Curso apoptose

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Curso: Célula: da proliferação à morte.
Resumo:
O funcionamento de uma célula e os mecanismos que levam trilhões de células a trabalhar em cooperação mantendo o bom funcionamento de um organismo é um dos fenômenos mais intrigantes na Biologia. As células nascem, crescem, diferenciam-se, envelhecem e morrem. Por trás de todas essas etapas existe uma intricada rede de reações bioquímicas. A comunicação entre células estabelece uma sociedade onde todos os indivíduos trabalham em cooperação para manter em bom funcionamento todo o organismo. Essa cooperação começa no início do desenvolvimento embrionário, onde mecanismos precisos e complexos induzem à diferenciação celular, controlada por processos perfeitos de controle da expressão gênica. Como resultado, centenas de células especializadas formam-se em perfeita sincronia com o desenvolvimento normal do organismo dando origem aos diferentes tecidos. Paralelo a isso, essas células possuem um sistema que as regula na “tomada da decisão” de entrar ou não, ou mesmo sair, do processo de divisão. Apesar desse sistema atuar desde as primeiras divisões no desenvolvimento embrionário, sua principal atuação se dá após os processos de diferenciação celular e formação do organismo adulto. Esse sistema funciona através da interação de centenas de mecanismos que inibem ou estimulam a divisão ou morte celular. A regulação da divisão celular é feita por duas classes principais de proteínas: as ciclinas e as quinases dependentes de ciclina. Já o processo de morte celular é uma cascata de eventos proteolíticos de responsabilidade das caspases. Problemas nesses sistemas de controle levam ao aparecimento de diversas doenças. A mais assustadora delas certamente é o Câncer, onde há uma perda desse controle normal do ciclo celular. Outras doenças, entre elas as degenerativas, caracterizam-se também por algum problema no funcionamento correto das células. Neste campo, enorme perspectiva para terapias tem recaído sobre as células tronco. 
A célula
	A pesquisa biológica vive uma fase explosiva de conhecimentos, guiada pelas constantes descobertas acerca da unidade básica de todas as formas de vida existentes no planeta. Dentro dessa perspectiva estudar uma célula é uma viagem através de um mundo maravilhoso. Examinando a biologia celular, não sabemos se o fantástico reside no número infinito de sistemas vivos ou se nas similaridades dos mecanismos fundamentais com os quais todas as células trabalham. 
	Todos os seres vivos são formados de células (Figura 1). 
Figura 1 – Esquema de uma célula eucariótica.
As formas mais simples de vida são formadas por uma única célula, mas organismos superiores, como os humanos, são como “cidades celulares”, nas quais grupos de células performam tarefas especializadas e são ligadas por um intrincado sistema de comunicações. As células ocupam um ponto intermediário na escala da complexidade biológica. Por um lado, nós a estudamos para sabermos como funcionam as moléculas com as quais elas são feitas e, por outro, como a cooperação intercelular origina organismos tão complexos como o ser humano. 
	Este e o objetivo de nosso curso: Viajar através desse mundo fantástico, microscópico, tentando entender como uma estrutura tão fascinante como uma célula desempenha as suas funções de forma tão perfeita e principalmente, como trilhões de células cooperam umas com as outras para o bom funcionamento de um organismo. 
	Começaremos nossa viagem através do desenvolvimento embrionário, mostrando como uma única célula inicial (zigoto) por sucessivas divisões e mecanismos de controle da expressão gênica origina organismos tão complexos.
O desenvolvimento embrionário e a diferenciação celular
 
	Um animal ou uma planta multicelular é um clone ordenado de células, todas contendo o mesmo genoma, mas especializadas de diferentes maneiras. Embora a estrutura final possa ser enormemente complexa, ele é gerada por um repertório limitado de atividades celulares. Células crescem, dividem-se e morrem. Elas formam ligações mecânicas e geram forças para movimentos. Diferenciam-se ligando ou desligando genes. Produzem sinais moleculares para influenciar as células vizinhas e respondem a sinais que as células vizinhas enviam a elas. Mas todos estes fenômenos por trás do funcionamento de uma célula começam no início do desenvolvimento embrionário. 
	O genoma, repetido identicamente em cada célula, define as regras de acordo com as quais as várias atividades celulares possíveis são chamadas para funcionar. Através de sua operação em cada célula individualmente, ele dirige todo o intricado processo multicelular de desenvolvimento pelo qual um organismo adulto é gerado a partir de um ovócito fertilizado. Nossa história começa neste momento: na fertilização.
	Uma vez liberados, tanto o ovócito como o espermatozóide são destinados a morrer em minutos ou horas, a menos que encontrem um ao outro e fundam-se no processo de fertilização (Figura 2). O ovócito é ativado a começar o seu programa de desenvolvimento. Começa aqui certamente uma das coisas mas espetaculares em biologia: o modo como essa única célula irá dirigir a formação de organismos complexos.
 
	
Figura 2 – Ovócito cercado de espermatozóides no processo de fertilização.
Cerca de 1 hora após fertilização estabelece-se o cenário para a primeira clivagem, onde uma única célula (zigoto) se subidividirá em muitas células menores – os blastômeros, através de mitoses repetidas. Essas primeiras divisões celulares são extremamente rápidas, com um ciclo de tempo de 30 minutos. As altas taxas de replicação do DNA e as mitoses impedem transcrição gênica, e o embrião em processo de clivagem é quase que inteiramente dependente das reservas de DNA, proteínas, membranas e outros materiais provenientes do ovócito. Após 12 ciclos de clivagem (7 horas), a taxa de divisão celular cai abruptamente e começa transcrição do genoma do embrião. Aqui começa os processos de diferenciação celular que dará origem a todos os tipos de células de um organismo adulto. 
	O aparecimento dessas células precursoras chamadas de células tronco se dá ainda no estágio de blastocisto (embrião tem aproximadamente de 150 a 200 células) (Figura 3).
Figura 3 – Embrião humano em estágio de blastocisto evidenciando as células tronco.
Essas células através de processos de controle da expressão gênica que ligam ou desligam genes e sucessivas mitoses irão dar origem a diferentes tipos celulares, como células cardíacas, ósseas, epiteliais, nervosas, entre outras. Durante o início dos processos de diferenciação celular, há uma intensa migração celular, comumente referida como movimentos morfogenéticos. Têm-se também complexas interações teciduais por meio das quais novas células serão formadas. Isso permite que, com o decorrer do desenvolvimento, as células se diferenciem e se agrupem de modo que sejam organizados os diferentes tecidos e órgãos. Essa etapa é marcada pela expressão gênica abundante, principalmente de moléculas de adesão celular, componentes da matriz extracelular, moléculas contráteis, proteínas específicas a cada tipo celular, além de mediadores químicos relacionados à diferenciação das células.
	Complexas interações celulares existem mediadas por sinais químicos, que partem de um tipo celular e levam outras células a se diferenciarem. Essas moléculas relacionadas à formação de diferentes tipos celulares são conhecidas como morfógenos ou fatores de diferenciação. 
	Essas moléculas podem exercer a suas funções através de basicamente 3 mecanismos: 1) podem estar presentes no zigoto em regiões distintas, muitas vezes formando gradientes de concentração que, no decorrer das clivagens, são segregados a populações celulares diferentes; 2) podem ser sinais de curto alcance, principalmente fatores que agem através da interação célula-célula; 3) podem ser sinais solúveis que sedifundem de uma região sinalizadora central para populações celulares vizinhas (Figura 4).
Figura 4 – Diferentes formas de ação de um morfógeno. 
	Uma vez induzidas, as células podem responder a essas moléculas com 1) a liberação do mesmo fator de diferenciação em um sistema de retroalimentação positiva; 2) com a liberação de um segundo fator de diferenciação ou 3) pela inibição de algum fator que a célula esteja produzindo. Todos esses fatores fazem com que sejam criadas populações celulares cada vez mais específicas, à medida que o embrião se desenvolve. Essa complexidade aumenta se considerarmos que raramente há um único fator de diferenciação atuando. Alguns exemplos de fatores de diferenciação são mostrados abaixo:
	Fator de diferenciação
	Função no desenvolvimento embrionário
	TGF-(
	Interações epitélio-mesenquimais
	Vg1
	Diferenciação do mesoderma dorsal
	Wnt/Wingless/int1
	Diferenciação do áxis corporal e segmentar
	BMP
	Diferenciação mesodérmica e óssea
	Activina
	Diferenciação do mesoderma
	FGF
	Diferenciação do mesoderma ventral e dorsal
	KGF
	Diferenciação mesodérmica e muscular
	Int2
	Diferenciação mesodérmica e muscular
	NF-(B
	Diferenciação do eixo dorso-ventral
	Nogina
	Diferenciação do mesoderma dorsal
	DI
	Diferenciação do eixo dorso-ventral
 
	Uma vez que a célula se diferencie, ela deve permanecer diferenciada para que o desenvolvimento prossiga e se forme um indivíduo adulto. Quando ocorrem as divisões nas células diferenciadas ou em diferenciação, torna-se necessário que o fenótipo adquirido tenha uma certa estabilidade. Esta estabilidade é conseguida antes mesmo que a diferenciação propriamente dita se torne evidente. Uma célula que foi induzida a um determinado destino no desenvolvimento do embrião é tida como determinada. Normalmente a determinação precede a diferenciação. Como descrito anteriormente essas alterações são reguladas pelo genoma da célula. Em geral, essas características são moduladas por um conjunto de proteínas regulatórias presentes na célula. Essas proteínas controlam a expressão gênica da célula, que, por sua vez, faz com que ela se especifique. Os componentes determinantes são expressos pelo genoma em resposta a um estímulo externo, e atuam sobre a expressão celular para mantê-la seletiva àqueles genes específicos ativados pela deterimação. Esses fatores fazem com que exista um tipo de memória celular sobre o fenótipo determinado. 
