Slides aula 11

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SINOPSE
* Assunto: Tecnologia do DNA recombinante.
* Pré-requisito: Conhecimento dos conceitos básicos das 
técnicas básicas de biologia molecular.
* Objetivo: Descrever os princípios das técnicas de biologia 
molecular empregando as enzimas de restrição e eletroforese.
* Bibliografia:
1 – MYR. Genômica.
2 – PIERCE. Genética. Um enfoque conceitual.
3 – WATSON. Biologia Molecular do gene.
4 – STRYER. Bioquímica.
Tecnologia do DNA recombinante
Dr. Paulo Roberto Queiroz
Enzimas de restrição 
Enzimas produzidas por bactérias para restringir a proliferação
de vírus invasores;
Diferentes tipos de enzimas clivam diferentes sequências de
bases de DNA;
Ajuda a detectar a presença de diferentes formas de
determinados genes.
Enzimas de restrição
São enzimas que reconhecem seqüências específicas de
DNA dupla-hélice e cortam ambas as cadeias da dupla-fita em
lugares determinados.
Aplicações:
• Análise da estrutura dos
cromossomos;
• Isolamento de genes;
• Criação de novas moléculas de
DNA.
Sistemas de Restrição
Mecanismo de defesa presente quando da entrada do DNA do fago
na célula;
Combinação de enzimas de restrição com metilases:
ü Hidrólise do DNA “estranho”;
ü Proteção do DNA celular relativamente as enzimas de
restrição pela adição de grupos metil às bases A ou C.
A DNA metilase possui a
mesma sequência de
reconhecimento que os enzimas
de restrição;
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Sítio de restrição
Seqüência de DNA que sofre a ação da enzima de
restrição.
Características
1 – Comprimento de 4 a 8 pares de bases.
2 – Simetria palíndromo. Ex:
Nomeclatura:
1 – Nome com 3 letras (espécie
produtora);
2 – Designação da linhagem;
3 – Número romano.
Exemplo:
EcoRI = Escherichia coli linhagem R
enzima I
Sequências de reconhecimento
Não ambíguas
ü Exemplo:
BamHI - só reconhece a sequência GGATCC
CCTAGG
Ambíguas
ü Exemplo:
HInf I - reconhece sequências de 5 pb iniciadas 
por GA e que terminem em TC.
Tipos de enzimas de restrição
Classificação baseada em:
Composição da sequência nucleotídica;
Posição de clivagem;
Sequência de reconhecimento;
Cofatores envolvidos;
Estrutura da enzima em questão.
Tipos de enzimas de restrição
Tipo I
3 subunidades:
ü 1 subunidade de restrição (“R”);
ü 1 subunidade de metilação (“M”);
ü 1 subunidade de reconhecimento (“S”);
Sequência de reconhecimento é assimétrica;
Local de hidrólise não é específico e ocorre a mais de 1000 bp de 
distância;
Hidrólise é sempre em um local diferente e necessita de ATP; 
Impede o seu uso em engenheira genética.
Tipo III
2 subunidades:
ü 1 subunidade de restrição (“R”);
ü 1 subunidade de metilação e reconhecimento (“MS”);
Sequência de reconhecimento é assimétrica (5 a 7 pb);
Dupla cadeia de DNA hemimetilada;
Local de hidrólise a mais de 24 a 26 pb de distância;
Hidrólise é sempre em um local diferente e necessita de ATP.
Impede o seu uso em engenheira genética.
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Tipo II
Duas enzimas:
ü 1 enzima de restrição (Endonuclease);
ü 1 enzima de metilação (Metilase);
Estrutura com 4 folhas β e 1 hélice α;
Sequência de reconhecimento é palindrômica 4 a 8 pb;
Hidrólise ocorre dentro ou nas extremidades da sequência
reconhecida;
Não necessita de ATP, apenas Mg2+.
Importantes na recombinação genética e na elaboração 
de mapas de restrição (especificidade de corte).
