Cinética Enzimática

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Introdução
Enzimas são catalisadores biológicos, formados por longas cadeias de moléculas pequenas, chamadas de aminoácidos. São, portanto, um tipo de proteína com atividade catalítica, sendo encontradas na natureza em todos os seres vivos. Sua função é viabilizar a atividade das células, quebrando moléculas ou juntando-as para formar novos compostos. [1]Como catalisadores celulares extremamente poderosos, as enzimas aceleram a velocidade de uma reação, diminuindo sua energia de ativação sem, no entanto participar dela como reagente ou produto. [2] Energia de ativação (Ea) é a energia mínima necessária para que uma molécula de reagente ou de substrato S alcance o estado de transição (S••P≠) e daí se tornarem uma molécula de produto P. A figura 1 mostra as energias de ativação em reação catalisada por enzima e outra que não é catalisada por enzima. As enzimas são consideradas as unidades funcionais do metabolismo celular. [1]
Figura 1- Ea de (a) uma reação não enzimática e (b) uma reação enzimática. [1]
A singularidade dos compostos enzimáticos decorre do elevado grau de especificidade ao substrato em condições moderadas, sob as quais atuam. Algumas enzimas são específicas para determinado tipo de ligação química, como, por exemplo, a capacidade da α-amilase de romper unicamente as ligações α-1,4 das moléculas de amido. Outras são específicas para um tipo particular de isômero óptico, como, por exemplo, a oxidação da β-D-glicose pela glicose oxidase. Toda enzima é uma proteína, mas nem toda proteína se constitui em uma enzima [1].
Cinética enzimática é o estudo do mecanismo de reações catalisadas por enzimas e a determinação da velocidade da reação e como ela se altera em resposta a modificações de parâmetros experimentais. [3]
Um fator-chave que afeta a velocidade de uma reação catalisada por enzima é a concentração do substrato, [S]. Entretanto, estudar os efeitos da concentração do substrato é complicado pelo fato que [S] se altera durante o curso de uma reação in vitro à medida que o substrato é convertido em produto. Uma abordagem simplificadora nos experimentos é medir a velocidade inicial, Vo, quando [S] é muito maior que a concentração de enzima, [E]. Em uma reação típica, a enzima pode estar presente em quantidades nanomolares enquanto [S] pode ser de cinco a seis ordens de magnitude maior. Se apenas o início da reação é monitorado (freqüentemente os primeiros 60 segundos ou menos), alterações na [S] podem estar limitadas a alguns poucos por cento, e [S] pode ser considerada como constante. Vo pode então ser explorada como uma função da [S], que é ajustada pelo investigador. O efeito sobre Vo ao variar [S] quando a concentração da enzima é mantida constante é mostrada na figura 2. Em concentrações relativamente baixas do substrato, Vo aumenta quase linearmente com o aumento na [S]. em concentrações de substrato mais altas, Vo aumenta de quantidade cada vez menores em resposta ao aumento na [S]. Finalmente, um ponto é alcançado, além do qual aumentos em Vo tendem a ser pequenos à medida que a [S] aumenta. Essa região de Vo parecida com um platô está próxima da velocidade máxima, Vmáx. [3]
Figura 2: Efeito da concentração do substrato na velocidade inicial de uma reação catalisada por enzima [3].
O complexo ES, o qual corresponde à ligação da enzima com o substrato, é a chave para entender esse comportamento cinético, da mesma forma que ele foi um ponto inicial da catálise. O padrão cinético na figura 2 levou Victor Henri, seguindo a liderança de Wurtz, a propor em 1903 que a combinação de uma enzima com a sua molécula de substrato formando um complexo ES é uma etapa necessária na catálise enzimática. Essa idéia então foi expandida em uma teoria geral da ação enzimática, particularmente por Leonor Michaelis e Maud Menten em 1913. Eles postularam que a enzima primeira combina reversivelmente com seu substrato para formar um complexo enzima-substrato em uma etapa reversível relativamente rápida, dada pela equação 1 [3]: 
O complexo ES depois se quebra em uma segunda etapa mais lenta para produzir a enzima livre e o produto da reação P (equação 2) [3].
Pelo fato de a segunda reação mais lenta limitar a velocidade da reação global, a velocidade global deve ser proporcional a concentração das espécies que reagem na segunda etapa, ou seja, ES [3].
Em qualquer instante em uma reação catalisada por enzima, esta existe em duas formas: a livre ou não combinada E e a combinada ES. Em baixa [S], a maior parte da enzima está na forma não combinada E. Nesse momento, a velocidade é proporcional a [S] porque o equilíbrio da equação 1 está empurrando para a formação de mais ES à medida que [S] aumenta. A velocidade máxima inicial da reação catalisada (Vmáx) é observada quando virtualmente toda a enzima estiver presente como complexo ES e [E] for pequena. Nessas condições a enzima está “saturada” com seu substrato, de forma que aumentos adicionais na [S] não tenham efeito na velocidade. Essa condição existe quando [S] for suficientemente alta que essencialmente toda a enzima livre tenha se convertido na forma ES. Depois que o complexo ES se quebra para produzir o produto P, a enzima está livre para catalisar a reação de outra molécula de substrato. O efeito de saturação é uma característica distinguidora da catálise enzimática e responsável pelo platô verificado na figura 1. O padrão visto na figura 1 é algumas referido como cinética de saturação [3].