	Uma vez que, no embrião, vários tipos celulares estão se diferenciando simultaneamente em resposta a vários gradientes de fatores de diferenciação, a posição em que uma célula se encontra no embrião é fundamental para que ela seja corretamente determinada e diferenciada. Como a maioria dos animais apresenta simetria bilateral com dois eixos corpóreos principais, os eixos ântero-posterior e dorso-ventral, as células estão sujeitas a vários tipos de interações. Desse modo, no decorrer do desenvolvimento, a diferenciação celular é feita de modo ordenado e integrado a diferentes tipos celulares presentes em um mesmo eixo ou em eixos corporais diferentes. A expressão de moléculas reguladoras, diferentes ao longo de cada eixo, é característica para cada região. Uma vez que essas regiões estejam estabelecidas e determinadas, as células deixam de ser totipotentes, entrando por rotas de diferenciação que as levarão a destinos específicos. 
	Deste modo, durante o desenvolvimento embrionários, a morfogênese é uma consequência direta da precisa cordenação entre a diferenciação celular e a proliferação, a migração e a comunicação de células. Uma vez que, ao redor da célula está ocorrendo o depósito de componetes de matriz extracelular, para que ocorre a formação dos tecidos ou sua remodelação, torna-se necessária uma precisa regulação entre a síntese e a degradação dessa matriz. Há trabalhos que mostram que os componentes da MEC modulam a adesão e a migração das células, a síntese de novos componentes de matriz e receptores para estes componentes. A migração e a adesão celular são de extrema importância durante o desenvolvimento pois fazem com que as células com características semelhantes se agrupem de modo a organizarem os diferentes tecidos e órgãos. Moléculas como a fibronectina parecem ter grande importância nesse processo. A fibronectina está relacionada também à diferenciação de vários tipos celulares. O sindecam, um proteoglicano, mostrou-se necessário para estabilizar o fenótipo de células epiteliais. Os proteoglicanos apresentam ainda uma propriedade de extrema importância para a fisiologia celular: eles são capazes de se ligar a fatores de crescimento. 
	O colágeno é o componente mais abundante da MEC. Esta proteína formam arranjos estruturais que auxiliam a manutenção das células em suas posições nos tecidos, conectam os diferentes tecidos dentro dos órgãos, além de facilitarem a migração celular. 
	A relação entre a MEC e a diferenciação é tão estreita que a própria degradação da matriz é capaz de induzir alterações fenotípicas. A degradação da MEC durante a morfogênese parece ser extremamente importante, considerando as modificações estruturais pelos quais o embrião passa. 
	Assim, o ambiente no qual a célula se encontra está intimamente relacionado com sua diferenciação. Mesmo estruturas sintéticas que mimetizam a matriz extracelular podem mudar o padrão de diferenciação das células. 
	Mas como uma célula recebe e interpreta um sinal externo? Os sinais externos que induzem a célula a se diferenciar necessitam ser interpretados por ela para que a diferenciação efetivamente ocorra. Isso ocorre devido a existência de fatores específicos para esses sinais externos. O topo de receptor varia de acordo com o tipo de molécula sinalizadora. Moléculas lipossolúveis, que atravessam a membrana plasmática, apresentam os seus receptores no interior da célula. Como exemplo deste tipo de receptores, temos os encontrados para os hormônios esteróides e glicocorticóides. Esse tipo de complexo estimulador é capaz de entrar no núcleo e ele próprio alterar a transcrição gênica. Por outro lado, moléculas as quais a membrana é impermeável, por exemplo, hormônios ou fatores de crescimento protéicos, apresentam receptores na superfície celular. Uma vez que a molécula sinalizadora não entra na célula, é necessária a existência de uma via de transdução de sinais, que promova a tradução das informações recebidas do meio externo. Esses sinais são levados ao núcleo por uma complexa sequência de reações em cadeia, que culminam por alterar o padrão de transcrição da célula. 
	Todos esses processos atuando em conjunto são os responsáveis pela geração de todos os tipos celulares, tecidos, orgãos de um organismo.
 Células tronco
 
Como já comentado anteriormente, as células tronco são células com a capacidade de se diferenciar em qualquer tipo celular. Entre os 75 trilhões de células existentes em um homem adulto, por exemplo, são encontradas em torno de 200 tipos celulares distintos. Todos esses tipos derivam dessas células precursoras denominadas células tronco. Essas células aparecem pela primeira vez durante o desenvolvimento embrionário no estágio de blastocisto (aproximadamente entre 100 e 200 células) formando uma massa celular de aproximadamente 36 a 40 células.
O processo de diferenciação celular que gera as células especializadas (células da pele, dos ossos e cartilagens, do sangue, etc) é regulado, em cada passo, pela expressão de genes específicos nestas células tronco. Compreender e controlar este processo é um dos grandes desafios da ciência na atualidade. As células diferenciadas são reconhecidamente diferentes umas das outras, às vezes visualmente, assim como em seus produtos protéicos. Certas células dos nossos folículos pilosos produzem queratina, uma proteína que compõe os pêlos e as unhas. Outros tipos de células no corpo não produzem queratina. Neste exemplo, a ativação do gene da queratina é uma etapachave na diferenciação das células do folículo piloso. Generalizando a partir de exemplos como este, podemos dizer que a diferenciação resulta da expressão diferencial de genes, isto é, da regulação diferencial da transcrição e dos eventos pós-transcricionais.
	As células tronco embrionárias são estudadas desde o século 19, mas só há 20 anos dois grupos independentes de pesquisadores conseguiram imortalizá-las, ou seja, cultivá-las indefinidamente em laboratório. Quando cultivadas em condições específicas, as células tronco podem ser mantidas em seu estado não diferenciado por múltiplas divisões celulares. Por outro lado, essas células podem ser induzidas a iniciar um programa de diferenciação in vitro. Sob a ação de diferentes fatores de crescimento essas células podem ser induzidas a diferenciar-se em um determinado tipo celular. Isso abriu a perspectiva do uso destas células em terapias. 
Isso significa que as pessoas poderiam fornecer as suas próprias células e ao usá-las para substituir o núcleo de seus próprios ovócitos ou de ovócitos doados, criar embriões clonados e obter células tronco em cultura. Essas células poderiam então ser induzidas a se diferenciarem em cultura, permitindo o implante de células ou tecidos em terapias, sem os problemas atuais da rejeição imunológica. Este protocolo constitui a clonagem terapêutica e a medicina baseada nele tem sido chamada de “medicina regenerativa” (Figura 5).
Figura 5 – Células tronco obtidas de embriões humanos clonados e utilizadas em processos de terapia.
	
Podemos aqui imaginar um cenário hipotético futurista (Pedersen, 1999). João tem um enorme enfarte do miocárdio, de tal maneira que apenas 30% do seu músculo cardíaco sobrevive. As chances são de que ele vá desenvolver insuficiência cardíaca e, se sobreviver, sofrerá importante comprometimento funcional. No hospital é retirado um pequeno pedaço de sua pele cujas células vão crescer em cultura. Os núcleos de algumas dessas células são retirados e injetados em ovócitos enucleados. Esse zigoto é crescido por uma semana em laboratório até chegar no estágio de blastocisto. As células desses embriões são dissociadas e células-tronco são obtidas em cultura. Essas células recebem tratamentos especiais com fatores de crescimento e diferenciam-se em células musculares cardíacas. Estas células são então implantadas no coração de João e regeneram o seu músculo cardíaco. João, mais um sucesso da medicina regenerativa, vai para casa em boa saúde. As culturas de células tronco de João são congeladas para o caso dele vir a precisar delas mais tarde para produzirem neurônios para tratamento da doença de Parkinson, ou ilhotas pacreáticas para tratamento de Diabetes.
Esse procedimento ainda apresenta dificuldades práticas como o completo conhecimento das condições para se diferenciar as células tronco em cada um dos tipos celulares do corpo humano. Entretanto para inúmeros tipos celulares estas condições já são conhecidas. Além disso, com a utilização destas células tronco voltamos a ter implicações éticas e religiosas. Com a retirada das células tronco o embrião necessariamente morre. Neste ponto cabe uma pergunta: Quando começa a vida humana? A religião católica, por exemplo, considera que a vida começa no momento da união do espermatozóide com o ovócito. Neste caso estaríamos tirando uma vida humana. Já em Israel a pesquisa com células tronco é permitida uma vez que eles consideram que a vida começa somente no momento da implantação do embrião na cavidade uterina. Em países como a Inglaterra as pesquisas em clonagem para fins terapêuticos são permitidas. Nos EUA e no Brasil a questão ainda encontra-se em análise embora nos EUA a pesquisa com células tronco já tenha sido liberada com algumas restrições. No Brasil existe a Lei de Biossegurança Nacional (Lei nº 8974/1995) que define como crime “a produção, armazenamento ou manipulação de embriões humanos destinados a servirem como material biológico disponível”.
	A alternativa para a utilização dessas células tronco embrionárias são as chamadas células tronco adultas.
