da molécula de lactose em
glicose e galactose.
•  Transacetilase (A): função desconhecida.
Gene regulador (i)
Operador
Promotor
Genes estruturais
Óperon
Modelo Óperon lac
lacZ lacY lacA
Operons Induzíveis – Normalmente estão desligados e precisam ser
ativados para serem expressos.
Operons Repressíveis– Normalmente estão ligados e precisam ser
desativados para não serem expressos.
Repressível Positivo
Induzível Negativo Induzível Positivo
Controle Negativo
• Proteína repressora ligada ao
sítio Operador (O);
• Impedimento físico da ligação
da RNA polimerase com o sítio
Promotor (P);
• Transcrição das enzimas
necessárias para degradação da
lactose não ocorre.
Na ausência da lactose:
Na presença da lactose:
• O efetor alolactose (derivado da
lactose) se liga a proteína repressora,
alterando sua conformação e
conseqüentemente liberando o sítio
Operador (O);
• O sítio Promotor (P) deixa de ser
bloqueado pela proteína repressora;
• Ocorre a transcrição das enzimas
necessárias para a degradação da
lactose.
Algumas moléculas dos produtos gênicos lacZ, lacY
e lacA são sintetizadas mesmo no estado não
induzido, fornecendo um baixo nível de atividade
enzimática.
Essa atividade é essencial para a indução do óperon
lac, já que o efetor do óperon, a alolactose, é
derivada da lactose numa reação catalisada pela β-
galactosidase.
Um mesmo óperon pode ser
regulado positivamente por uma
proteína e negativamente por
outra ???
Sim!!!
Controle Positivo
A célula capta mais energia com a degradação da glicose do
que de outros açúcares, sendo assim é mais eficiente degradar
glicose que lactose.
Foram desenvolvidos mecanismos de controle que impedem
que a célula produza as enzimas para degradação da lactose
quando a glicose está presente. Mesmo que a lactose também
esteja.
Repressão catabólica (proteína ativadora)
CAP (proteína ativadora do catabolismo)
CAP sozinha não consegue se ligar ao sítio CAP do
óperon lac.
CAP + efetor cAMP é capaz de se ligar ao sítio CAP
do DNA, interagir fisicamente com a RNA polimerase,
aumentando a afinidade da enzima com o promotor
lac.
Como a presença da glicose influencia nesse
mecanismo???
Glicose cAMP
Glicose cAMP
cAMP (monofosfato cíclico de adenosina)
A glicose impede a atividade da adenilciclase, enzima que catalisa a
formação de cAMP a partir de ATP.
Resumindo o óperon lac...
Glicose cAMP CAP‐cAMP RNA
polimerase
Metabolismo da
lactose
Glicose cAMP CAP‐cAMP RNA
polimerase
Metabolismo da
lactose
Somente se a lactose estiver presente!
Libera a proteína
repressora
RNA
polimerase
Uma mesma proteína
pode atuar como
repressor e ativador
no controle da
expressão de um
óperon???
Modelo Óperon  ara
araB araA araDC O I
Genes estruturaisGene
controlador Operador
Região
iniciadora
•  Operador
•  Promotor
• Os genes estruturais (araB, araA e araD) codificam as
enzimas metabólicas que degradam o açúcar arabinose.
• O gene controlador (araC) codifica uma proteína que se
comporta como ativadora e como repressora.
• O sistema CAP‐cAMP também regula a expressão do
óperon ara.
Na presença da arabinose:
• A proteína do gene araC reconhece a
arabinose e forma o complexo AraC‐
arabinose.
• Tanto CAP‐cAMP quanto o complexo
AraC‐arabinose se ligam a região
operadora de araI.
• A ligação da RNA polimerase ao
promotor é facilitada e ocorre a
transcrição das enzimas necessárias
para a degradação da arabinose.
Na ausência da arabinose:
• A proteína AraC adota uma
conformação diferente.
• Liga‐se tanto a região operadora do
araI quanto ao araO , formando uma
alça.
• Essa alça impede a transcrição das
enzimas necessárias para a
degradação da arabinose.
Dessa forma, a proteína AraC apresenta duas
conformações, uma que atua como um ativador
e outra como repressor dos genes responsáveis
pelas enzimas que atuam na degradação da
arabinose.
Eucariotos
• Ativadores
• Histonas
• Metilação
• Promotores e acentuadores
• Splicing
• Estabilidade do mRNA
• Silenciamento do mRNA (miRNA, siRNA)
• Alterações na proteína.
