Aula 19 - Metabolismo do DNA

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Metabolismo do DNA
	Alguns processos importantes no estudo dos ácidos nucléicos são:
REPLICAÇÃO – síntese de DNA
TRANSCRIÇÃO – síntese de RNA a partir do DNA
TRADUÇÃO – síntese de proteínas a partir do RNA
A informação genética, dessa forma, é armazenada na molécula de DNA. Depois esse DNA é transcrito em RNA e esse RNA servirá de molde para síntese de proteínas. Essas proteínas serão, enfim, funcional no organismo. Através da utilização do RNA como molde, a seqüência de três em três nucleotídeos (códons) vai corresponder a um aminoácido na cadeia polipeptídica da proteína. 
	Tanto o DNA quanto o RNA são chamados de ácidos nucléicos. Seus esqueletos são compostos por repetições de um monossacarídeo de cinco carbonos (deoxirribose ou ribose), um fosfato e uma base nitrogenada (citosina, guanina, timina, adenina ou uracila). O composto obtido pela união do monossacarídeo e da base nitrogenada é o chamado nucleotídeo. O nucleotídeo é a unidade básica da estrutura dos ácidos nucléicos. Esses nucleotídeos ligam-se entre si por ligações do tipo fosfodiéster. 
	As bases nitrogenadas podem ser divididas em bases púricas ou pirimídicas. As bases púricas são a adenina e a guanina. As bases pirimídicas são citosina, timina e uracila. Como já dito: bases nitrogenadas + pentose + fosfato → nucleotídeo.
	A ribose (componente do RNA) possui um OH no carbono 3’ e um OH no carbono 2’. A deoxirribose (componente do DNA) possui um OH no carbono 3’ e um H no carbono 2’. Assim, os nucleotídeos que compõem o DNA serão diferentes dos nucleotídeos que compõem o RNA. Por exemplo, dA é um nucleotídeo que possui uma deoxirribose como pentose e uma adenina como base nitrogenada, ao passo que rA é um nucleotídeo que possui uma ribose como pentose e uma adenina como base nitrogenada. 
LIGAÇÃO FOSFODIÉSTER
	Como já dito, trata-se da ligação que une os nucleotídeos para formação dos ácidos nucléicos. É a ligação do fosfato, presente no carbono 5’ da pentose, com a hidroxila, presente no carbono 3’ da pentose. 
	Sendo assim, o DNA terá duas pontas livres, que não fazem nenhuma ligação fosfodiéster. Uma das pontas é chamada de 5’, onde há o fosfato livre. A outra ponta é chamada de 3’, onde há o OH livre. Por convenção, uma seqüência de DNA que não possui nenhuma especificação em suas pontas, terá na sua extremidade esquerda (começo) a ponta 5’ e na sua extremidade direita (fim) a ponta 3’. 
	
DUPLA FITA DE DNA E OS CROMOSSOMOS
	O DNA é formado por uma dupla fita, ao passo que, geralmente, o RNA encontra-se na forma de simples fita. O pareamento da dupla fita de DNA acontece por ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas dos nucleotídeos. Como sabe-se, a base nitrogenada A vai se parear com a base nitrogenada T por duas pontes de hidrogênio. A base nitrogenada C vai se parear com a base nitrogenada G por três pontes de hidrogênio. Uma das fitas vai estar no sentido 5’ → 3’ e a outra fita vai estar no sentido 3’ → 5’. Isso acontece porque o sentido das fitas é antiparalelo. Depois da formação da dupla fita, forma-se uma estrutura de hélice, sendo por isso, o DNA uma dupla hélice. Dentro dessa estrutura de dupla hélice, podem-se formar estruturas chamadas de major groove e minor groove, que são sulcos no DNA envolvidos em processos envolvidos no metabolismo do DNA, inclusive nos processos de regulação gênica. Na maior parte do tempo o DNA assume a estrutura de dupla hélice, mas também pode assumir a forma de uma cruz ou outras estruturas. São estas estruturas mais especializadas que ocorrem somente em momentos específicos.
	Após a formação da dupla hélice, o DNA ainda se enrola mais ainda, para que possa se acomodar dentro da célula. Em células eucarióticas, o enovelamento da molécula de DNA se dá através da interação desse DNA com as proteínas histonas. Essa interação forma os chamados nucleossomos. Os nucleossomos de forma geral formam as fibras de cromatina. A cromatina diferencia-se de acordo com seu grau de compactação em eucromatina e heterocromatina. Quando a cromatina estiver bastante compactada, haverá a formação dos chamados cromossomos. 