	Sabe-se desde os anos 60, que alguns tecidos de um organismo adulto se regeneram constantemente. Esses tecidos tem suas células destruídas e renovadas o tempo inteiro, em um complexo regulado processo de proliferação e diferenciação celular. Os estudos feitos há décadas sobre a hematopoiese (processo de produção de células sanguíneas) a partir de células-tronco pluripotentes, localizadas no interior dos ossos, mostraram que elas originam células progressivamente mais diferenciadas e com menor capacidade proliferativa. 
É relativamente recente a constatação de que, além da pele, do intestino e da medula óssea, outros tecidos e órgão humanos – fígado, pâncreas, músculos esqueléticos, tecido adiposo, sistema nervoso, rim , retina – têm um estoque de células tronco e uma capacidade limitada de regeneração após lesões. Embora a utilização das células tronco adultas representem uma alternativa para a utilização de células tronco embrionárias, alguns problemas são observado com a utilização destas células sendo o principal problema uma menor eficiência do processo de terapia quando se utiliza essas células. Entretanto estudos já demonstraram a capacidade destas células em gerar qualquer tipo celular. Vários laboratórios no mundo vem tentando esta abordagem. O primeiro relato incontestável dessa propriedade das células tronco adultas foi feito em 1998 por cientistas italianos em que células derivadas da medula óssea regeneraram um músculo esquelético. Um resultado ainda mais surpreendente foi relatado em janeiro de 1999 por cientistas liderados por dois neurobiólogos. Em seu trabalho, publicado na revista Science, com o título “Transformando cérebro em sangue: um destino hematopoiético adotado por uma célula tronco neural in vivo”, eles conseguiram demostrar que células neurais de camundongos adultos podem restaurar as células hematopoiéticas em camundongos que tiveram a medula óssea destruída por radiação.
Essa pluripotencialidade das células tronco adultas coloca a questão do uso medicinal dessas células em bases totalmente novas. São eliminadas não só as questões ético-religiosas envolvidas no emprego das células tronco embrionárias, mas também os problemas de rejeição imunológica, já que as células tronco do próprio paciente adulto podem ser utilizadas para regenerar os seus tecidos ou órgãos lesados. 
Os exemplos de sucesso na utilização de células tronco tanto embrionárias quanto adultas são inúmeros. Mas muito destes experimentos ainda foram testados somente em camundongos e estão em fase inicial de teste, embora algumas abordagens já tenha sido testada em humanos. 
Os primórdios desta idéia vieram principalmente de estudos com a Doença de Parkinson (revisado em Dunnet and Björklund, 1999). Esta é uma doença degenerativa humana em que os neurônios de uma determinada região do Sistema Nervoso Central param de produzir um neurotransmissor muito importante chamado de dopamina e isto causa uma variedade de sinais e sintomas neurológicos como dificuldades motoras, tremores e repetições involuntárias de movimentos. Uma série de estudos clínicos mostrou que neurônios dopaminérgicos obtidos de embriões humanos transplantados no cérebro de pacientes com doença de Parkinson podem sobreviver, fazer conexões funcionais e corrigir pelo menos parcialmente, os sintomas da doença. Um exemplo de recuperação de um paciente é mostrado na Figura 6 onde podemos notar uma correção parcial de áreas cerebrais danificadas e a recuperação da expressão da dopamina nessas áreas (mostrada em vermelho). 
Figura 6 – Imagem cerebral de um paciente com Mal de Parkinson antes e após o tratamento com células tronco.
Em experimentos utilizando como modelo de estudo camundongos os exemplos de sucesso são inúmeros.
Em um desses exemplos, um grupo de pesquisadores do Instituto de Psiquiatria da Universidadede Londres trabalhou com modelos animais com a doença de Alzheimer. Nesta doença, uma série de transformações causa a morte de neurônios em uma região cerebral chamada de prosencéfalo basal, e o processo alastra-se lentamente para outras partes do cérebro. Diversos tipos de neurônios são afetados nessa doença, mas os primeiros a serem afetados são do tipo colinérgico (que liberam o neurotransmissor acetilcolina). O uso de modelos animais é uma das estratégias dos cientistas para estudar o potencial das linhagens de células tronco para recuperar déficits comportamentais decorrentes de lesões cerebrais. Em um modelo animal, o cientista emprega um animal de laboratório em pesquisas que simulam uma doença humana ou uma atividade que seja claramente comum entre ambas as espécies. 
Mas como testar os sintomas de uma doença inexistente na condição natural dos animais? Testes desse tipo não podem ser feitos em seres humanos por razões éticas, metodológicas e de saúde do paciente. A saída então é produzir em animais de laboratório lesões artificiais que levem a distúrbios semelhantes aos observados no homem. Um modo simples de fazer isso é injetar uma toxina diretamente na área cerebral do animal correspondente àquela em que é constatada a perda neuronal em humanos afetados pela doença. No modelo parcial da doença de Alzheimer, a destruição, em ratos de laboratórios (Rattus norvegicus), de neurônios colinérgicos provocou um empobrecimento das respostas relacionadas com a atenção e memória.
Duas ou três semanas após a produção dessas lesões, os animais passaram por uma Segunda intervenção cirúrgica. Um grupo chamado de transplantado, recebeu, por injeção no cérebro células tronco. Um segundo grupo, os lesionados – os Lesionados – recebeu pelo mesmo processo apenas uma solução inofensiva, sem células tronco, formada pelo líquido (chamado de veículo) usado na suspensão em que as células são mantidas vivas. Um terceiro grupo, composto por animais que passaram por uma falsa cirurgia de lesão (a agulha não continha toxina, mas apenas solução salina), também recebeu em uma segunda cirurgia, a injeção de veículo – esse grupo foi denominado de controle.
Quando a memória dos animais foi testada, o desempenho dos transplantados mostrou-se muito superior ao dos lesionados (que não receberam transplante) e similar ao dos controle (animais sem lesões). Este teste foi realizado no labirinto aquático de Morris, usado tradicionalmente para avaliar o desempenho da memória espacial. Trata-se de uma piscina com dois metros de diâmetro na qual os animais tem de achar uma plataforma logo acima da superfície da água – único lugar a “salvo” na piscina, onde podem ficar parados, sem precisar nadar. 
Um outro grupo de pesquisadores utilizaram a terapia de células tronco para o tratamento de ALS (Esclerose Lateral Amiotrófica) em ratos. Nesta doença ocorre destruição de neurônios motores na coluna vertebral progredindo então para paralisia e morte. Após o transplante de células tronco foi verificado pelo menos em parte recuperação dos movimentos nestes animais modelos (Kerr, et al. 2001).
Em outro trabalho, Lumesly et al. (2001) utilizaram células tronco para o tratamento de camundongos com diabetes. 
Recentemente foi demonstrado que, em camundongos com distrofia muscular (causadas por defeitos genéticos da proteína distrofina), a injeção de células tronco normais resulta na incorporação de células doadoras no músculo e restauração parcial da expressão do gene da distrofina.
	Os exemplos de aplicação destas tecnologias na espécie humana ainda são poucos devido as implicações éticas e aos estudos preliminares que ainda estão em fase de avaliação em modelos animais antes da passagem para aplicação na espécie humana. Como exemplos podemos citar os resultados já obtidos com pacientes com doença de Parkinson. Neste caso foram utilizadas células tronco embrionárias obtidas através de embriões que seriam descartados por clínicas de fertilização. No caso da doença de Parkinson, a rejeição imunológica das células transplantadas não é um problema, porque o cérebro é um sítio imunologicamente privilegiado, onde rejeições não ocorrem. Em qualquer outro tecido onde o mesmo procedimento para obtenção de células tronco fosse empregado a rejeição imunológica seria um problema.
	Um outro exemplo provém do tratamento de um jovem de 16 anos com insuficiência cardíaca com células tronco provenientes de seu próprio sangue. Até o momento estes testes ainda estão em fase de avaliação quanto a eficácia. 
	A utilização de células tronco embrionárias provenientes de embriões humanos clonados ainda é uma promesa. Até onde se sabe nenhum embrião humano clonado foi obtido até o momento, pelo menos até estágios avançados de desenvolvimento. Em 2001, uma empresa chamada Advanced Cell Technology obteve o primeiro embrião humano clonado que desenvolveu-se até o estágio de 16 células parando o seu desenvolvimento. Os objetivos desta empresa eram de obter células tronco que seriam utilizadas em pesquisas. 
	Ainda no campo da utilização das células tronco, quando essas células são cultivadas em suspensão elas formam espontaneamente agregados de células diferenciadas chamadas de “corpos embrióides” (Ebs, do inglês, embryoid bodies), que simulam o desenvolvimento de um embrião pré-implantado. Através de análises morfológicas, imuno-histoquímicas e moleculares, encontra-se uma grande variedade de linhagens embrionárias dentro dos Ebs (Ling e Neben, 1997). Essas propriedades das células tronco levaram ao seu uso como modelo in vitro de desenvolvimento embrionário precoce. Nelas, podem ser estudados os mecanismos de diferenciação celular, o processo de iniciação da inativação do cromossomo X, e os efeitos de substâncias tóxicas e biologicamente ativas no desenvolvimento embrionário in vitro.
	Uma outra possibilidade é utilizar essas células tronco para a criação de modelos animais transgênicos ou nocautes. O processo nesta abordagem é eliminar ou inativar genes ou ainda de introduzir genes de outras espécies em células tronco in vitro. Após estes procedimentos essas células reimplantadas em embriões gerando animais nocautes (Knockouts – não tem determinados genes ou tem genes inativados) ou animais transgênicos (que expressam genes exógenos). Essas células tronco modificadas podem originar até células germinativas nos animais nocautes ou transgênicos adultos, permitindo em muitos casos a sua reprodução. Esses animais tem ajudado a caracterizar muitas doenças humanas resultantes de alterações genéticas.