Quando a enzima é misturada, primeiro com um grande excesso de substrato, há um período inicial, o estado pré-estacionário, durante o qual a concentração de ES se estabelece. Esse período é usualmente tão curto para ser facilmente observado, durante alguns microssegundos. A reação rapidamente alcança um estado estacionário no qual [ES] (e as concentrações de quaisquer outros intermediários) permanece aproximadamente constante com o tempo. O conceito de um estado estacionário foi introduzido por G. E. Haldane em 1925. A medida de V0 geralmente reflete o estado de equilíbrio estacionário, mesmo que V0 seja limitada a parte inicial da reação, e a análise dessas velocidades iniciais é referida como cinética do estado estacionário [3].
A levedura Saccharomyces cerevisae é uma das principais produtoras da enzima invertase (-D-futofuranosídeo frutohidrolase). Esta enzima é um produto valioso devido a seu uso em provas analíticas, em confeitarias e na hidrólise de sacarose para a produção de xarope invertido. A invertase, também, tem sido empregada para melhorar a utilização de certos substratos tais como sacarose e melaço de cana-de-açúcar por microorganismos, nos processos de fermentação alcoólica e produção de alguns metabólitos. A sacarose é o substrato necessário para a produção de invert,,,,,,ase, sendo o melaço, um subproduto da manufatura de açúcar, rico em sacarose utilizado para a produção de invertase por S. cerevisiae. [4]
Objetivo
 Calcular as unidades de atividade enzimática e os valores de 1/V e 1/S, traçar os gráficos, e determinar Vmáx e Km.
Metodologia
2.1 Materiais
Os materiais utilizados nesse experimento foram:
11 Tubos de ensaio pequenos e grandes; 
1 Béquer; 
Pipetas graduadas: duas de 1 mL (ou 2mL) e uma de 5mL (ou 10 mL);
Banho - Maria;
Espectrofotômetro;
Extrato enzimático de Saccharomyces cerevisiae (sobrenadante resultante do congelamento e descongelamento da biomassa), diluído 1: 30. 
Soluções de sacarose em tampão acetato 0,05 M pH 5,0 nas concentrações: 10g/L, 9g/L, 8g/L, 7g/L, 6g/L, 5g/L, 4g/L, 3g/L, 2g/L e 1g/L. Soluções Somogyi-Nelson I (SNI) e II (SNII);
Para o preparo das soluções de I (SNI) e II (SNII), tem-se:
SNI: Pesou-se 28g de Na2HPO4 anidro e 40g de tartarato duplo de sódio e potássio. Dissolveu-se em 700 mL de água destilada. Adicionou-se 100 mL de NaOH 1M, 80 mL de solução CuSO4.5H2O 10% e 180g de Na2SO4. Completou-se o volume para 1L. Deixou-o em repouso por 1 a 2 dias em lugar escuro e filtrou-o com papel Whatman n°1. Guardou-o em frasco escuro.
SNII: Solução A:Dissolveu-se 50g de molibdato de amônio em 900 mL de água destilada. Adicionou-se 42 mL de ácido sulfúrico concentrado. Solução B: Dissolveu-se 6g de Na2HAsO4 em 50 mL de água destilada. Misturou-se as soluções A e B e manteve a 37°C por 24h em lugar escuro. Transferiu-se a solução para frasco escuro.
2.2 Métodos
Nesse experimento enumerou-se 11 tubos de ensaios com os rótulos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e B. Pipetou-se em cada um dos tubos, exceto no tubo B, 4 mL de solução de sacarose nas diferentes concentrações: 
Tubo 1: 4 mL de sacarose 1g/L;
Tubo 2: 4 mL de sacarose 2g/L;
Tubo 3: 4 mL de sacarose 3g/L;
Tubo 4: 4 mL de sacarose 4g/L;
Tubo 5: 4 mL de sacarose 5g/L;
Tubo 6: 4 mL de sacarose 6g/L;
Tubo 7: 4 mL de sacarose 7g/L;
Tubo 8: 4 mL de sacarose 8g/L;
Tubo 9: 4 mL de sacarose 9g/L;
Tubo 10: 4 mL de sacarose 10g/L;
Em seguida incubou-os a 40°C por 5 minutos. Após a incubação adicionou-se 1,0 mL de solução enzimática, extrato bruto diluído 1: 30, em cada um dos tubos em intervalos regulares de 30 segundos. Esse processo não foi realizado para o tubo B. Depois de 10 minutos, transferiu-se 0,5 mL de cada tubo, também em intervalos regulares de 30 segundos, para o banho em ebulição.
	Para a determinação dos açúcares pelo método de Somogyi-Nelson, adicionou-se, nos tubos contendo 0,5 mL de amostra, 1 mL de reagentes SNI. Agitou-se os tubos e colocou-os em banho-maria em ebulição por 6 minutos. Passado o tempo, retirou-os do banho-maria e resfriou-os em bolsas de gelo até a temperatura ambiente. Em seguida adicionou-se 1 mL do reagente SNII, agitou-os e deixou-se em repouso por 5 minutos. Após o término, adicionou-se 10 mL de água destilada e misturou-se por inversão. 
Calibrou o espectrofotômetro com a solução “branco” tubo B e em seguida mediu-se a absorbância a 540 nm.