"REGENERAÇÃO DE CÉLULAS CILIADAS APÓS OTOTOXICIDADE COM AMINOGICOSÍDEO NA CÓCLEA DE AVES"

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ISSN 1806­9312  
Segunda, 6 de Abril de 2015
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2350 ­ Vol. 66 / Edição 1 / Período: Janeiro ­ Fevereiro de 2000
Seção: Artigos Originais Páginas: 24 a 29
REGENERAÇÃO DE CÉLULAS CILIADAS APÓS
OTOTOXICIDADE COM AMINOGICOSÍDEO N A
CÓCLEA DE AVES.
Autor(es):
José Antonio A. de
Oliveira*; 
Ricardo C. Demarco*; 
Maria Rossato***.
Palavras­chave: células ciliadas; regeneração; ototoxicidade; gentamicina; pinto
Keywords: hair cell; regeneration; ototoxicity; gentamicin; chick
Resumo:  Introdução:  As  células  ciliadas  podem  ser  lesadas  por  inúmeros  agentes,  incluindo  os
antibióticos aminoglicosídeos. Na  cóclea das aves, a perda das  células  ciliadas pode ser  reposta por
regeneração. Objetivos: Os objetivos da pesquisa foram estudar o processo de regeneração em aves
e a progressão  temporal das  lesões provocadas pela gentamicina. Material e método: No estudo,  foi
administrada gentamicina em dose única subcutânea de 125 e 250 mg/kg respectivamente, em um e
outro  grupos  de  pintos  de  três  dias.  As  cócleas  foram  processadas,  para  análise  em  microscopia
eletrônica de varredura, no 1°, 3°, 5° e 20° dias após a injeção. A seqüência celular de degeneração
e regeneração foi estudada. No 20° dia, a maior parte da área coclear  lesada havia sido reposta por
células  ciliadas  e  de  suporte  regeneradas.  Estereocílios  e microvilos  foram observados na  superfície
apical das células ciliadas­regeneradas
Abstract: Introduction: Hair cells may be damaged by a number of agents including aminoglycosides.
In  the  avian  cochlea,  lost  of  hair  cells  can  be  replaced  by  regeneration.  Aim:  The  objectives  of  the
research were to study the process of regeneration that occurs in the avian cochlea and the temporal
sequence of damage by gentanicin. Material and methods: In this study, two groups of three­day old
chicks  were  given  gentamicin  at  a  single  dose  of  125  and  250  mg/kg  each.  Their  cochlea  were
processed  for,  scanning  electron  microscopy  at  1,  3,  5  and  20  days  following  the  injection.  The
sequence  of  degeneration  and  regeneration were  studied.  By  the  20  days  post­treatment,  however,
most  of  the  damaged  region  had  been  replaced  with  regenerating  hair  cells  and  supporting  cells.
Stereocilium  and  microvilli  were  observed  on  the  apical  surfaces  of  the  regenerating  sensorial
epitelium.
INTRODUÇÃO
Tem  sido  bem  estabelecido  que  os  antibióticos  aminoglicosídeos  associam­se  a  severos  efeitos
colaterais  ototóxicos.  A  utilização  destas  drogas,  independentemente  da  posologia  Ou  duração  do
tratamento,  pode  levar  à  lesão  permanente  das  células  ciliadas  da  cóclea,  resultando  em  perda
auditiva  neurossensorial  irreversível.  O  efeito  tóxico  ocorre,  inicialmente,  sobre  a  espira  basal  ela
cóclea,  com  extensão  apical  em  caso  da  administração  contínua  da  droga.  Acreditava­se,  há  algum
tempo,  que  as  células  ciliadas  das  aves,  ao  contrário  de  peixes  e  anfíbios2,  21,  17,  não  se
regenerariam  uma  vez  lesadas.  Entretanto,  estudos  recentes  têm  evidenciado  que  os  vertebrados,
excetuando­se os mamíferos, demonstram a capacidade de proliferação das células ciliadas durante o
seu  desenvolvimento  e  na  vida  adulta,  bem  como  de  regeneração  das  mesmas  após  lesão.  A
recuperação dessas células sensoriais tem sido bem demonstrada em aves, tanto após  lesão  induzida
por ruído quanto em intoxicação por aminoglicosídeos6.