	Um grupo de pesquisadores da USP chefiada pela pesquisadora Lygia da Veiga Pereira tem utilizado esta metodologia para a criação de um modelo animal para a Síndrome de Marfam. Essa síndrome é a mais comum das doenças genéticas do tecido conjuntivo. Herdade de forma autossômica dominante esta síndrome tem uma incidência de, aproximadamente, 1 em 10.000 indivíduos. A sobrevida de pacientes com a SMF é de, aproximadamente, dois terços do normal – 40 anos na média. Na maioria dos casos a morte é causada por falha cardiovascular.
Ciclo celular e controle do ciclo celular
	Mesmo após o desenvolvimento embrionário a proliferação celular continua. Assim, nos nossos próprio tecidos adultos, novas células são continuamente produzidas. O corpo adulto pode ser comparado a um ecossistema estável, em que uma geração de indivíduos (células neste caso) substitui outra, mas a organização de um todo permanece inalterado. 	
Uma célula se reproduz por uma sequência ordenada de eventos que duplicam seus componentes e depois a dividem em duas. Este ciclo de duplicação e divisão, conhecido como ciclo celular (figura 7), é o mecanismo pelo qual todos os seres vivos se reproduzem. Além disso, os mecanismos de divisão celular são também importantes em processos de regeneração celular.
Figura 7 – Ciclo celular.
Nos seres humanos, por exemplo, as taxas de divisão são diferentes nos diversos tiposcelulares: as células hepáticas, por exemplo, dividem-se uma vez a cada ano, enquanto que algumas das células epiteliais que revestem o intestino e muitas das precursoras das células sanguíneas da medula óssea dividem-se mais do que uma vez por dia. De fato, cada um de nós deve nanufaturar muitos milhões de células a cada segundo, simplesmente para sobreviver: se toda a divisão celular for cessada – por exposição a doses muito elevadas de raios X, por exemplo – o indivíduo morre em poucos dias. 
Os detalhes do ciclo celular variam de organismo para organismo e em diferentes épocas na vida de um organismo. Entretanto, determinadas características são universais como a capacidade que a célula deve possuir de duplicar o seu DNA e deste modo ser capaz de transferir sua informação genética para a próxima geração de células. 
A duração do ciclo celular varia enormemente de um tipo de célula para outro. Uma levedura unicelular dividi-se a cada 90-120 minutos, enquanto que uma célula hepática de mamífero se divide, em média menos do que uma vez por ano. 
O ciclo celular eucariótico é tradicionalmente dividido em 4 estágios ou fases: O período em que a célula se divide é denominado mitose e compõe a fase M do ciclo celular. O período entre uma fase M e a próxima é denominado intérfase. Sob observação microscópica, esta fase parece, como um calmo interlúdio durante a qual a célula simplesmente aumenta de tamanho. Entretanto, esta a fase onde a célula mais trabalha e é dividida nas três fases remanescentes do ciclo celular. Durante a fase S (S=síntese), a célula replica o seu DNA, um pré-requisito essencial para a divisão celular. A fase S é ladeada por duas fazes onde a célula continua a crescer. A fase G1 (G=gap ou intervalo) e o intervalo entre o término da fase M e o início da fase S. A fase G2 e o intervalo entre o final da fase S e o início da fase M. 
Mas como uma célula “sabe” quando deve entrar em divisão? Na verdade existem inúmeros mecanismos que atuam em conjunto regulando o ciclo celular. Existem períodos especiais ao longo do ciclo celular (pontos de checagem) quando uma célula tem que “decidir” se procede para a próxima fase ou se faz uma pausa para se preparar. Esses processos que regulam o correto funcionamento do ciclo celular são essenciais para a manutenção da homeostase do organismo, como por exemplo, nos mecanismos de reposição celular ao longo de nossa vida e na prevenção do aparecimento de distúrbios, o mais conhecido o câncer que é caracterizado por uma perda nesse controle.
O Sistema-controle do ciclo celular opera de modo semelhante a uma máquina de lavar roupas automática. A máquina de lavar funciona em estágios sequênciais: entrada de água, mistura com o detergente, lavagem das roupas, enxágue e centrifugação para secagem. Estes processos essenciais do ciclo de lavagem são análogos aos processos essenciais do ciclo celular – replicação do DNA, mitose e assim por diante. em ambos os casos, um controlador central desencadeia cada processo em uma sequência determinada. O próprio controlador é regulado em certos pontos críticos do ciclo por retroalimentação do processo que está sendo executado. Na câmara de lavagem, sensores monitoram o nível da água, por exemplo, e enviam sinais ao controlador para evitar que o próximo processo inicie antes do término do processo precedente. Sem tal mecanismo, um interrupção ou um atraso em alguns do processos poderia ser desastroso.
Os eventos do ciclo celular também devem ocorrer em uma sequência determinada, e esta ordem deve ser mantida mesmo se um dos estágios estende-se mais do que o normal. Todo o DNA nuclear deve ser replicado antes do inicio da divisão do núcleo, o que significa que uma fase S completa deve preceder a fase M. Se a síntese do DNA é retarda ou pausada ( no caso de dano ao DNA que necessita ser reparado, por exemplo), a mitose e a divisão celular também devem ser atrasadas. Da mesma forma, e´ fundamental para a maioria das células dobrarem de tamanho antes de dividirem-se em duas; ao contrário, as células ficariam menores a cada divisão. o sistema-controle do ciclo celular consegue controlar tudo por meio de “freios moleculares” que podem parar o ciclo em vários pontos de checagem. Assim, o sistema-controle não desencadeia o próximo passo do ciclo antes do término do estágio precedente.
Na maioria das células, o sistema-controle possui pontos de checagem para tamanho celular, na qual o ciclo celular é suspenso até que a célula tenha atingido um tamanho apropriado. Na G1 , um ponto de checagem de tamanho permite a suspensão do sistema e a célula pode continuar crescendo , se necessário, antes do desencadeamento de mais um ciclo de replicação do DNA. O crescimento celular depende de um suprimento adequado de nutrientes e outros fatores no meio extracelular, e o ponto de checagem da G1 também permite que a célula avalie se o ambiente é favorável para a proliferação celular, antes de iniciar a fase S (Figura 8).
 
Figura 8 – Ponto de checagem em G1 onde uma célula “decide”
Uma segunda checagem do tamanho ocorre em G2 , permitindo a pausa do sistema antes do início da mitose. Além disso, o ponto de checagem de G2 permite que a célula verifique se a replicação do DNA foi completa antes da progressão da mitose.
Os pontos de checagem são também importantes porque são locais no ciclo celular onde o sistema-controle pode ser regulado por meio de sinais oriundos de outras células, como fatores de crescimento e outras moléculas sinalizadoras extracelulares, que podem inibir ou promover a proliferação celular. Mais adiante neste capítulo, os fatores que influenciam as decisões que ocorrem nestes pontos de checagem são considerados, mas primeiro discutiremos as proteínas que formam o sistema-controle central.
O Sistema-controle do Ciclo Celular É baseado em Protíno-quinases Ativadas Ciclicamente
	O sistema-controle governa a maquinaria do ciclo celular pela fosforilação de proteínas-chave que iniciam ou regulam a replicação, a mitose e a citocinese. A fosforilação (e desfosforilação ) é uma das formas mais comumente utilizadas pelas células para alterar a atividade de uma proteína. As reações de fosforilação que controlam o ciclo celular são executadas por um grupo específico de proteínas-quinases, enzimas que catalizam a transferência de um grupo fosfato do ATP a uma cadeia lateral de um aminoácido particular presente na proteína-alvo. Os efeitos da fosforilação podem ser prontamente revertidos pela remoção do grupo fosfato (desfosforilação), uma reação catalisada por outro grupo de enzimas, as proteína-fosfatases.
	As proteínas-quinases do sistema-controle estão presentes nas células que proliferam durante todo o ciclo celular. Porém, elas só são ativadas em determinados momentos do ciclo, após os quais são outra vez rapidamente desativadas. Assim, a atividade de cada uma dessas quinases aumenta e diminui de modo cíclico. Algumas das proteíno-quinases, por exemplo, são ativadas no final da fase G1 e são responsáveis pela progressão para a fase S; outras são ativadas um pouco antes da fase M e responsáveis pela progressão para a mitose.
	Sabendo que as proteíno-quinases do sistema-controle estão presentes durante todo o ciclo celular, como suas atividades podem ser ativadas e desativadas em momentos determinados? Em parte, devido a um segundo grupo de componentes protéicos do sistema-controle – as ciclinas. As ciclinas não possuem atividades enzimáticas por si, mas sua ligação ‘as quinases do ciclo celular é necessária para tornar as proteíno-quinases enzimaticamente ativas. Estas quinases do sistema-controle do ciclo celular são, portanto, conhecidas como proteíno-quinases dependentes de ciclina, ou Cdks. As ciclinas são assim chamadas porque, ao contrário das Cdks, sua concentração varia de maneira cíclica durante o ciclo celular. 
