Clonagem gênica

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Clonagem gênica
É utilizada para gerar cópias de fragmentos superiores a 40Kb quando possui genes sem o conhecimento da sequencia ou quando não é possível fazer a PCR.
Estágio de amplificação: nesse estágio há a construção de um DNA recombinante, para que isso ocorra é preciso que uma enzima de restrição clive uma região não essencial do DNA circularizado para que possa haver a inserção do gene alvo. Após a inserção do gene alvo há a transformação que consiste em inserir esse plasmídeo na célula competente (célula submetida ao processo de inserção do DNA) que pode ser uma bactéria ou levedura, é necessário que haja apenas um plasmídeo por célula transformada (célula com DNA recombinante). Conforme elas se reproduzem, replicam o plasmídeo e o transmitem para seus descendentes, produzindo cópias do DNA que ele contém.
Transformação: uma bactéria/levedura normal é tratada com cloreto de cálcio (CaCl2) para que ela vira uma célula competente. Ao se transformar em célula competente, o plasmídeo se prende a membrana celular e é transportado para dentro. Esse processo se chama transfecção quando é a inserção de um fago na célula.
Estágio de separação: em alguns casos há a amplificação de mais de um plasmídeo por placa, região onde as bactérias formam sua cultura. Para que consiga escolher as bactérias contendo o DNA recombinante especifico é necessário que haja a separação; em alguns casos também podem até haver, junto com as bactérias com DNA recombinantes, bactérias que tiveram plasmídeos que não possuem o gene alvo. 
Para que essa separação possa ocorrer é necessário que no plasmídeo produza os marcadores de seleção, que são proteínas de resistência a antibiótico, logo após a transformação.
Como identificar o vetor recircularizado contendo a inserção do DNA?
Usando como exemplo a pBR322, que possui resistência tanto a ampicilina quanto a tetraciclina, pode-se inserir o DNA recombinante invalidando uma das duas resistências deixando-a resiste ou a tetraciclina ou a ampicilina. 
Após isso, colocam-se as células em um meio contendo antibiótico em que as duas são resistentes e as deixam multiplicar. Com as colônias formadas encosta numa outra placa na placa onde há as colônias para que as bactérias fiquem aderidas e as colocam em meio a outro antibiótico, que apenas uma possui resistência. Com isso, essa nova placa ficará com regiões vazias, que é onde houve morte celular, e dará para comparar uma placa com a outra pra saber em que posição se encontra as bactérias recombinantes.