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O  propósito  deste  estudo  foi  examinar  morfologicamente  o  processo  temporal  ele  degeneração  e
regeneração  após  administração  sistêmica  ele  gentamicina,  num  modelo  animal  utilizando  pintos
neonatos.
A seqüência histológica foi avaliada através da microscopia eletrônica de varredura(MEV). Utilizamos a
cóclea  de  frangos  devido  à  abundância  de  estudos  histológicos  disponíveis  desta  espécie,  bem  como
por  já  estarem  estabelecidos  os  processos  da  preparação  histológica  para  microscopia  eletrônica18,
19, 4.
MATERIAL E MÉTODO
Foram utilizados  pintos  neonatos  da  raça White  Leghorn  conservados  em biotério.  Trinta  deles  foram
divididos em três grupos: um controle (A) com seis pintos e dois outros grupos (B e C) com 12 pintos
cada.  Os  pintos  do  Grupo  B  receberam,  cada  um,  dose  única  subcutânea  de  gentamicina  de  125
mg/kg;  e  os  pintos  do Grupo  C,  de  250 mg/kg.  A  dose  e  a  disposição  temporal  para  o  sacrifício  foi
escolhida com base em estudos prévios em aves de Coltrera e colaboradores1.
Em cada um dos grupos B e C, três pintos foram sendo sacrificados após 1, 3, 5 e 20 dias da  injeção
da medicação, e as cócleas foram processadas para MEV.
Após a decapitação,  cada osso  temporal  era  isolado e dissecado com estilete delicado, expondo­se a
cóclea. O dueto coclear  foi  retirado,  lavado e  fixado através da perfusão de glutaraldeído a 2,5% em
tampão  fosfato  0,1 M  (Sorensen)  durante  12  horas.  Foi,  após,  refixado  em  solução  ele  tetróxido  ele
ósmio  a  1%  em  tampão  fosfato  0,1  M.  A  membrana  tectorial  foi  dissecada;  e  o  tecido,  fixado,  foi
desidratado  através  ele  banhos  progressivos  com  etanol  em  ordem  crescente  (50%,  70%,  90%  e
95%), durante 10 minutos em cada  imersão. A seguir, utilizou­se etanol a 1000/0 em três banhos ele
20  minutos  cada,  deixando­se,  após,  por  12  horas  à  temperatura  ambiente,  num  último  banho.
Realizou­se, então, a  secagem das amostras,  submersas em CO2  líquido, na câmara ele  secagem do
aparelho  de  ponto  crítico  (BAL­TEC­CPD 030  ­  Critical  Point Dryer).  As  cócleas  foram,  então,  coladas
em  um  porta­espécimen  cilíndrico  com  pasta  condutiva  ele  carbono  e,  a  seguir,  submetidas  à
metalização  em  ouro.  Foram,  enfim,  examinadas  e  fotografadas  no  microscópio  eletrônico  de
Varredura  JEOL  (modelo  JSM  ­  5200),  em  aumentos  ele  1.500  a  7.500  x,  a  uma  voltagem  ele
aceleração de 25 kV.
Os pintos do grupo controle (A) tiveram suas cócleas processadas similarmente nos mesmos dias que o
foram os dos grupos B e C.
RESULTADOS
Os  resultados  são  apresenta  cios,  inicialmente  os  do  grupo  controle  e,  a  seguir,  os  elos  grupos
experimentais  submetidos  ao  ototóxico.  A  célula  foi  considerada  lesada  quando  houve  qualquer
alteração  da  superfície  celular  ou  ela  estruturação  dos  feixes  ele  estereocílios.  Células  ciliadas
regeneradas  foram  identificadas  pelo  tamanho  pequeno,  formato  arredondado,  estereocílios  ele
aspecto  embrionário  (pequena  altura  e  desorganizados)  e  presença  residual  ele  microvilos  no  pólo
apical da célula.
