Resumo Citoesqueleto

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Biologia Molecular – Citoesqueleto
O citoesqueleto é composto por filamentos que encontramos no citoplasma das células eucarióticas. É responsável por conferir a forma e sustentação da célula, assim como todos os seus movimentos. Ou seja, o citoesqueleto se encarrega de capacitar as células para se deslocarem no meio em que vivem, por exemplo: a emissão de projeções como os cílios e flagelos, age nos espermatozoides, em neurônios que estão constantemente emitindo finas projeções de membrana para fazer ou desfazer contatos com células vizinhas, nas células musculares com a especialização de contrair-se, no tráfego de organelas e vesículas, entre outras funções celulares. 
É formado por três tipos de filamentos:
Microfilamentos (FORMADOS PELA PROTEÍNA ACTINA) 4-7 nm
Microtúbulos (FORMADOS PELA PROTEÍNA TUBULINA) 22-25 nm
Filamentos intermediários (FORMADOS POR PROTEÍNAS DIVERSAS) 7-11 nm
As diferenças entre os tipos de filamento se dá pela espessura de cada um. Os três tipos possuem, cada um, características próprias de resistência e tensão, flexibilidade e estabilidade. Todos são formados através da polimerização de proteínas. Todos podem polimerizar-se e despolimerizar-se rapidamente, entretanto, os filamentos intermediários podem suportar níveis de tensão e deformação que causariam ruptura de microfilamentos e microtúbulos. 
Microfilamentos:
São os mais finos. Além de flexíveis, formam feixes paralelos ou redes na parte mais periférica da célula (chamado de córtex celular), embora se distribuam por todo o citoplasma. 
Disposição do filamento: A actina está mais próxima da membrana, chamamos de cortical. 
Polimerização de microfilamentos: ATP / Ca2+/ Mg2+/ prtns CAPA DE ATP
 dímero (homo)
 2 filamentos formam 1 Microfilamento (actina – F) 
O processo é dinâmico e reversível
ATP, Ca2+, Mg2+, proteínas acessórias: 
+ = Tendência a receber monômeros
- = Tendência a perder monômeros
O monômero entra com ATP, mas esse ATP não é quebrado na hora, as primeiras moléculas tem ATP, sendo assim a primeira região é chamada de capa de ATP. Ou seja, a energia é usada na polimerização, mas não de forma imediata. 
A actina polimerizada serve para empurrar a membrana, por exemplo, na migração celular: quando a célula migra, emite uma projeção de membrana, por dentro o citoesqueleto de actina empurra a membrana, ou seja, é preciso polimerizar para a célula se movimentar. 
Fatores que regulam a polimerização: Energia em forma de ATP - o monômero de actina tem um sítio de ligação do ATP, quando ele polimeriza vira ADP- Também precisa de íons, Ca2+ e Mg2+, sem eles a estrutura da actina não fica estabilizada. Além disso, as proteínas associadas também participam se ligando na actina induzindo a polimerização ou atrapalhando. E foi recentemente descoberto que a temperatura ajuda a regular o processo, frio atrapalha a polimerização, enquanto que o calor agita as moléculas fazendo com que tenha a polimerização, não no nosso organismo, pois regulamos a temperatura.
Proteínas associadas variam muito de célula pra célula, são centenas que se associam a actina pra célula se comportar de maneira diferente. Exemplos de processos envolvendo proteínas associadas à actina:
Miofibrilas de células musculares estriadas. (miosina associada à actina)
 Fibra muscular (multinucleada)
 sarcomero
 
 linha z linha z
 banda I banda A banda I
 Tropomiosina/ troponina C (alta afinidade com o cálcio, logo muda a conformação e todas as outras troponinas e a tropomiosina se dobram, voltando-se pra cima e abrindo caminho pra miosina reconhecer a actina), troponina T, troponina I – Liga-se a actina quando o músculo esta em repouso, controlando quando a miosina e a actina vão agir pra contrair.
Actina - 
Miosina (as cabeças da miosina estão viradas para a actina)
Contato focal ou adesão célula – matriz extracelular (malha)
Liga uma célula à matriz extracelular, exemplo: uma célula aderida a um substrato:
 Contato focal (célula se prende ao substrato ou a matriz por centenas de proteínas diferentes)
 actina – F proteína associada à actina 
 Membrana plasmática
 Proteína transmembrana (integrina) - α e β
 Fibromectina (proteína da matriz extracelular)
A actina chega à membrana plasmática pela ajuda de proteínas associadas à actina, ligando-se a integrina (proteína transmembranal). Descobriram que quando a célula vai migrar ela desorganiza esses contatos focais, processo relacionado à metástase, quando a célula tumoral perde a adesão e migra pra atingir a corrente sanguínea. Então é estudado o que faz com que essa célula perca a adesão e comece a migrar numa situação patológica qualquer. 