Ressalta-se a presença de vários tipos diferentes de histonas (H1, H2, H3, H4...) durante o processo. As histonas não apresentam somente essa função estrutural. Elas podem sofrer modificações pós-traducionais como acetilação e desacetilação, que vão regular a expressão de determinados genes. 
O RNA pode formar uma estrutura terciária quando os nucleotídeos da simples fita de RNA começam a interagir entre si, como se fossem uma proteína. Dessa forma há a formação de diferentes RNAs, como o RNA transportador, RNA mensageiro e RNA ribossômico. 
PCR E DESNATURAÇÃO DO DNA
O DNA é uma molécula muito rica em informações. Assim, várias técnicas de biologia molecular foram criadas para entender o comportamento do DNA e desvendar como suas informações contidas são expressas e passadas adiante. Essas técnicas são importantes, inclusive, para cura e entendimento de diversas patologias. Uma das técnicas bastante utilizada e que auxiliou muito o entendimento da biologia molecular foi a técnica de PCR (polymerase chain reaction). Trata-se de uma reação em que se consegue multiplicar exponencialmente a quantidade de DNA in vitro. Ou seja, trata-se de uma replicação artificial. 
Para que ocorra a duplicação das fitas de DNA (replicação), há a necessidade de que a dupla fita de DNA se desenrole e se separe. A esse processo dá-se o nome de desnaturação do DNA. Tanto a temperatura quanto enzimas especializadas podem separar as duas fitas de DNA. Essa separação é importante porque não há como copiar as duas fitas de DNA se estas estiverem juntas (há necessidade de bases desemparelhadas para que a enzima DNA polimerase possa emparelhar outra base a ela, formando uma dupla fita). A separação das duas fitas é feita através da quebra das ligações de hidrogênio. Um aumento na temperatura leva à quebra das ligações de hidrogênio e uma diminuição de temperatura leva à formação destas novamente, formando a dupla fita de novo.
REPLICAÇÃO
Como já dito, a replicação é uma maneira de duplicar o DNA existente. Essa replicação tem que ser muito eficiente para que não haja mutações ou processos que tornem a célula inviável. Dessa forma, a própria replicação é, em si, um processo com alta fidelidade. Mesmo assim, há diversos mecanismos de correção que tornam a replicação um processo com fidelidade ainda maior. 
A replicação pode ser dividida em iniciação, elongação e terminação. Várias enzimas participam dessa replicação, mas a principal delas e a responsável de fato para que ocorra a REPLICAÇÃO É A DNA POLIMERASE. A DNA polimerase é a enzima que une os nucleotídeos por ligações fosfodiéster. As características desta é que controlam os processos de replicação. 
A direção na replicação é 5’ → 3’. Trata-se de um processo semidescontínuo (em uma fita a replicação é contínua e na outra fita a replicação é feita em pedaços) e semiconservativa (ao fim de um processo de replicação, a dupla fita de DNA será composta por uma fita mãe e a fita que foi gerada a partir desta fita mãe). É a DNA polimerase que define a direção de replicação e o fato de se tratar de um processo semidescontínuo. Isso acontece porque a DNA polimerase só consegue adicionar nucleotídeos fosfatos 5’ na posição 3’ da deoxirribose. Na prática, isso significa que a DNA polimerase precisará de uma molécula iniciadora ou primer. Esse iniciador vai fornecer um OH ligado ao carbono 3’ para que a DNA polimerase possa ligar o fosfato 5’. Dessa forma, a DNA polimerase vai ligar um nucleotídeo atrás do outro no sentido 5’ (onde está o primer com o primeiro OH 3’ livre) ao 3’ (onde haverá um OH livre em que a DNA polimerase não ligará outro fosfato). Na fita contínua, um primer será o suficiente para que haja completa polimerização de nucleotídeos até o fim da cadeia. Na fita descontínua, vários primers serão necessários para terminar a polimerização, visto que cadaum será o iniciador para uma pequena parte do DNA apenas. 
A DNA polimerase possui duas funções: atividade revisora (ela é capaz de voltar na fita para retirar um nucleotídeo errado, após perceber a presença desse por mudanças conformacionais) e atividade de síntese de DNA.