MPF
O complexo ciclina-Cdk que promove a entrada das células na fase M foi descoberto inicialmente em estudos da divisãocelular em ovos de rã. Os ovos fertilizados de vários animais são especialmente adequados para estudos bioquímicos do ciclo celular porque são excepcionalmente grandes e dividem-se rapidamente. Um ovo de rã Xenopus, por exemplo, possui pouco mais de 1mm de diâmetro. Após a fertilização, há início do desenvolvimento embrionário por meio de uma série de ciclos rápidos de divisão, que subdividem o ovo em várias células menores. Esses ciclos celulares rápidos consistem principalmente de repetidas fases S e M, com pouco ou nenhuma fase G1 e G2 entre eles: Não há transcrição gênica: todos os mRNAs e a maioria das proteínas necessárias para este estágio inicial de desenvolvimento estão presentes no ovo gigante durante o seu desenvolvimento de ovócito no ovário materno. Nestes ciclos de divisão celular iniciais (chamadas divisões de clivagem), não há crescimento celular, e as células do embrião dividem-se sincronicamente. Tomando-se ovos de rã em um estágio determinado do ciclo celular, pode-se obter um estrato representando aquele estágio do ciclo celular. A atividade biológica de tal extrato pode ser testada injetando-o em um ovócito de Xenopus (o precursor imaturo do ovócito não-fertilizado) o efeito no ciclo celular pode ser observado. O ovócito de Xenopus é um sistema conveniente para detectar a atividade que promove o avanço para a fase M, pois houve término da replicação do DNA e o ovócito permanece suspenso no estágio anterior a fase M da primeira divisão meiótica. O ovócito está, portanto, no estágio do ciclo celular equivalente à fase G2 do ciclo celular mitótico. 
	Em tais experimentos, foi observado que o extrato de um ovo em fase M promove instantaneamente a progressão para a fase M no ovócito, enquanto o citoplasma de um ovo em divisão em outras fases do ciclo não possui tal efeito. Quando foi descoberto, nem a identidade bioquímica nem o mecanismo de ação do fator responsável por esta atividade eram conhecidos, tendo simplesmente sido denominado de fator promotor da fase M ou MPF. Utilizando-se citoplasmas obtidos de diferentes estágios do ciclo celular foi demonstrado que a atividade de MPF oscila dramaticamente durante o curso de cada ciclo celular: aumenta rapidamente um pouco antes do início da mitose e cai rapidamente a zero ao final da mitose. Quando o MPF foi finalmente purificado, verificou-se conter uma única proteíno-quinase, necessária para a sua atividade. Pela fosforilação de proteínas específicas, esta quinase provoca a condensação cromossômica, a fragmentação do envelope nuclear e a reorganização dos micrtotúbulos do citoesqueleto formando o fuso mitótico. A fragmentação do envelope nuclear, por exemplo, ocorre pela ruptura da lâmina nuclear – uma camada de filamentos de lâmina. Da mesma forma a quinase fosforila as proteínas ligadas aos microtúbulos, que alteram as suas propriedades, formando o fuso mitótico. Porém a quinase MPF não pode atuar sozinha. Ela precisa estar ligada a uma ciclina específica para exercer sua atividade. A ligação da ciclina parece também auxiliar na localização da proteína-alvo da quinase.
	Como a ciclina por si só não possui atividade enzimática, sua função no controle do ciclo celular era inicialmente obscuro. O grande avanço ocorreu quando foi demonstrado que a ciclina era um componente do MPF. Assim, o MPF é um complexo protéico contendo duas subunidades – uma subunidade reguladora que é a ciclina e uma subunidade catalítica que é a Cdk mitótica. A regulação da concentração de ciclina desempenha um papel importante no fluxo de eventos do ciclo celular. A síntese do componente ciclina do MPF, por exemplo, tem início imediatamente após a divisão celular e continua regularmente durante a intérfase. A concentração da ciclina aumenta gradualmente e auxilia no estabelecimento do início da mitose, enquanto que sua subsequente redução rápida auxilia o término da mitose. 
Um grande número de mutantes de leveduras com bloqueio ou malfuncionamento em locais específicos do ciclo celular foram isolados, e, utilizando estes mutantes, foi possível identificar vários genes responsáveis pelo controle do ciclo celular. Alguns destes genes codificam as proteínas ciclinas e CdKs. Muitos genes que controlam o ciclo celular sofreram muito pouca alterações durante a evolução, tanto que a versão do gene humano funciona perfeitamente na célula de levedura.
Sendo assim, existem vários tipos de ciclina, e, na maioria do eucariotos, uma grande variedade de CdKs envolvida no controle do ciclo celular. Diferentes complexos de ciclina-Cdks desencadeiam diferentes estágios do ciclo celular. Deste modo, o sistema controle do ciclo celular promove os eventos do ciclo celular em uma ordem específica. A transição para a mitose, por exemplo, só ocorre após a replicação de todo o DNA, e a célula só pode ser dividida após o término da mitose. Se algum dos estágios for retardado, o sistema controle atrasa a ativação dos estágios seguintes, de maneira que a sequência é contida. Esta propriedade de auto-regulação do sistema controle garante, por exemplo, que, se houver suspensão da síntese de DNA por alguma razão durante a fase S, a célula não vai progredir para a fase M com apenas uma parte do seu DNA replicado. O sistema controle alcança este objetivo pela ação de freios moleculares que podem parar o ciclo celular em pontos de checagem específicos, permitindo que a célula verifique seu estado interno e o ambiente antes de prosseguir no ciclo. 
Uma das paradas nos pontos de checagem mais conhecida interrompe o ciclo celular em G1 se o DNA estiver danificado (Figura 9). Por meio de um mecanismo ainda não conhecido, uma lesão no DNA provoca um aumento tanto na concentração como na atividade de uma proteína de regulação gênica, denominada p53. Quando ativada a proteína p53 estimula a transcrição de um gene que codifica uma proteína inibidora de Cdk denominada p21. Com isto, há um aumento na concentração da proteína p21, que se liga ao complexo ciclina-Cdk da fase S, responsável pelo avanço para a fase S, bloqueando a sua função. A suspensão do ciclo celular em G1 permite que a célula tenha tempo para executar o reparo da lesão do DNA antes da replicação. No caso de ausência ou defeito na p53, a replicação descontrolada de DNA danificado gera uma alta taxa de mutações e a produção de células com tendência a se tornar cancerosas. Na verdade, mutações em p53 que permitem a replicação de DNA danificado são um fator importante no desenvolvimento da maioria dos cânceres humanos, como será visto adiante.
Sinais celulares são essenciais para a proliferação celular:
	Os organismos unicelulares, como as bactérias e leveduras, tendem a crescer e sofrer divisões o mais rápido possível, e sua taxa de proliferação depende principalmente da disponibilidade de nutrientes no ambiente. As células de um organismo multicelular, ao contrário, são membros especializados de uma comunidade altamente organizada, e sua proliferação deve ser controlada de modo que cada célula individual sofra divisão apenas quando uma célula adicional é necessária ao organismo – tanto para crescimento como para reposição de perdas celulares. 
Figura 9 – Mecanismo de ação de p53 ao interromper o ciclo celular em G1.
Assim, para a proliferação de uma célula animal, a presença de nutrientes não é por si só suficiente. A célula deve também receber um sinal químico estimulador de outras células, geralmente das células vizinhas. Estes sinais atuam transpondo os mecanismos intracelulares de frenagem, que tendem a restringir o crescimento celular e bloquear a progressão pelo ciclo celular. 
Um exemplo importante de um freio que geralmente suspende a proliferação celular é a proteína Rb, primeiramente identificada por meio de estudos de um tumor infantil raro dos olhos, denominado retinoblastoma, no qual a proteína está ausente ou imperfeita. A proteína Rb é abundante no núcleo de todas as células de vertebrados. Ela se liga à proteínas de regulaçãogênica específicas, evitando que estas estimulem a transcrição de genes necessários para a proliferação celular. Sinais extracelulares tais como fatores de crescimento estimulam a proliferação celular pela ativação dos complexos de ciclina-Cdk de G1, mencionados anteriormente. Estes fosforilam a proteína Rb, alterando a sua conformação, de modo que as proteínas de regulação gênica sejam liberadas da Rb, ficando livres para ativar os genes necessários para a continuação da proliferação celular. Os sinais estimuladores que atuam desativando os freios da proliferação são normalmente fatores de crescimento protéicos. Estas proteínas-sinais secretadas ligam-se a receptores da superfície celular, ativando vias de sinalização intracelular que estimulam o crescimento e a divisão celulares (Figura 10). 
Figura 10 – Mecanismo de bloqueio do ciclo celular pela proteína Rb. A proteína Rb liga-se a proteínas regulatórias impedindo a transcrição de genes essenciais para o início da divisão celular. Fatores de crescimento como o PDGF que estimulam divisão celular (em A) ligam-se a receptores de membrana induzindo um sinal para a célula se multiplicar (em B). Esse sinal intracelular ativa um complexo de Cdk-ciclina que fosforila a proteína Rb mudando a sua forma. Como conseqüência a proteína Rb se desliga da proteína regulatória liberando a transcrição do gene que estimula a divisão celular (em C).
Um dos primeiros fatores de crescimento identificados foi o fator de crescimento derivado de plaquetas, ou PDGF, cujos efeitos são característicos em vários outros fatores de crescimento.
Quando o sangue coagula (em um corte por exemplo), as plaquetas incorporadas no coágulo promovem a liberação de PDGF, que se liga a receptores de membrana, assim estimulando a proliferação celular nesta área e a cicatrização do corte. A maior parte das células animais necessita de uma combinação específica de vários fatores de crescimento para poder multiplicar-se em cultura. Assim, um número relativamente pequeno de fatores de crescimento pode participar em diferentes combinações para controlar seletivamente a proliferação de vários tipos celulares em um animal.