Produtos das enzimas de restrição
* Extremidades adesivas (Sticky ends): os cortes são feitos
simetricamente, porém, fora do eixo de simetria, gerando
extremidades com bases despareadas.
* Extremidades abruptas (Blunt ends): os dois cortes ocorrem
no eixo de simetria da seqüência específica, gerando
extremidades sem bases despareadas.
Izosquizômeros
Diferentes enzimas de restrição que possuem a mesma
sequência de reconhecimento;
Diferem nas condições ótimas de reação, na estabilidade.
Enzimas de 
restrição
Sequência de 
reconhecimento
SacI
GAGCTC
CTCGAG
SstI GAGCTCCTCGAG
Exemplo:
Enzimas compatíveis
Produzem extremidades protuberantes compatíveis.
Sobreposição parcial de sequências de reconhecimento;
DNA recombinado com sequência híbrida;
Enzimas de 
restrição
Sequência de 
reconhecimento
BamHI
GGATCC
CCTAGG
BglII AGATCT
TCTAGA
Exemplo:
Fatores que influenciam a atividade
das enzimas de restrição
Composição do tampão
ü Diferem na força iônica (concentração de sal);
ü Diferem no catíon principal (Na+ ou K+);
ü Solução: Manter o pH da reação (geralmente em pH 8.0).
Digestão com múltiplas enzimas
Influência da metilação no DNA
ü Existe algumas endonucleases de restrição que não clivam DNA metilado.
Temperatura de incubação
ü A maioria das enzimas tem atividade ótima a 37 ºC;
ü Exceções: Bactérias termofílicas – atividade ótima entre 50 ºC a 60 ºC;
Enzimas com tempo de meia vida pequeno a 37 ºC, recomenda-se a 
incubação a 20 ºC.
Hidrólise Enzimática
A hidrólise dá-se ao nível
das ligações fosfodiéster.
Mg+2 é um cofator
essencial, mas pode ser
substituído por certos
cátions divalentes, como
Mn+2.
Produtos da hidrólise
resultam em
extremidades 3’-OH e
5’-P.
5’
3’
5’
3’
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Hidrólise Enzimática
A cadeia de DNA pode ser hidrolisada para dar origem a pontas
cegas (blunt ends) ou pontas coesivas (sticky ends);
Duas cadeias com pontas cegas podem ser unidas por uma DNA-
ligase, mesmo sendo de origens diferentes;
Uma cadeia com pontas coesivas liga-se com maior facilidade a
cadeias com sequências complementares.
ELETROFORESE
Consiste na separação de moléculas, em função da
sua massa molecular, quando submetidas a um campo
elétrico.
ØUsa um substrato: papel, agarose e poliacrilamida;
ØSepara proteínas por cargas e massa molecular;
ØSepara ácidos nucléicos por massa molecular, sendo que os
menores migram mais rapidamente.
Eletroforese
Critério de decisão na
escolha da matriz.
Princípio
* Quanto maior a concentração do gel = menor a
malha do gel:
Moléculas pequenas passam mais rapidamente;
Moléculas grandes sofrem atraso na corrida.
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Agarose = fragmentos grandes
de DNA (até 20 kb). Técnicas
de rotina de biologia molecular.
Poliacrilamida = fragmentos
curtos de DNA (até 1000 pb).
Exame de vínculo de paternidade.
Tipos de géis para a análise de ácidos nucléicos
Agarose % (p/v) Faixa de separação (kb)
0,3 5 – 60
0,6 1 -20
0,7 0,8 – 10
0,9 0,5 – 7
1,2 0,4 – 6
1,5 0,2 – 3
2,0 0,1 – 2
Faixa de separação de géis de agarose
usados em rotina de Biologia Molecular.
Acrilamida % (p/v) Faixa de separação (kb)
3,5 1000 – 2000
5,0 80 – 500
8,0 60 – 400
12,0 40 – 200
15,0 25 – 150
20,0 6 – 100
Faixa de separação de géis de poliacrilamida
usados em rotina de Biologia Molecular.