Grupo controle
O dueto coclear das aves tem um aspecto sacular alongado, apresentando, no seu  interior, em forma
filamentar, a papila basilar. Esta contém o epitélio sensorial que se estende desde a sua porção basal
(próximo  às  janelas  oval  e  redonda)  até  a  apical.  A  Figura  1  mostra  a  visão  superior  do  epitélio
sensorial da cóclea controle, com disposição celular em mosaico. As células ciliadas apresentam seus
pólos  apicais  de  forma  poligonal  (pentagonal  ou  hexagonal)  e  são  caracterizadas  pela  presença  de
estereocílios  na  superfície.  São  separadas umas das  outras  por  células  suporte,  cuja  porção  apical  é
representada porestreitasmargens contendo inúmeros microvilos (Figura 2).
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Primeiro dia pós­administraçãodegentamicina
A  porção  basal  do  epitélio  sensorial  apresenta  áreas  de  células  ciliadas  com  irregularidades  na
membrana  cio  pólo  apical  e  início  ele  desarranjo  ciliar  (Figura  3),  com  o  restante  do  epitélio
apresentado­se serra alterações.
Terceiro dia pós­gentamicina
Houve uma extensa  lesão morfológica nas células ciliadas  localizadas na porção basal da cóclea, com
ampla  área  ele  morte  celular  (Figura  4).  Comparada  à  intensa  lesão  nesta  porção  basal,  uma  zona
intermediária,  no  terço  médio  ela  cóclea,  evidenciou  variados  graus  de  lesão:  células  ciliadas  com
edema  de  diversas  intensidades,  mostrando  desde  protrusão  da  superfície  (Figura  5)  até  extrusão
celular,  apresentada  como  uma  "herniação"  do  conteúdo  intracelular  pelo  pólo  apical  (Figura  6).  O
epitélio da porção distal da cóclea manteve­se intacto morfologicamente.
Figura 1. Epitélio da papila basilar: controle normal com células ciliadas intactas, contendo feixes de
estereocílios maduros (seta) na superfície apical.
Figura 2. Microvilos (seta) das células suporte contornando as células ciliadas.
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Figura 3. Células ciliadas apresentando abaulamento apical discreto e desorientação dos feixes de
estereocílios (primeiro dia pós­gentamicina ­ porção basal da papila basilar).
Figura 4. Área extensa de morte elas células ciliadas e de suporte (terceiro dia pós­gentamicina ­
porção basal da papila basilar).
Quinto dia pós­gentamicina
Neste  quinto  dia,  na  porção  proximal  da  cóclea  com  lesão  intensa,  em  meio  às  células  mortas,
começam  a  aparecer  numerosas  novas  células  ciliadas  em  processo  de  regeneração,  pequenas,  de
margens  arredondadas,  com  feixes  irregulares  baixos  e  agrupados  de  estereocílios  "em brotamento"
(Figura 7). A região distal da cóclea ainda não mostra sinal ele dano ã superfície celular ou aos feixes
de  estereocílios,  As  células  ciliadas  em  processo  regenerativo  apresentam  microvilos  em  sua
superfície.
Vigésimo dia pós gentamicina
A porção basal da papila basilar apresenta o epitélio sensorial com um significativo aumento do número
de células ciliadas regeneradas, com estereocílios mais maduros, e restauração do contorno poligonal
celular.
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Figura 5. Diversos graus de protrusão da superfície celular das células ciliadas (terceiro dia pós­
gentamicina ­ porção intermediária da papila basilar).
Figura 6. Estágio avançado de lesão celular com extrusão apical (terceiro dia pós­gentamicina ­ porção
basal da papila basilar).
Figura 7. Células ciliadas era processo regenerativo. Microvilos são identificados por seta na superfície
das novas células (quinto dia pós­gentamicina).
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Figura 8. Processo adiantado de regeneração celular com setas indicando desorientação dos feixes de
estercocilios (20° dia pós­gentamicina).
A  orientação  cios  estereoeílios  não  é  do  mesmo  uniformismo  que  as  células  do  epitélio  sensorial
normal, apresentando ora feixes fundidos ora com cílios espraiados (Figura 8). A largura do pólo apical
das células de suporte é ainda maior que o normal.