Sobre as proteínas associadas à actina, hoje, sabe-se que existem cerca de centenas dessas proteínas que decidem se a célula vai aderir, migrar, ou mudar de forma, tudo relacionado à adesão focal. Proteínas mais conhecidas: vinculina, paxilina, alfa-actina, talina e FAK. 
Quem define se a actina vai polimerizar é o ATP, Ca2+, Mg2+ e as proteínas associadas, mas os três primeiros não variam muito na célula, as proteínas que decidem de fato o que vai acontecer com a actina. 
Processo acrossomal de espermatozoides 
Descobriram que quando o espermatozoide vai fecundar a célula-ovo, o citoesqueleto de actina é fundamental. Isso porque, na cabeça do espermatozoide acontece a polimerização da actina, devido a proteínas acessórias a ela, como a profilina que bloqueia a polimerização se ligando na actina-G e a fascina que garante o espaçamento entre os filamentos polimerizados. A polimerização da actina acontece quando o espermatozoide encosta na membrana da célula-ovo fazendo com que tenha uma mudança na membrana da célula e uma liberação de Ca2+ dentro da cabeça do espermatozoide, este inibe a profilina, fazendo com que tenha a polimerização da actina-G. O filamento é formado e a fascina ajuda-o a se organizar por meio dos espaçamentos. Logo, qualquer falha nesse processo pode gerar problemas na fecundação. 
Anel contrátil de células em divisão:
Na etapa final da divisão celular se forma uma região chamada de anel contrátil (ou citocinese), no momento em que as células filhas vão se separar. Ocorre da seguinte forma: O anel contrátil é cheio de actina e miosina, e quando elas contraem as células filhas se separam, ou seja, a actina e miosina deslizam uma em cima da outra fazendo com que tenha a separação das células. Esse processo ocorre no final da mitose, e para que a mitose seja bem sucedida é preciso ter essa etapa, caso o processo seja bloqueado a célula não se divide. Esse mecanismo de regulação do final da mitose pode ser estudado em casos de proliferação de células, por exemplo: O bloqueio da etapa de mitose nas células tumorais, que se dividem indefinidamente. 
Movimento de vesículas ligadas à miosina:
Feito por várias miosinas, chamadas de miosinas não convencionais. Exemplo: miosina I. Tem esse nome porque a convencional é a da contração (1). A miosina é a proteína que vai se mover levando a vesícula, portanto ela é uma proteína motora, utiliza ATP (é chamada de ATPase). Transportam, por exemplo, pigmentos dentro das vesículas, no caso de alguns animais. 
Microvilosidades de células epiteliais intestinais:
Polimerização de microfilamentos (com substâncias associadas):
Actina – G (globular) - Actina- F (filamentosa) 
Setas: polimerização / despolimerização 
ATP, Ca2+, Mg2+, proteínas acessórias:	
Droga inibidora da polimerização: 
Substância estabilizadora: 
Tem drogas que alteram a polimerização,como a citocalasina e a latrunculina. Agem ligando-se ao monômero, impedindo-o de se ligar a outro monômero, e há também substâncias que são estabilizadoras, porque elas impedem a quebra do polímero, pela ação de proteínas ou outros fatores que poderiam separar a actina-F. 
Microtúbulos:
São muito mais rígidos que os microfilamentos, partem sempre de uma região definida do citoplasma: o centrossomo ou centro organizador de microtúbulos (COMt). As subunidades (monômeros) de tubulina formam cilindros ocos. Determinam a forma geral da célula e a disposição de suas organelas. A posição relativa do núcleo, do complexo de Golgi, das mitocôndrias e ainda outras estruturas citoplasmáticas dependem da disposição dos microtúbulos. Estão envolvidos na divisão celular, na movimentação dos cromossomos. Como estão presentes na divisão celular, drogas que os alteram são usadas no tratamento do câncer, como a colchicina e colcemide. 
Em laboratórios biomédicos, são estudadas as funções de um elemento do citoesqueleto numa certa função celular, quando bloqueia ou atrapalha esse elemento detecta-se o que acontece com aquela função, por ex: a citocalasina atrapalha o microfilamento, ele se quebra, caso jogue citocalasina numa célula, o que acontece com a migração de uma célula tumoral, por exemplo? Ela é atrapalhada? Se sim, o pesquisador determinada que o microfilamento seja essencial para esse processo. 