Expressão
gênica
Expressão
gênica
4
5
EXPRESSÃO  GÊNICA
   O termo expressão gênica refere­se
ao processo em que a informação
codificada por um determinado gene é
decodificada em uma proteína.
Teoricamente, a regulação em
qualquer uma das etapas desse
processo pode levar a uma expressão
gênica diferencial.
Expressão
gênica
Expressão
gênica
4
6
Objetivos da regulação da expressão gênica
em bactérias e em organismos multicelulares
• Nas bactérias o controle da expressão
gênica serve principalmente para permitir
que as células se ajustem às mudanças
nutricionais no ambiente, de forma que o
seu crescimento e divisão sejam otimizados.
• Em organismos multicelulares a expressão
gênica controlada regula um programa
genético fundamental para o
desenvolvimento embrionário e a
diferenciação.
Expressão
gênica
Expressão
gênica
4
7
As Três RNA­Polimerases das
Células Eucarióticas
• RNA­polimerase I ­   transcreve os genes para
rRNA.
• RNA­polimerase II ­  transcreve todos os
genesque codificam proteínas, mais alguns
genes que codificam pequenos RNAs (p.ex.,
aqueles presentes nos  “spliceosomes”).
• RNA­polimerase III – transcreve os genes de
tRNAs, rRNA 5S e genes para pequenos
RNAs estruturais.
Expressão
gênica
Expressão
gênica
4
8
Fatores Gerais de Transcrição
   Os fatores gerais de transcrição são
responsáveis pelo posicionamento
correto da RNA­polimerase no
promotor, ajudam na separação das
fitas de DNA para permitir o início da
transcrição, e liberam a RNA­
polimerase do promotor quando a
transcrição se inicia.
Expressão
gênica
PONTOS DE CONTROLE DA EXPRESSÃO
GÊNICA
1. Regulação a nível transcricional
2. Controle do processamento do RNAm pela
determinação de quais éxons presentes no
precursor do RNAm são retidos no RNAm final
funcional.
3. Controle da estabilidade da taxa de degradação
do RNAm final.
4. Controle do processamento de Tradução do
RNAm em proteína.
As formas de regular a
expressão Gênica
Expressão
gênica
NUCLEO
Cromatina
DNA
Transcrição
Processamento
CAP
Cauda
mRNA
EXON
INTRON
RNA
CITOPLASMA  CÉLULA
mRNA
Tradução
Degradação
do mRNA
Polipeptídeo
Proteína Ativa
Proteína Degradada
Expressão
gênica
DNA
RNA
TRANSCRITO
RNA
FUNCIONAL
RNA PRÉ
TRADUCIONAL
TRADUÇÃO
PROTEÍNA
PROTEÍNA
ATIVA
PROTEÍNA
INATIVA
NUCLEO
CITOPLASMA
Empacotamento, Metilação,
Rearranjos, Amplificação,
Heterocromatina, Inativação­X,
Organização do DNA Promotores, Acentuadores,
Fatores de Transcrição, Proteínas
Ligantes e Repressores
Cauda PoliA, Splicing, Adição do CAP
Degradação, Entrega, Impedir ligação
com Ribossomo, RNAi
Ligação Ribossomal, Regulação do
produto final
Clivagem, Fosforilação, Dobramento,
Modificação dos Radicais Inibição e Degradação
Expressão
gênica
MEIOS DE REGULAÇÃO
Regulação ao nível
transcripcional
Expressão
gênica
5
4
5’ 3’ UTRUTR ORF
ESTRUTURA DO GENE
EUCARIOTO
GENE HUMANO TIPICO
Expressão
gênica
Expressão
gênica
Expressão
gênica
FATORES DE TRANSCRIÇÃO
Domínios funcionais:
. Domínio de ligação ao DNA
     . Domínio de transativação
Características:
Os fatores de transcrição podem conter
domínio de ligação DNA diferentes, mas se ligar
ao mesmo domínio de transativação em
diferentes tecidos, ou podem ter domínio de
ligação ao DNA diferente e domínio de
transativação diferente em diferentes tecidos.
Expressão
gênica
1. ELEMENTOS DE AÇÃO CIS DO PROMOTOR
2.   FATORES DE TRANSCRIÇÃO DE AÇÃO TRANS
CONTROLE A NÍVEL
TRANSCRICIONAL
Elementos CIS
Expressão
gênica
ELEMENTOS DE AÇÃO CIS
São sequências de ação cis que existem como
sequências de pares de bases que podem ser
adjascentes, dentro de um gene, ou podem estar a
milhares de distantes de pares de bases de um gene.