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1 – Desnaturante SDS-PAGE
Adciona-se SDS (detergente aniônico) = carga
negativa a proteína.
Usa-se b-mercaptoetanol = rompe ponte dissulfeto
= desnatura a proteína.
Aplicação:
1 - Expressão do produto gênico;
2 – Western Blot;
3 – Identificação de proteínas por massa
molecular;
A poliacrilamida é o resultado da polimerização de dois
reagentes:
1 - Acrilamida
2 - Bis-acrilamida.
Os dois reagentes são ativados pelos catalisadores
TEMED e persulfato de amônio.
A ativação da acri/bis resulta em uma malha que é
usada para a separação de proteínas e ácidos nucléicos.
RFLP (Polimorfismo no Comprimento de 
Fragmentos de Restrição)
Polimorfismo é detectado:
1 – Corte na dupla fita de DNA com enzima de restrição;
2 – Hibridação com sonda de DNA marcada (radioativa
ou luminescente).
3 - Seqüências de DNA entre indivíduos sejam distintas.
BASE GENÉTICA DO RFLP
Polimorfismo visto no RFLP:
1 – Diferença na presença de
sítios de restrição (SR) entre
genomas diferentes.
2 - Diferençasnos SR’s:
- Mutações;
- Inserções e deleções;
- Rearranjos
(translocações ou
inversões).
Resultado = altera a
distância entre pares de sítios de
restrição.
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Polimorfismo visto no RFLP:
É devido aos eventos genéticos que ocorrem nos sítios
de restrição!
Função da técnica de RFLP:
è Detectar diferenças na seqüência de DNA entre
indivíduos.
Etapas envolvidas no RFLP
1 – Extração de DNA;
Quantidade e pureza.
2 – Digestão com enzima de
restrição;
EcoRI, EcoRV, HindIII,
PstI...
Polimorfismo nos SR’s.
3 – Eletroforese em agarose;
Separação dos fragmentos.
(104 a 107 fragmentos)
Etapas envolvidas no RFLP
4 – Southern blot (nylon ou nitrocelulose);
Pode ser usada várias vezes.
5 – Hibridação com sonda;
Ligação aos fragmentos homólogos à sonda.
Radioativa ou luminescente.
6 – Autoradiografia.
Marcadores moleculares
Vantagens do RFLP
* Potencial para cobrir todo o genoma do indivíduo
analisado;
* Marcador de expressão co-dominante (identificar
homo e heterozigotos);
* Análise de regiões que codificam produtos gênicos e
não-transcritas.
* Usa DNA = maior estabilidade.
* Reutilização das membranas.
Limitações do RFLP
* Vários passos intensivos de mão-de-obra;
* Construção de bibliotecas para iniciar o estudo;
* Uso de material radioativo;
* Não é uma técnica de fácil manuseio;
* Custo pode ser proibitivo;
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1 Para ter validade na identificação do suspeito do crime, os padrões eletroforéticos
mostrados na figura devem estar analisando o mesmo locus dos suspeitos.
2 Os loci em que as seqüências de DNA apresentam pouca variabilidade são ideais
para a realização desse tipo de teste.
3 O indivíduo B pode ser eliminado das investigações, enquanto os indivíduos A e C
permanecem como suspeitos.
4 Os padrões de bandas de A e B excluem a possibilidade de os mesmos terem
qualquer grau de parentesco.
5 No esquema, enquanto as bandas inferiores (número de repetições próximo de 5)
refletem material com carga positiva, as bandas superiores (números de repetições
próximos de 30 ou de 35) refletem material com carga negativa.
Perito – Polícia Federal – 2002 - A figura acima mostra
o padrão eletroforético do DNA de três indivíduos
suspeitos de crime de estupro — A, B e C — e do DNA
obtido na cena do crime — F. A eletroforese realizada
revela o número de repetições (VNTR) de uma
seqüência curta de DNA encontrado em um locus do
genoma humano. A respeito dessa situação e com o
auxílio da figura acima, julgue os itens subseqüentes.
C
E
E
E
E