Um dos efeitos mais importantes relacionado a problemas no controle do ciclo celular é o câncer que será discutido posteriormente.
Câncer
O corpo de um animal pode ser visto como uma sociedade ou um ecossistema cujos membros individuais são as células, que se reproduzem por divisão celular e são organizadas em conjuntos colaborativos ou tecidos. As preocupações são semelhantes às dos ecologistas: nascimento celular, mortes, habitats, limitações territoriais, manutenção do tamanho da população e outros.
Um organismo sadio, neste aspecto, é uma sociedade muito peculiar, onde a regra é o auto-sacrifício, mais do que a competição: todas as linhagens celulares somáticas são comprometidas com a morte, não deixam progênie, mas dedicam a sua existência para o suporte às células germinativas que, por si, tem a chance de viver. Não há mistério nisso, para o corpo a célula somática é um clone e o seu genoma é o mesmo das células germinativas; pelo seu auto-sacrifício em favor das células germinativas, as células somáticas ajudam a propagar cópias de seus próprios genes. 
Assim, diferentemente das células de vida livre, tal como uma bactéria que compete para sobreviver, as células de um organismo multicelular são comprometidas para a colaboração. Qualquer mutação que dá origem ao comportamento egoísta por membros individuais irá colocar em risco o destino de todo o organismo. Mutação, competição e seleção natural operando dentro da população de células somáticas são os ingredientes básicos do câncer: é uma doença na qual células individuais mutantes iniciam sua prosperidade a custa de seus vizinhos, mas no final destrói toda a sociedade celular e morre.
Propriedades do Câncer
	As células cancerosas são definidas por duas propriedades hereditárias: 1) se reproduzem em detrimento das normais; 2) invadem e colonizam territórios normalmente reservados para outras células.
	É a combinação destas características que fazem os cânceres especialmente perigosos. Uma célula normal que não prolifera mais do que suas vizinhas normais não provoca danos significativos, independente de quaisquer propriedades desagradáveis que possa Ter, mas, se sua proliferação está fora de controle, irá originar um tumor ou neoplasma – um crescimento de uma massa de células anormais. À medida que células neoplásicas permanecem agrupadas em uma massa única, o tumor é dito benigno, e a cura completa pode ser obtida pela remoção da massa cirurgicamente. Um tumor é considerado como câncer somente se for maligno, isto é, somente se estas células tiverem a capacidade de invadir tecidos vizinhos. A capacidade de invasão geralmente implica na habilidade de escapar, entrar na corrente sanguínea ou vasos linfáticos e formar tumores secundários, ou metástases, em outros locais do corpo. Quanto mais metástases um câncer for capaz de produzir, mais difícil a sua erradicação.
	Os cânceres são classificados de acordo com o tecido e tipo de célula que lhe deu origem. Cânceres que se originam nas células epiteliais são chamados carcinomas, aqueles que se originam de tecidos conjuntivos ou musculares são denominados sarcomas. Temos também os cânceres derivados de células hematopoiéticas: leucemias entre outros.
	Cerca de 90% de cânceres humanos são carcinomas, talvez porque a maior parte da proliferação celular no corpo ocorre no epitélio ou talvez porque tecidos epiteliais são mais frequentemente expostos a várias formas de dano físico e químico que favorece o desenvolvimento do câncer.
	Cada câncer tem características que refletem a sua origem. Assim, por exemplo, as células de um carcinoma de célula basal da epiderme, derivado de uma célula primordial do queratinócito na pele, geralmente, continuarão a síntese de filamentos intermediários de citoqueratina, enquanto que células de um melanoma derivado de uma célula pigmentada da pele, com frequência (mas nem sempre), continuarão a produzir grânulos de pigmentos. Cânceres originários de diferentes tipos de células são, em geral, doenças muito diferentes. O carcinoma da célula basal, por exemplo, é somente invasivo e raramente forma metástases, enquanto que o melanoma é muito mais maligno e rapidamente dá origem a muitas metástases (comportamente que lembra a tendência migratória de precursores do pigmento celular durante o desenvolvimento).O carcinoma de células basais é geralmente fácil de ser removido por cirurgias, levando à completa cura; mas o melanoma maligno, uma vez metastático é geralmente impossível extirpá-lo e, em consequência, é fatal.
Origem do câncer
	Mesmo que um câncer tenha se tornado metastático, sua origem pode geralmente ser determinada como sendo de um único tumor primário originado de um determinado órgão e presumivelmente derivado por divisão de uma única célula que sofreu alguma mudança hereditária que permite a esta crescer mais do que as vizinhas. Quando é detectado pela primeira vez, no entanto, um tumor típico já contêm cerca de 1 bilhão de células ou mais, frequentemente incluindo muitas células normais – fibroblastos, por exemplo, no tecido conjuntivo associado ao carcinoma. Qual a evidência de que células cancerosas são de fato um clone oriundo de uma única célula anormal?
	Um tipo de demonstração vem da análise do DNA da célula. Em quase todos os pacientes com leucemia mielóide crônica, por exemplo, as células brancas leucêmicas do sangue são diferentes das células normais por apresentarem uma anormalidade específica do cromossomo (chamado de cromossomo Philadelphia, originado por uma translocação entre um braço longo do cromossomo 9 e do 22.
Quando o DNA no sítio de translocação foi clonado e sequenciado, foi encontrado que o sítio de quebra e nova junção dos fragmentos translocados é idêntico em todas as células leucêmicas em um determinado paciente, mas difereum pouco (por algumas centenas ou milhares de pares de bases) de um paciente para outro, como o esperado se cada caso de leucemia se origina de um único acidente que ocorre em uma única célula.
	Uma outra forma de demonstrar que um câncer tem uma origem monoclonal é pela exploração do fenômeno de inativação do cromossomo X. Uma mulher normal é uma mistura ao acaso, ou mosaico, de duas classes de células – aquelas em que o cromossomo paterno X é inativado e aquelas em que o cromossomo materno X é inativado. A inativação de um ou outro cromossomo X ocorre ao acaso em cada célula no incício do desenvolvimento embrionário, mas uma vez feita a escolha é irreversível, desta forma quando uma célula se divide esta passa sua própria forma de inativação do cromossomo X para suas filhas. Consequentemente, o estado de inativação do cromossomo X – materno ou paterno – pode ser utilizado como marcador hereditário para seguir uma linhagem no corpo. Na grande maioria dos tumores que tem sido analisados – tanto benignos quanto malignos – foi encontrado que todas as células tumorais possuem o mesmo cromossomo X inativado, o que é uma forte sugestão de que estas sejam derivadas de uma única célula alterada.
	Se uma única célula anormal dá origem a um tumor, esta deve passar a anormalidade para sua progênie: a aberração deve ser hereditária. O primeiro problema para compreender um câncer é descobrir se a aberração hereditária é devido a uma mudança genética, isto é, uma alteração na sequência do DNA da célula, ou a uma mudança epigenética, isto é, uma mudança no padrão de expressão gênica sem uma mudança na sequência do DNA. Há entretanto, boas razões para achar que a maior parte dos cânceres é iniciado por mudanças genéticas. Assim, células de um dado câncer podem, frequentemente, ser mostradas como tendo uma anormalidade compartilhada na sua sequência de DNA, como vimos para a leucemia mielóide crônica. Mais evidências de que mudanças genéticas podem ser a causa do câncer derivam de estudos com agentes conhecidos como causadores da doença. Uma relação entre carcinogênese (a geração do câncer) e mutagênese (mudança na sequência do DNA) é clara para três classes de agentes: carcinógenos químicos (que tipicamente causam mudanças locais na sequência de nucleotídeos), radiação ionizante, como os raios X (que tipicamente causam quebras cromossômicas e translocações) e vírus (que introduz DNA estranho na célula).
	Em geral, um dado câncer não pode ser o resultado de um único evento ou uma única causa: como veremos, cânceres, como regra geral, resultam da ocorrência de vários acidentes independentes em uma célula com efeitos cumulativos. Há, entretanto, alguns agentes excepcionalmente carcinogênicos que aumentam a probabilidade de tornar os eventos críticos para o desenvolvimento do câncer ao ponto de serem virtualmente certos, dando uma dose suficientemente alta, tornando pelo menos uma célula do corpo cancerosa. O composto 2-naftilamina, usado na indústria química, no início deste século, é um exemplo notório: em uma fábrica inglesa, todos os homens que haviam se empregado para destilar este composto (e foram portanto expostos por períodos prolongados) eventualmente desenvolveram câncer de bexiga.
	Muitos compostos químicos não relacionados entre si tem mostrado ser carcinogênico quando animais experimentais são alimentados ou pincelados na pele repetidamente. Alguns destes carcinógenos atuam diretamente na célula alvo, muitos outros são efetivos somente após terem sido modificados para uma forma mais reativa através de processos metabolícos – especialmente por um conjunto de enzimas intracelulares conhecidas como citocromo oxidases P-450. Estas enzimas normalmente ajudam na conversão de toxinas ingeridas e materiais lipídicos solúveis estranhos em compostos inócuos e facilmente excretáveis, mas estas falham nesta tarefa com certas substâncias, convertendo os mesmos em carcinógenos.