São elas:
1. O Elemento cerne do promotor
2. Os elementos proximais do promotor
3. Os elementos promotores distais:
Expressão
gênica
1. O Elemento cerne do promotor:
situado a 5’ do gene e compreende o sítio onde o
complexo contendo a RNA polimerase II é
montado no DNA. Compreende dois sítios: O
elemento inr (iniciador) e o elemento TATA.
6
0
Expressão
gênica
2. Os elementos proximais do promotor: atuam como
sítios de ligação para proteínas. Se situam de 50 a
algumas centenas de pares de bases antecedentes ao
ponto de início do gene. As seqüências são: CAAT ou
GC, elementos RE (elementos de resposta).
Expressão
gênica
3. Os elementos promotores
distais: são seqüências de ação cis que
ocorrem a milhares de pares de bases de
distância do ponto de inicial da transcrição. Estes
sítios são chamados: enhances ou
silenciadores.
6
2
Expressão
gênica
ACENTUADOR ACENTUADOR
5’ 3’
RE OCT GC CAAT TATA Inr
­1000 + 1000­120 ­90 ­75 ­30 0
Elementos
promotores proximais Cerne do
promotor
Localização das sequências de
Ação Cis em Um Gene Humano
Típico
Expressão
gênica
Sequência de Ação Cis Fatores de
Transcrição
Elemento Cerne do Promotor
 Inr
 TATA
RNA polimerase II
 TBP
Elementos Proximais do Promotor
 CAAT CTF
 GC Sp1
 Octâmero OTF
Elementos de Resposta (RE)
 GRE Receptor de Glicocorticóides
 TER AP1
 CRE CREB
Elementos distais do Promotor
 Acentuadores Ativadores
Silenciadores Repressores
Fatores TRANS
Expressão
gênica
FATORES DE TRANSCRIÇÃO DE AÇÃO
TRANS
São proteínas que se ligam aos elementos de ação
cis no DNA e interagem com outros fatores de
transcrição.
Classificação
1. Fatores gerais da transcrição (GTFs): conjunto de
30 ou mais proteínas que se ligam no cerne do
promotor e recrutam a RNA polimerase II para
formar o complexo de pré­iniciação.
2. Fatores comuns de transcrição: são proteínas que
se ligam a fatores comuns de ação cis proximais a
muitos promotores, tais como as seqüências CAAT e
GC.
Expressão
gênica
FATORES DE TRANSCRIÇÃO DE
AÇÃO TRANS
3. Os fatores de trancrição indutíveis: São proteínas
que nem sempre são ativas em uma célula. Elas
respondem a estímulos externos que as ativam e
potenciam sua ligação as sequências RE. Ex.
4. Proteínas ativadoras: São fatores de transcrição que
se ligam a acentuadores e aumentam o início da
transcrição de um gene.
5. As proteínas repressoras: São fatores de
transcrição que se ligam a silenciadores e inibem o
início da transcrição de um gene.
Expressão
gênica
Mecanismo Molecular
6
8
Expressão
gênica
Expressão
gênica
6
9
Formação do Complexo de
Iniciação da Transcrição
• TFIID liga­se a região TATA,
possibilitando a ligação de TFIIB.
• Isso é seguido pela ligação de TFIIF e
RNA­polimerase II.
• TFIIE, TFIIH e TFIIJ então se juntam ao
complexo.
• TFIIH usa ATP para fosforilar a RNA­
polimerase II, mudando a sua
conformação de forma que a RNA­
polimerase é liberada do complexo e é
capaz de iniciar a transcrição.