DISCUSSÃO
A  cóclea  de  aves  tem mostrado uma  capacidade  singular  de  regeneração  anatômica,  tanto  por  lesão
acústica9, 5, 11 quanto pelo uso de aminoglicosídeos12. Essa  recuperação ocorre, em última análise,
pela produção de novas células sensoriais ciliadas3, 15. A recuperação não é meramente morfológica.
Tucci e Rubel20 demonstraram que também ocorre recuperação funcional após regeneração anatômica
das cócleas submetidas à lesão induzida por ototóxico, em trabalho com audiometria de tronco cerebral
(ABR).  Entretanto,  segundo  Duckert  e  Rubél7,  a  recuperação  neural  ocorre  somente  após  a
recuperação das células ciliadas. Assim, a recuperação funcional ocorre na fase tardia da regeneração,
quando:  as  células  ciliadas  estão  maduras;  os  feixes  de  estereocílios,  organizado;  e  a  reinervação,
completa.
Na  alteração  morfológica  inicial  devida  a  lesão  celular,  verificamos  o  surgimento  de  múltiplos
abaulamentos na superfície na membrana celular, seguido da protrusão cada vez mais intensa do pólo
apical  da  célula,  até  uma  provável  ruptura  celular.  O  modelo  do  mecanismo  de  lesão  celular  por
ototoxicidade  foi  proposto  por  Schacht16.  Inicialmente,  o  aminoglicosídeos  se  ligaria  à  membrana
plasmática  da  célula.  Esta  ligação  desloca  o  cálcio  e  é  reversível.  A  droga  é,  então,  ativamente  ­
transportada  para  o  citoplasma,  onde  forma  um  complexo  droga­lipídico  ao  unir­se  com  o  fosfatidil­
inositol.  Este  complexo  induz  a  síntese  de  prostaglandinas,  polimerização  da  actina  e  ativa  outros
sistemas celulares, levando à lesão da membrana celular, desta vez com dano celular irreversível.
Não  se  evidenciou  alteração  da  cronologia  da  progressão  da  lesão  e  recuperação  em  relação  aos
grupos B e C, submetidos à injeção de 125 e 250 mg/kg, respectivamente. Entretanto, houve diferença
na  extensão  da  área  de  lesão.  O  grupo  C  apresentou  uma  superfície  maior  de  lesão  do  epitélio
sensorial, ocorrido, predominantemente, a nível da região basal da membrana basilar.
A seqüência de progressão da lesão, de basal para apical, das células ciliadas ao longo da cóclea tem
sido demonstrada  também em outros  trabalhos,  tanto em aves3 quanto em mamíferos13. Entretanto,
esse  padrão  de  lesão  não  é  bem  determinado.  Hipóteses  possíveis  incluem:  a  dinâmica  do  fluxo
sangüíneo  coclear;  o  acúmulo  seletivo  do  aminoglicosídeo  nos  tecidos  cocleares  ou  perilinfa;  maior
sensibilidade ou absorção dos ototóxicos pelas células basais da cóclea10.
Outro  achado  deste  estudo  foi  a  presença  de  células  ciliadas  regeneradas  já  no  quinto  dia  após  a
aplicação  da  gentamicina.  Evidencia­se  a  presença  de  pequenas  células  com  tufos  ciliares  apicais
irregulares,  ocupando  o  espaço  deixado  pelas  células  mortas.  Isso  indica  que  a  regeneração  e
diferenciação podem ocorrer mesmo na presença de níveis ototóxicos do aminoglicosídeo. Assim, estas
células  imaturas  devem  ser  resistentes,  ao  menos  inicialmente,  à  influência  da  droga,  como  sugere
Girod10. Isso seria possível caso as células em processo de regeneração não fossem capazes de ligar­
se ao aminoglicosídeo, e estando, desta forma, protegidas dos seus efeitos. Esta proteção encerra­se,
talvez, assim que o processo de maturação esteja completo.
Há  várias  teorias  sobre  os  processos  regenerativos.  Um  dos  mecanismos  teóricos  do  processo  de
regeneração  seria  através  da  migração  de  células  ciliadas  remanescentes  para  as  áreas  lesadas.