	Em um teste popular para mutagenicidade, o carcinógeno é misturado com um extrato ativador preparado de células de fígado de rato (para mimetizar o processamento bioquímico que ocorre em um animal intacto) e é adicionado a uma cultura de bactérias especialmente designada para o teste; o índice de mutação resultante na bactéria é então determinado. A maioria dos compostos classificados como mutagênicos por este método bacteriológico rápido e conveniente também causam mutações e/ou aberrações cromossômicas quando testados em células de mamíferos.
Uma única mutação não é capaz de causar um câncer
	Alguma coisa na ordem de 1016 divisões celulares ocorrem no corpo humano durante a vida; em um camundongo, com seu menor número de células e seu menor tempo de vida, seu número é de cerca de 1012. Mesmo em um ambiente livre de mutagênicos, mutações irão ocorrer espontaneamente a uma razão estimada em cerca de 10-6 mutações por gene por divisão celular – um valor estabelecido por limitações na acuidade da replicação do DNA e reparo. Entre as células mutantes poderá ter muitas que possuem distúrbios nos genes envvolvidos na regulação da divisão celular e, em consequência, que desobedecem às restrições normais da proliferação celular. Deste ponto de vista, o problema do câncer parece ser não o porque ocorre, mas porque ocorre com baixa frequência.
	Evidentemente uma única mutação não é suficiente para converter uma célula sadia típica em uma célula cancerosa que prolifera sem restrição, ou seríamos organismos inviáveis. Muitas linhas de evidências indicam que a gênese de um câncer requer, como regra geral, que vários acidentes raros e independentes ocorram juntos em uma célula. Uma destas indicações originam de estudos epidemiológicos da incidência do câncer como função da idade. Se uma única mutação fosse responsável, ocorrendo com uma probabilidade fixa por ano, a chance de desenvolver câncer em dado ano seria independente da idade. Ao contrário, para a maior parte dos tipos de câncer a chance sobe muito com a idade – tipicamente em uma progressão geométrica. A partir de tais estatísticas, foi estimado que em torno de 3 a 7 eventos ao acaso e independentes, cada um com baixa probabilidade, são necessários para tornar uma célula normal em cancerosa; um menor número se aplica a leucemias, e um maior número a carcinomas.
	Agora que mutações específicas responsáveis pelo desenvolvimento do câncer foram identificadas, tornou possível testar os efeitos dos genes mutantes em camundongos transgênicos. Como veremos mais tarde, os resultados trazem evidências adicionais e mais diretas para a hipótese de que uma única mutação é insuficiente para causar o câncer. 
Desenvolvimento do Câncer
	 Para os cânceres que têm uma causa externa conhecida, há sempre um longo período entre os eventos causais e o estabelecimento da doença: o câncer pulmonar inicia a fase de desenvolvimento rápido somente após 10 ou 20 anos de fumo intenso; a incidência de leucemias de Hiroshima e Nagasaki não apresentou um aumento marcante até cerca de 5 anos após a explosão da bomba atômica, alcançando o seu pico após 8 anos; trabalhadores de indústrias expostos por períodos limitados a carcinógenos químicos em geral não desenvolvem os cânceres característicos da ocupação até, 10, 20 ou mais anos após a exposição.
A leucemia mielóide crônica, mencionada anteriormente, fornece um exemplo claro e simples. Esta doença tem início com uma desordem caracterizada por uma grande produção de células brancas do sangue não letais e continua como tal por vários anos, antes de mudar para uma doença rapidamente progressiva que termina em morte em poucos meses. Na fase crônica inicial, as células leucêmicas no corpo são distinguíveis simplesmente por possuir translocação cromossômica, mencionada previamente. Na fase aguda, subsequente, o sistema hematopoético é tomado por células que apresentam, não somente esta anormalidade cromossômica, mas várias outras. Parece que membros dos clones mutantes iniciais sofrem outras mutações que os fazem proliferar mais rapidamente(ou dividir mais vezes antes de morrer ou atingir o seu estágio final de diferenciação), de forma que sobrepõem às células hematopoéticas normais e suas primas que apresentam somente desordens primárias.
	Carcinomas e outros tumores sólidos parecem evoluir de forma semelhante. Embora a maior parte destes tumores em humanos não seja diagnosticada até um estágio relativamente tardio, em poucos casos é possível observar as etapas iniciais do desenvolvimento da doença.
	Outro exemplo é fornecido pelos cânceres da cérvice uterina (região mediana do ventre). Estes cânceres derivam do epitélio cervical em multicamada, que possuem uma organização semelhante à da epiderme da pele. Normalmente, a proliferação ocorre somente na camada basal, gerando células que se movem para fora da superfície, diferenciando-se em células achatadas, ricas em queratina, que não se dividem à medida que se movem e finalmente são lançadas para fora da superfície. No entanto, quando muitos esfregaços deste epitélio são examinados em diferentes mulheres, não é raro encontrar focos de displasia, onde células em divisão não estão mais confinadas à camada basal e há alguma desordem no processo de diferenciação. Células são descamadas da superfície em fase anormalmente precoce de diferenciação, e a presença de displasia pode ser detectada por uma retirada de amostra de células da superfície, observada ao microscópio (esfregaço de Papanicolau). Se forem deixados, os focos displásicos permanecerão sem causar prejuízo, ou mesmo, podem regredir espontaneamente, podem, raramente, progredir em períodos de vários anos, para dar origem a focos chamados de carcinoma in situ. Nessas lesões mais sérias, o padrão normal da divisão celular e diferenciação está interrompido de forma mais severa, e todas as camadas do epitélio consistem de células indiferenciadas e em proliferação, que são frequentemente variáveis em tamanho e cariótipo, porém as células anormais estão ainda confinadas ao lado epitelial da lâmina basal. Neste estágio, ainda é fácil atingir a cura completa por destruição ou remoção cirúrgica. Sem tal tratamento o foco anormal pode ainda permanecer sem causar prejuízo ou regredir, mas em 20 a 30% dos casos irá desenvolver-se ao longo de vários anos para dar origem a um carcinoma maligno da cérvice, cujas células rompem o epitélio atravessando a lâmina basal e iniciam a invasão do tecido conjuntivo. A cura cirúrgica torna-se progressivamente mais difícil à medida que o crescimento invasivo se espalha.
	Como ilustrado nos exemplos anteriores, cânceres em geral parecem originar-se por um processo no qual uma população inicial de células levemente anormais, descendentes de um único ancestral mutante, evoluem de mal a pior através de sucessivos ciclos de mutação e seleção natural. Esta evolução envolve um grande elemento de chance e geralmente leva muitos anos; a maioria das pessoas morrem de outras doenças antes do câncer ter tido tempo de se desenvolver. Para entender as causas do câncer, é essencial conhecer os fatores que podem aumentar a velocidade desse processo.
	Os estágios pelos quais uma lesão inicial moderada progride para se tornar um câncer pode ser facilmente observada na pele. Cânceres de pele podem ser induzidos em camundongos, por exemplo, pincelando a pele repetidamente com um carcinogênico químico tal como o benzo[a]pireno (um constituinte do carvão e fumaça do tabaco) ou o composto relacionado dimetilbenz[a]antraceno (DMBA). Geralmente, uma única aplicação do carcinogênico não dá origem ao tumor ou qualquer outra modificação duradoura. No entanto, causa dono genético latente, e pode ser detectado através de um grande aumento da incidência de câncer quando as células são expostas novamente ao tratamento com a mesma substância ou por outras injúrias de origens diferentes. Um carcinógeno que se comporta desta forma é chamado de iniciador do tumor. Um simples ferimento na pele, que tenha sido exposto uma vez a tais iniciadores, pode causar o desenvolvimento de câncer a partir de algumas células da borda do ferimento. Alternativamente, exposições repetidas em períodos de meses a certas substâncias conhecidas como promotores de tumor, que por si não são mutagênicos podem causar câncer seletivamente na pele exposta ao iniciador do tumor. Os promotores de tumor mais estudados são os esteres de forbol, tais como o acetato de tetradecanoilforbol (TPA). Estas substâncias causam câncer em alta frequência somente se são aplicadas após tratamento com um iniciador mutagênico.
Como devemos esperar por dano genético, as mudanças não visíveis causadas por um iniciador tumoral são irreversíveis: assim podem se manifestar por tratamento com um promotor tumoral mesmo depois de ter passado um longo período. O efeito imediato do promotor é, aparentemente estimular a divisão celular (ou induzir as células que iriam seguir para a sua diferenciação final continuarem a sua divisão) na região que havia sido exposta previamente ao iniciador. Isto resulta no crescimento de diversos tumores benignos pequenos, semelhantes à verrugas, denominados papilomas. Quando maior a dose anterior do iniciador, maior o número de papilomas induzidos; parece que cada papiloma (pelo menos para baixas dosagens do iniciador) consiste de um único clone de células descendentes de uma célula mutante que o iniciador gerou. Ambos, ferimento e aplicação do promotor provavelmente atuam induzindo a expressão de genes que diretamente ou indiretamente afetam a proliferação celular. Tais genes podem permanecer quiescentes no restante do epitélio, de forma que qualquer mutação surgida, em resposta ao iniciador, pode continuar não detectável, porém por indução da expressão de genes mutatos, o promotor ou o estímulo do ferimento pode influenciar no início da proliferação celular.