Outro processo que acontece na DNA polimerase é a processividade. A DNA polimerase pode, durante o processo de replicação, desligar e ligar no DNA. Quanto mais vezes ela se ligar ao DNA durante a replicação, menor sua processividade e maior a chance de erro. Dessa forma, a DNA polimerase da replicação é uma enzima com alta processividade, ou seja, ela quase não se desliga do DNA durante a replicação diminuindo a possibilidade de erros. Por exemplo, existem várias DNA polimerase em E. Coli. Essas DNA polimerase possuem diferentes funções. Essas funções são determinadas pela processividade e pela velocidade de polimerização de cada uma das enzimas. A enzima da replicação será a enzima com maior velocidade de polimerização e processividade. Enzimas com esses valores menores terão outras funções, como funções revisoras por exemplo.
A DNA polimerase possui diferentes subunidades. A subunidade α é responsável pela polimerização dos nucleotídeos. A subunidade ε está envolvida na atividade revisora. As subunidades β estão envolvidas com a processividade e pela formação do grampo que facilita a replicação. As demais subunidades estão envolvidas com a processividade e formação do grampo com as subunidades β.
A figura abaixo representa de forma esquemática uma DNA polimerase III de E. Coli:
FASES DA REPLICAÇÃO
Iniciação:
	É essencial, para o início da replicação, o reconhecimento da cadeia de DNA a ser duplicada. Esse reconhecimento se dá através de uma seqüência de nucleotídeos chamada origem de replicação. Essa origem de replicação é um ponto no DNA onde vai acontecer o início da replicação. A seqüência de nucleotídeos que inicia é replicação é específica para cada organismo. Dessa forma, se colocarmos um pedaço de DNA humano em uma bactéria, este não será reconhecido nem replicado, já que a origem de replicação humana é diferente da origem de replicação bacteriana. 
	O reconhecimento da origem de replicação é feita por uma proteína chamada DnaA. Ao reconhecer a origem de replicação, a DnaA se liga ao DNA e recruta outras duas proteínas: DnaB e DnaC. Essas três proteínas quebrarão as ligações de hidrogênio que unem as duas fitas de DNA e farão com que haja a formação de uma bolha no DNA. Esta bolha é uma área do DNA onde há simples fita, pois as ligações de hidrogênio foram quebradas, em meio ao resto do DNA formado por dupla fita. É nessa bolha que a forquilha de replicação vai se instalar. Essa forquilha de replicação é formada por várias proteínas e é responsável pela replicação do DNA. As principais proteínas dessa forquilha de replicação são: helicase e topoisomerase (DNA girase), que vão ajudar a desenovelar a dupla fita de DNA, SSB, que vai ligar-se ao DNA para mantê-lo como simples fita e RNA primase, que vai auxiliar na síntese do primer. Além disso, haverá a DNA polimerase que vai, de fato, polimerizar os nucleotídeos e duplicar o DNA. A RNA primase é um tipo de RNA polimerase. Dessa forma a molécula de primer é, na verdade, um RNA. Isso acontece porque somente a RNA polimerase é capaz de sintetizar algo sem um iniciador. Assim, ela servirá como síntetizadora de iniciadores para as DNA polimerases.
Alongamento:
	A fita contínua seguirá no processo normal, inteiriça ao passo que a fita descontínua será dividida em diversos fragmentos, os chamados Fragmentos de Okazaki. A fita descontínua é replicada em partes porque vai contra o sentido original de replicação 5’ – 3’. 
	Em seguida, outra DNA polimerase (DNA polimerase I em E. coli) entra no processo. Essa DNA polimerase I possui uma atividade que a DNA polimerase III (que faz a polimerização propriamente dita) não tem: atividade de hexonuclease-5’-3’. Ou seja, a DNA polimerase I vai se ligar ao DNA e vai degradar o primer que ainda está ligado ao fragmento inicial de DNA formado.
	Por fim, a DNA ligase vai juntar os diversos fragmentos de Okazaki através de ligações fosfodiéster, formando uma única fita de DNA. A DNA ligase de E. Coli precisa de ATP para exercer sua função. 
Terminação:
Para a terminação da replicação, entram em ação as proteínas C. As proteínas C, juntamente com sítios existentes no DNA, participam, assim, do término da replicação. Essas proteínas C fazem a forquilha de replicação estacionar e se desligar. Esse processo só vai terminar, em condições celulares normais, quando todo o DNA tiver sido replicado. Assim, à medida que a replicação começou, ela só acaba quando todo o DNA tiver sido replicado.