Diagnóstico de Microrganismos

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Profa. Denise Wanderlei - UFAL 
ICBS / Setor de Microbiologia 
Métodos de Diagnóstico em Laboratório 
de Microbiologia Clínica 
Amostras Clínicas 
• MORFOLÓGICOS 
– Baseados em Microscopia 
• Exame Direto de Amostras Não-coradas: Montagem com 
salina; Gota pendente; Iluminação de campo escuro 
• Exame Direto de Amostras Coradas: Coloração de Gram; 
Coloração de Ziehl-Neelsen; Coloração de estruturas 
especiais; Fluorescência direta 
– Métodos Culturais 
• BIOQUÍMICOS 
• IMUNOLÓGICOS (SOROLÓGICOS) 
• GENOTÍPICOS (MOLECULARES) 
 
Métodos Diagnósticos 
Iluminação de Campo Escuro 
Leptospira sp. 
Exame Direto de Amostras Coradas (Fungos) 
Escamas epidérmicas e 
ungueais 
Malassezia spp. 
• K-tinta: Potassa (KOH a 10%) + tinta Parker (K-tinta) 
• Azul de lactofenol algodão 
Coloração de Gram 
Bastonetes Gram negativos 
Cocos Gram positivos 
Procedimento 
1. Cristal violeta 
2. Iodo 
 (mordente) 
3. Álcool 
 (descoloração) 
4. Safranina 
 (contra-corante) 
Campo microscópico 
Coloração de Ziehl-Neelsen 
Bacilos de Koch - BKs (setas) 
Carbolfucsina 
Descoloração 
Safranina 
BAAR Não-BAAR 
Coloração de Estruturas Especiais 
• Coloração de Endosporos  Método de Shaeffer-Fulton 
(verde malaquita a 5% e safranina) (A) 
• Coloração de Flagelos  Carbolfucsina (B) 
• Coloração Negativa de Cápsulas: Tinta nanquim e 
safranina (C) 
 
(A) (B) (C) 
Colônias em meio 
Lowenstein-Jensen (BK) 
Métodos Culturais 
Pseudomonar aeruginosa 
Ágar Trypticase-soja 
Serratia marcescens 
Ágar MacConkey 
Shigella flexneri 
Ágar MacConkey 
Testes Bioquímicos 
Reação negativa 
Reação positiva 
Teste de Motilidade 
- + + 
Teste da oxidase 
Teste da Catalase 
Prova positiva em 
Staphylococcus aureus 
 
 2 H2O2  ½ O2 + H2O 
Pseudomonas aeruginosa (A) e Escherichia coli (B) em meio de 
cultura TSI (triplo açúcar ferro) 
 
(B) Fermentação de glicose e lactose  modificação da cor do 
meio de cultura para amarelo. Produção de gás  formação de 
bolhas no meio (seta) 
A B 
Utilização da glicose 
1 
2 
Ágar MacConkey (AMC) 
1) Fermentação da lactose positiva (E. coli) 
2) Fermentação negativa (Salmonella) 
+ - - 
Métodos Sorológicos 
Aglutinação negativa Aglutinação positiva 
Aglutinação 
Complexo 
Antígeno-Anticorpo 
ENSAIOS IMUNOFLUORESCENTES 
• Técnicas de imunofluorescência (IF) 
• Combinam isotiocianato de fluoresceína (FITC) 
com anticorpos, para que fluoresçam quando 
exposto à luz ultravioleta 
• São procedimentos rápidos, sensíveis e 
específicos e podem ser diretos (DFA) ou 
indiretos (IFA) 
DFA - um antígeno reage com o anticorpo 
contendo fluoresceína dirigido contra o antígeno 
+ 
Lavar 
Determinante 
antigênico 
Anticorpos 
conjugados 
com FITC 
DFA - Imunofluorescência Direta 
IFA - a amostra é colocada para reagir com um excesso de 
anticorpos não-marcados dirigidos contra o antígeno 
Determinante 
antigênico 
+ 
Lavar 
Anticorpos 
conjugados 
com FITC 
+ Anticorpos 
não 
marcados 
Lavar 
IFA – Imunofluorescência Indireta 
Amplificação e detecção de ácidos nucleicos 
Métodos laboratoriais convencionais 
Expressão fenotípica de antígenos ou produtos bioquímicos 
Métodos moleculares 
Rápida identificação de agentes infecciosos 
Alta sensibilidade e especificidade 
Prevenção de doenças 
Rigoroso controle de qualidade 
Testes Moleculares em Laboratórios Particulares 
Microrganismo Técnica Material Biológico 
Chlamydia trachomatis Detecção do DNA por PCR Vários materiais 
Chlamydia trachomatis Detecção do DNA por PCR Vários materiais 
Mycobacterium tuberculosis Detecção por PCR Vários materiais 
Micobactérias Identificação por PCR Cepa da bactéria 
Bordetella pertussis e B. parapertussis Detecção do DNA por PCR Vários Materiais 
Neisseria gonorrhoeae Detecção do DNA por PCR Vários Materiais 
Toxoplasma gondii Detecção por PCR Vários materiais 
Vírus do Dengue Detecção por PCR em tempo real Plasma 
Parvovírus B19 Detecção por PCR Vários Materiais 
Epstein-Barr Vírus Quantificação PCR em tempo real Sangue 
HLAB27 Genotipagem por PCR em tempo real Sangue total 
Citomegalovírus Detecção do DNA por PCR Vários materiais 
Citomegalovírus Detecção do DNA por PCR em tempo 
real 
Plasma 
HBV Detecção do DNA por PCR em tempo 
real 
Plasma 
HBV PCR quantitativo em tempo real Sangue total 
HCV Detecção do DNA por PCR Sangue total 
HCV Detecção do DNA por PCR Sangue total 
HCV Detecção do RNA por PCR Sangue total 
HCV Quantitativo por PCR Sangue total 
HIV-1 Quantitativo por PCR Sangue total 
HIV-1 Quantificação por PCR ultra-sensível Sangue total 
 Marc 3 29 45 52 53 54 55 55b 56 57 57b 58 58b 87 100 102 104 105 121 125 131 135 
 50bp 
 Marc 45 55 57 58 87 100 102 105 121 125 131 135 3 29 52 53 54 55b 56 57b 58b 104 P 
 50pb 
Produtos de digestão com a enzima Sst II do gene gyrA, (P) produto 
de PCR (Pseudomonas aeruginosa) 
5’… CCGCGG… 3’ 
3’...GGCGCC… 5’ 
SstII Streptomyces stanford 
Sítio de clivagem Enzima Organismo 
Tipo selvagem 
Sensível 
Tipo mutante 
Resistente 
RFLPs/PCR 
Produtos amplificados da região do gene gyrA por PCR 
PCR Aninhada ou Nested-PCR 
PCR Multiplex 
Staphylococcus aureus: genes femB, ileS-2, e mecA, de uma 
cepa altamente resistente a meticilina e mupirocina. Linhas 1 a 
3, PCR (amplicons) de femB, ileS-2, e mecA, respectivamente; 
linha 4, PCR triplex (amplicons), i.e., femB, ileS-2, e mecA 
simultaneamente amplificados. 
Mais que uma sequência alvo é amplificada utilizando mais de um par de primers 
 M 3 45 55 57 58 87 100 101 102 1 04 105 118 120 121 125 127 131 133 135 144 M 
 1Kb 1Kb 
Perfil eletroforético de P. aeruginosa gerado 
pela amplificação PCR-RAPD do DNA total 
com OPC 11 (TGGACCGGTG). 
 
 
Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) 
Sequenciamento 
de DNA