Expressão
gênica
Etapas na formação do complexo
de iniciação da transcrição em
eucariotos
Expressão
gênica
Expressão
gênica
7
1
Estrutura tridimensional da Proteína que
se liga a TATA (TATA­Binding Protein TBP)
Expressão
gênica
Expressão
gênica
7
2
Complexo TBP­DNA
Expressão
gênica
Expressão
gênica
7
3
Complexo TBP-TFIIA-
DNA
Expressão
gênica
Expressão
gênica
7
4
Complexo TBP-TFIIA-TFIIB-
DNA
Expressão
gênica
INICIO DA TRANSCRIÇÃO PELA RNA
POLIMERASE II
FORMAÇÃO DO COMPLEXO BASAL DA
TRANSCRIÇÃO
TF
IID
DNATBP
6
0 15
0
25
0
11
0
GC In
r
TAT
A
TFIID-TBP DNA TFIIA + TFIIB + TFIIF / RNA
polII
 + TFIIE + TFII H
Seqüência de Ligação
Expressão
gênica
RNA Pol II
INICIO DA TRANSCRIÇÃO PELA RNA
POLIMERASE II
LIGAÇAO DOS FATORES DE TRANSCRIÇAO
AO COMPLEXO
TF
IID
DNA
TBP
TFII
B
TFII
A
TFII
F
TFII
E
TFII
H
GC In
r
TAT
A
Expressão
gênica
ATIVAÇÃO DO COMPLEXO
BASAL DA TRANSCRIÇÃO
TF
IID
15
0
25
0
TBP
6
0
11
0
ACT
DNA
GC
In
r
TAT
A
ACENTUADOR
SP
1
Expressão
gênica
GLICOCORTICÓIDES
G
RECEPTOR DE
GLICOCORTICOIDES
G
HORMONIO
SEXUAL
RIBOSSOMOS
PROTEÍNA
TRANSCRIÇÃO INDUZIDA POR HORMÔNIOS
ESTERÓIDES
RNAm
BTF
HRE
+
G
RECEPTOR DE
ANDRÓGENOS
Expressão
gênica
LCR
5’ ζ Ψζ Ψ α Ψ α α1 α2 θ1
Grupamento da alfa
globina
y y
LCR
5’
βЄ δβ1ΨAG
Grupamento da beta
globina
Grupamento dos genes da alfa globina e da
beta globina sob o controle de uma região
controladora de Locus (LCR)
Controle Pós­transcricional
Expressão
gênica
SPLICING DO
PRÉ- RNAm
MECANISMO DE
AÇÃO DOS
SPLICIOSSOMOS
Expressãogênica
Controle pós­
transcricional
A presença de mais de um promotor
dentro de um gene pode resultar em
quantidades diferentes do mesmo
produto gênico sendo produzidas em
tecidos diferentes.
Expressão
gênica
5’ 3’
5’
AAAA
3’
AAAA
3’
5’
GENE DA ALFA
AMILASESitio de inicio da transcrição na glândula
salivar Sítio de início da transcrição no
fígado
Recomposição na glândula
salivar
Recomposição no fígado
Éxons Íntrons
Expressão
gênica
5’ 3’
AAAAn
5’ 3’
AAAA
5’ 3’
Éxon
s
Íntron
Gene da Cadeia Pesada Mu de Imunoglobulina
Recomposição e poliadenilação produzem uma
cadeia pesada Mu ligada a membrana
Recomposição e poliadenilação produzem
uma cadeia pesada Mu secretada
2 1
Expressão
gênica
1 2 4 2 3
5a
4 5a
1 2 3 4 AAAA 1 2 3 5a 5b AAAA
Seleção de Éxons Durante a Recomposição:
O Gene de Calcitonina
5’ 3’
Tireóide Neurônios
Recomposição e poliadenilação de RNAm
Proteína Precursora
Produto Final
Calcitonina CGRP
ÉXONS ÍNTRONS
1 2
Expressão
gênica
1- Controle Transcrição
Proteínas Ativadoras/
Repressoras e Fatores de
Transcrição
RNA polimerase II
Expressão
gênica
1- Controle na
Transcrição
Expressão
gênica
1- Controle na
Transcrição
Remodelação da cromatina
Expressão
gênica
1- Controle na
Transcrição
Conjuntos de Reguladores podem
ser tecido-específicos:
Expressão
gênica
2- Controle Pós-
transcrição
RNA primário → RNAm
– Preparação para a tradução;
– Exportação para o citoplasma;
– Persistência do RNAm
» Ex.: citocinas
– Splicing alternativo
» Ex.: MASPs
Expressão
gênica
2- Controle Pós-
transcrição
Splicing Alternativo
Genoma do HTLV­1
Expressão
gênica
2- Controle Pós-
transcrição
Remoção de RNAm
Expressão
gênica
3- Controle na Tradução
O exemplo da ferritina/transferrina:
Expressão
gênica
miRNA Introdução
rRNA
miRNA
miRNA
Interrupç
ão
O que é um microRNA (miRNA)?