Entretanto,  a  maioria  dos  autores  acredita  que  o  processo  de  regeneração  ocorre  porque  existem
células quiescentes, as células suporte, que retêm capacidade latente de multiplicação e que através de
proliferação  e  diferenciação  por  mitose  originariam  células  ciliadas  auditivas.  Esta  proliferação  por
mitose pôde ser evidenciada com a timidina tritiada, tendo se utilizado a auto­radiografia na localização
da  síntese  de  DNA14.  Os  mecanismos  de  regeneração  poderiam  ser  desencadeados­pelo  processo
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lesivo,  provocando  liberação de  fatores proliferativos  (como neurotrofinas),  que atuariam nas  células
suporte8.
Os  resultados  encorajadores  das  pesquisas  de  regeneraçãoem  aves  elevem  estimular  estudos  em
mamíferos,  para  uma  possível  aplicação  na  cura  da  surdez  neurossensorial  irreversível  no  homem.
Quando  há  lesão  no  órgão  de  Corti  de  mamíferos  os  espaços  deixados  pelas  células  lesadas  são
preenchidos por escaras produzidas pelas células de suporte que dificultaria a  regeneração. O estudo
dos  mecanismos  moleculares  da  ototoxicidade  poderia  ser,  eventualmente,  utilizado  na  proteção
coclear contra agentes ototóxicos.
CONCLUSÕES
1  ­  A  lesão  do  epitélio  ciliado  da  papila  basilar  em  pintos  neonatos  é  seguida  de  regeneração  com
formação de novas células ciliadas.
2  ­  Pôde  se  observar  a  seqüência  temporal  das  lesões  provocadas  pelo  antibiótico  ototóxico,  a
gentamicina, nas células ciliadas ele aves ao longo da membrana basilar.
3  ­  A  progressão  das  lesões  nos  dois  grupos  submetidos  ao  ototóxico  foi  igual,  havendo,  entretanto,
dano mais extenso ao epitélio sensorial do grupo submetido a dose maior (250 mg/ kg).
4 ­ Trabalhos com modelos animais para estudo da regeneração são importantes para o conhecimento
elo processo regenerativo e as novas descobertas advindas destas pesquisas poderão ser aplicadas em
mamíferos, a fim de induzir a regeneração da célula ciliada no homem.
AGRADECIMENTO
Os  autores  agradecem  a  assistência  do  Departamento  de  Morfologia  da  F~­USP,  em  especial  aos
técnicos de laboratório Maria Dolores S. Ferreira e José Augusto Maulin, pela preparação cuidadosa do
material  e  realização  da  microscopia  eletrônica;  e  à  Rita  Amâncio  Diegues,  Maria  Cecilia­Onofre  e
Amélia  Baruffi,  do  Departamento  de  Oftalmologia  e  Otorrinolaringologia  da  FMRP­USP,  que
providenciaram todo o suporte de secretaria.
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*Professor  Titular  da  Disciplina  de  Otorrinolaringologia  e  Chefe  do  Departamento  de  Oftalmologia  e
Otorrinolaringologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto ­USP.
** Médico Assistente e Pós­Graduando da Disciplina de Otorrinolaringologia do HCFMRP­USP.
*** Técnica de Apoio à Pesquisa da Disciplina de Otorrinolaringologia do HCFMRP­USP.
Trabalho  apresentado  no  34°  Congresso  Brasileiro  de  Otorrinolaringologia  Fonte  de  Financiamento:
CAPES ­FAPESP
Endereço  para  correspondência:  Hospital  das  Clinicas  da  Faculdade  de  Medicina  de  Ribeirão  Preto  ­
USP. José Antonio A. Oliveira ­ Telefone/Fax: (0xx16) 633­0186. 
Artigo recebido em 7 de abril de 1999. Artigo aceito em 1° de julho de 1999.
Indexações: MEDLINE, Exerpta Medica, Lilacs (Index Medicus Latinoamericano), SciELO
(Scientific Electronic Library Online)
Classificação CAPES: Qualis Nacional A, Qualis Internacional C
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