	Um papiloma típico pode conter cerca de 105 células. Se a exposição ao promotor do tumor é cessada, quase todos os papilomas regridem, e a pele volta à aparência normal – como o esperado pela hipótese ilustrada na figura 8. Entretanto, em poucos papilomas, outras mudanças ocorrem permitindo o crescimento de forma incontrolada, mesmo depois da retirada do tumor. Estas mudanças parecem originar ocasionalmente em um único papiloma em uma frequência esperada para mutações espontâneas. Desta forma, uma pequena proporção dos papilomas progridem para câncer. Assim, o promotor de tumores favorece o desenvolvimento de câncer, pelo menos neste sistema, pela expansão da população de células que carregam uma mutação inicial: quanto maior o número de tais células mais vezes se dividem, maior a chance de que pelo menos uma delas sofra uma outra mutação levando para mais uma etapa em direção à malignidade. Embora cânceres que ocorrem naturalmente não necessariamente se originem através da sequência específica de etapas distintas de iniciador e promotor aqui descritos, sua evolução deve ser governada por princípios semelhantes.
Origem a partir de causas ambientais evitáveis
	O desenvolvimento de um câncer geralmente envolve muitas etapas, cada qual governada por múltiplos fatores, alguns dependentes da constituição genética do indivíduo, outros dependentes do ambiente e do estilo de vida. Portanto, por mudança do ambiente ou hábitos, devemos, em princípio, ser capazes de reduzir drasticamente nossa chance de desenvolver todos os tipos de câncer. Isto é demonstrado mais claramente pela comparação da incidência de câncer em diferentes países: para quase todos os cânceres que são comuns em um país, há um outro onde a incidência é muitas vezes menor; e populações migrantes tendem a apresentar o padrão de incidência do câncer típico do país onde vive, implicando que as diferenças são devidos a fatores ambientais, não genéticos. Infelizmente, diferentes cânceres possuem diferentes riscos ambientais, e o país que escapa desse perigo não é sujeito ao escape de outros.
	Apesar de tais observações epidemiológicas indicarem que o câncer pode ser evitado, permanece difícil identificar fatores específicosambientais ou estabelecer como eles atuam. Alguns, certamente atuam operando como iniciador mutagênico de tumor, provocando diretamente mudanças genéticas; outros, provavelmente servem como promotores tumorais e ajudam a aumentar a população de células suscetíveis a progredir, através de mais mutações, desenvolvendo o tumor. O carcinógeno na fumaça do cigarro, assim como a aflatoxina no amendoim, provavelmente pertencem a primeira categoria, enquanto que os hormônios reprodutivos que circulam na mulher em diferentes fases da vida podem pertencer à segunda categoria. A importância destes hormônios está indicada pela correlação que existe entre a história reprodutiva da mulher e o seu risco de desenvolver o câncer mamário; o hormônio parece afetar a incidência de câncer através de sua influência na proliferação celular da mama.
	É possível que alguns fatores atuem de outras formas – por exemplo, causando mudanças nos fatores epigenéticos hereditários.
Busca da cura do Câncer
	A dificuldade da cura do câncer é como a dificuldade de se livrar de ervas daninhas. As células cancerosas podem ser removidas cirurgicamente ou destruídas com drogas tóxicas ou radiação, mas são difíceis de serem erradicadas completamente. A cirurgia pode, raramente extirpar todas as metástases, e tratamentos que matam as células cancerosas são geralmente tóxicos para as células normais. Mesmo que poucas células cancerosas permaneçam, podem proliferar para causar o resurgimento da doença; e diferentemente das células normais podem desenvolver resistência para as substâncias tóxicas utilizadas contra elas. Ainda assim, a perspectiva não é sem esperança. Apesar das dificuldades, curas efetivas usando drogas anticâncer (sozinhas ou em combinação com outros tratamentos) foram estabelecidas para alguns tipos de câncer anteriormente considerados de alta letalidade (linfoma de Hodkin, câncer testicular, coriocarcinoma e algumas leucemias e outros cânceres de infância). Além disso, para vários dos cânceres mais comuns, cirurgia apropriada ou radioterapia local permite que uma grande parte dos pacientes se recuperem da doença, se diagnosticada em um estágio inicial.
	Tratamentos efetivos podem, às vezes, ser baseados na compreensão das causas de um determinado câncer. Estrógenos, por exemplo, parecem atuar como promotores naturais em câncer de mama, e tratamento com antagonistas de estrógeno, tal como tamoxifen, é efetivo em muitos pacientes com câncer de mama em prevenir ou retardar a recorrência da doença. Mesmo para tipos de câncer onde a cura no momento parece estar além de nosso alcance, há tratamentos que prolongam a vida ou pelo menos aliviam o sofrimento.
	Grandes esforços na pesquisa clínica do câncer tem sido centrados no problema de como matar células cancerosas seletivamente. Métodos correntes, na sua maioria, exploram as diferenças entre células neoplásicas e normais, com respeito a sua velocidade de proliferação, metabolismo e radiossensibilidade. Alguns tipos de células cancerosas são especialmente vulneráveis ao ataque seletivo porque dependem de hormônios específicos ou porque sua superfície possui características químicas que permitem ser reconhecidas por anticorpos. Deste modo, nos últimos anos, avanços tem sido feitos no uso de vacinas e anticorpos monoclonais no combate ao câncer.
Crescimento das células cancerosas
	Temos até aqui enfatizado que as células cancerosas desafiam o controle normal das células em divisão: está é sua propriedade central. Mas há outros fatores requeridos para um tumor crescer sem limite. A célula tumoral deve, por exemplo, estimular o desenvolvimento dos vasos sanguíneos para trazer os nutrientes e oxigênio que necessitam para o crescimento.. Muitos tecidos são ainda organizados de tal forma que mesmo um aumento incontrolado na frequência das divisões celulares não irá por si produzir um crescimento tumoral contínuo. O exemplo da cérvice uterina, ilustra este ponto. Como a epiderme da pele e muitos outros epitélios, o da cérvice uterina, se renovam continuamente por descamação das células totalmente diferenciadas de sua superfície externa e se renovam a partir das células primordiais da camada basal. Em média, cada divisão da célula primordial gera uma célula-filha primordial e uma que é destinada à diferenciação final e consequentemente param a sua divisão celular. Se a célula primordial simplesmente se divide de forma mais rápida e células totalmente diferenciadas produzidas forem descamadas mais rapidamente, um balanço da gênese e destruição será ainda mantido. Assim, se uma célula primordial transformada deve gerar um clone que cresce continuamente da progênie, a regra básica deve ser perturbada: mais de 50% das células filhas devem permanecer como células primordiais ou o processo de diferenciação deve sofrer um desarranjo, de forma que as células filhas que embarcaram nesta rota mantêm a habilidade de continuar a divisão indefinidamente evitando a morte ou o descarte no final da linha de produção.
	Presumivelmente, o desenvolvimento de tais propriedades levam à progressão de displasia moderada da cérvice uterina ao carcinoma in situ e ao câncer maligno. Considerações semelhantes se aplicam ao desenvolvimento de câncer em outros tecidos que dependem de células primordiais, tais como a pelo, o revestimento do intestino e o sistema hematopoético. Várias formas de leucemia, por exemplo, parecem originar-se do rompimento de um programa normal de diferenciação, ou seja, uma célula progenitora comprometida com um tipo particular de célula do sangue continua a se dividir indefinidamente, ao invés de se diferenciar totalmente da forma normal e morrer após um número limitado de ciclos de divisão. Em geral, mudanças que bloqueiam a maturação normal das células em direção a não divisão, o estado de diferenciação total ou prevenção da morte celular programada, devem exercer papel essencial em muitos cânceres. Portanto, no tratamento do câncer, há alguma probabilidade de que drogas que promovam a diferenciação podem tornar uma alternativa útil para drogas que simplesmente matam células em divisão.
Angiogênese tumoral
	O crescimento de tumores sólidos além de 2 mm de diâmetro requer um meio de nutrição, o que não pode ser feito por simples difusão. Novos vasos sanguíneos capilares originam-se dos capilares ou vênulas pré-existentes e se alojam ao redor do tumor por um processo chamado de angiogênese tumoral ou neovascularização. O estímulo para as colunas de células endoteliais alinhadas que anastomosam com colunas adjacentes para formar voltas e um lúmen, vem dos chamados peptídeos angiogênicos, que estimulam a motilidade e proliferação de células endoteliais. Muitos desses peptídeos são produzidos e liberados por células neoplásicas incluindo fatores de permeabilidade vascular ou fatores de crescimento vascular endotelial (VEGF), ou outros, como TGF-(, que pode ser produzido tanto por células tumorais como por macrófagos infiltrados .
 Metástases
	As metástases são tumores secundários que crescem separadamente de tumores primários. Se originam de células que se destacaram do tumor primário e foram transportadas para outros locais. A capacidade de formar metástases é que torna os cânceres difíceis de serem erradicados cirurgicamente ou por irradiação localizada. Para sua ampla disseminação pelo corpo, uma célula típica de um tumor sólido deve ser capaz de diminuir sua adesão às vizinhas, escapar do tecido de origem, migrar por outros tecidos até alcançar os vasos sanguíneos ou linfáticos, atravessar a lâmina basal e o revestimento endotelial dos vasos de forma a entrar e sair da circulação em outro local do corpo, sobreviver e proliferar no novo ambiente. Uma vez na luz dos vasos deverão escapar dos múltiplos sistemas de defesa, tais como anticorpos, complemento, macrófagos, linfócitos, células NK etc. As células tumorais sendo pouco deformáveis, devem sobreviver aos inúmeros traumatismos decorrentes da circulação. Cada uma das etapas requer