• Classe de pequenos RNAs reguladores, “escondidos”
no genoma (regiões intergênica e intrônica ou “DNA
lixo”)
• Estes miRNA de 22 nucleotídeos foram descobertos
em estudos de regulação do desenvolvimento de C.
elegans (lin‐4 e let‐7)
• Alguns com expressão constitutiva, e outros com
controle de expressão  temporal‐ e tecido‐específica
Definições
• Os miRNAs têm  aproximadamente 20 a 22 nucleotídeos,
e constituem uma classe de reguladores gênicos que
foram identificados em plantas e animais.
• Eles regulam seu alvo de dois modos que  dependem do
grau de complementaridade entre o miRNA e o alvo
              RNAi                       Mecanismos sem clivagem
complementaridade perfeita ou
quase perfeita a seqüências
codificadores de mRNA
complementariedade imperfeita em
regiões 3’ não traduzidas (UTRs)
do RNAm­alvo
RNAi
• As cópias de mRNA são clivadas através de
ribonucleases no complexo RISC (RNA Induced‐
Silencing Complex), o que resulta na degradação
do mRNA.
• O mecanismo de silenciamento genético mediado
por miRNA foi encontrado em plantas, e também
foi demonstrado em mamíferos.
• Estão envolvidos no sistema de defesa da célula.
• Degradam RNA, especialmente aqueles que estão
em fita dupla
Mecanismos Sem Clivagem
• Complementariedade imperfeita em regiões 3’ não
traduzidas (UTRs) do RNAm‐alvo
• Inibem a expressão do gene de maneira pós‐
transcricional, aparentemente ao nível da tradução,
por um complexo RISC que é semelhante, ou
possivelmente idêntico ao usado na via de RNAi.
• Resultados recentes indicam que os miRNAs que têm
complementaridade parcial com os alvos também
podem induzir degradação do mRNA, mas não foi
identificado se esta inibição precede a desestabilização
dos genes‐alvo.
miRNA
• Os miRNAs parecem ser transcritos através da RNA
polimerase II, e são inicialmente RNA grandes chamados
de pri‐miRNAs.
• Os pri‐miRNAs são processados no núcleo pela enzima
RNase III (Drosha) e outras proteínas (Pasha) em pré‐
miRNAs, com aproximadamente 70 nucleotídeos que
dobram em estruturas com loops imperfeitos.
• O pre‐miRNA é exportado ao citoplasma e sofre um
processamento adicional, no qual uma dupla fita de
RNA com 22 nucleotídeos chamada miRNA duplex é
cortada do pre‐mi RNA hairpin por outra RNAse III
(Dicer). O miRNA duplex é incorporado ao complexo
RISC. A fita miRNA madura é mantida no complexo
miRISC e regula negativamente os seus genes‐alvo.
Caracterização biológica de miRNAs
• miRNA são altamente
conservados em grupos
filogenéticos afastados
(insetos, peixe e humano)
miRNA
• Estima‐se a existência de pelo menos 300 miRNAs (e podem
ser mais de 1000) no genoma humano, o que significa entre
1% e 4% dos genes expressos, portanto, o miRNA é uma das
maiores classes de reguladores gênicos.
• A maior parte do miRNA humano está localizado em introns
• O miRNA restante fica situado longe de outros transcritos no
genoma, entre os exons de genes não codificante ou entre as
áreas 3’UTRs, ou estão agrupados em outros genes miRNA,
incluindo um agrupamento no cromossomo 19 onde estão
localizados 54 miRNAs.
miRNA
• Estudos apontam que um único complexo RISC pode se ligar à
mais de 200 genes‐alvo, e estes alvos podem ter funções
diversas, tais como fatores de transcrição, receptores e
transportadores
• Os miRNAs controlam a expressão de cerca de um terço do
mRNA humano, e a deleção ou alteração na expressão pode
contribuir para diversas doenças, incluindo o câncer.
• Um estudo recente apontou que 50% dos miRNA estão
localizadas em áreas do genoma, conhecidas como regiões
frágeis (fragile sites). Estas regiões são locais preferenciais
para trocas de cromátide, translocações, deleções,
amplificações e integração plasmídeos e vírus associados ao
câncer, tais como o HPV.
miRNA e Câncer
• Variações germinativas na expressão ou
seqüências do miRNA podem predispor ao
câncer ao afetar a expressão de genes
supressores de tumor ou oncogenes.
• Correlação de expressão com um tipo
particular de tumor
• Ativação de oncogenes
• Silenciamento de supressores tumorais