Disposição do filamento: Esta mais próximo do núcleo (MTOCs=COMt)
Polimerização de microtúbulos: NÃO HÁ NECESSIDADE DE ATP E SIM GTP, Ca2+, Mg2+ e prtns associadas. 
tubulina (α e β) dímero (hétero) protofilamento 13 protofilamentos (Microtúbulo) - oco
Processo dinâmico e reversível
GTP, Ca2+, Mg2+, proteínas acessórias: 
+ = Tendência a receber monômeros
- = Tendência a perder monômeros
O monômero entra com GTP, mas esse GTP não é quebrado na hora, as primeiras moléculas tem GTP, sendo assim a primeira região é chamada de capa de GTP. Ou seja, a energia é usada na polimerização, mas não de forma imediata. 
Movimento de vesículas ligadas a microtúbulos: Transporte axonal de vesículas 
Nesse caso são duas proteínas diferentes, as quinesinas e as dineínas, que são proteínas motoras ligando a vesícula ao citoesqueleto. Nos neurônios as vesículas estão carregando os neurotransmissores (exemplo: acetilcolina), eles são produzidos próximos do corpo celular do neurônio e precisam trafegar todo o neurônio para serem secretados. Para a vesícula realizar esse movimento, existem microtúbulos (formados de tubulinas) transportando-as. As vesículas são presas com as proteínas quinesinas e dineínas, que usam ATP para movimentar a vesícula (são chamadas de ATPases), e no final do processo elas se soltam do microtúbulo, fundindo-se a membrana para liberar o neurotransmissor. 
Sabe-se que existe uma tendência do lado - estar próximo do núcleo e ancorado no centrossomo, e o lado + afastado do núcleo, então a dineína e quinesina não fazem a mesma coisa. A quinesina vai para o lado + (próximo da membrana) e a dineína para o lado - (próximo do núcleo), isso porque não são só vesículas com neurotransmissores que estão sendo liberadas, descobriram que o neurônio recebe moléculas (faz endocitose), ou seja, moléculas entram na célula e precisam ser levadas até o núcleo para a sinalização. Isso quer dizer que tem vesículas saindo e entrando. As vesículas que vão à direção de saída estão indo na direção anterógrada e as que estão voltando, à direção retrógrada.
Filamentos intermediários
Formados por proteínas fibrosas, são os mais estáveis e conferem à célula resistência mecânica, são formados por várias proteínas diferentes, de acordo com o tipo celular. 
Disposição do filamento: Ocupam a célula, desde a membrana até a região em volta do núcleo.
Tipos de proteínas: Específicas de certos tipos celulares com exceção das laminas e das vimentinas 
Queratinas: Células epiteliais
Desminas: Células musculares
Vimentinas: Células mesenquimais (fibroblasto), associada a células que estão se dividindo muito, como tumorais, e em cultura. 
GFAP: Proteína ácida fibrilar glial, sistema nervoso
Neurofilamentos: Células neuronais
Periferinas: Sistema nervoso periférico
Nestina: Células tronco neuronais e musculares
Laminas A, B C: Se encontram no núcleo da célula (associadas à membrana nuclear interna) e o restante do citoplasma. Estão presentes em TODAS as células eucarióticas, por isso são chamadas de proteínas ubiquitárias. 
Observações: Esse filamento é constituído por uma família de proteínas que tem homologia alta entre si, ou seja, semelhanças na sequência de aminoácidos, todas estão no plural porque são isoformas/isotipos/isovariantes, isso quer dizer que existem, por exemplo, várias queratinas que se diferem por alguns aminoácidos, ou devido a uma fosforilação (mudança pós-tradicional): adição do radical fosfato, ou uma glicosilação: adição de glicídios à proteína, como é o caso das integrinas e caderinas na membrana, e das lamininas, colágeno e fibronectina na matriz extracelular. 
Não existe nenhuma droga específica para os filamentos intermediários, por acaso a colcemide que age nos microtúbulos tem efeitos secundários neles, mas até hoje ninguém descreveu uma substância que age só no filamento intermediário. 
Por serem proteínas específicas de certos tipos celulares, são usadas como marcadores de origem de tumores. 
Imunofluorescência
A imunofluerescência é usada para dois objetivos principais: ver se a proteína está presente ou não e onde ela está. Analisando-se no microscópio óptico de fluorescência. São usadas três cores: verde, azul e vermelho. É utilizado um anticorpo marcado (fluoróforo ou fluorocromo) para ver uma estrutura. O anticorpo é uma imunoglobulina (proteína) – IG - 
Direta: Próprio anticorpo ligado à fluorescência
Indireta: Anticorpo primário ligado no anticorpo secundário (marcado). Esse tipo de imunofluorescência aumenta o sinal, ou seja, a chance de se ver um resultado positivo. 
 Anticorpo: Têm cadeias pesadas (azul) e leves (verde), a região Fc é constante, que varia menos de um anticorpo pra outro. A Fab varia mais, pois é a região que vai reconhecer o antígeno, cada antígeno diferente vai ser reconhecendo por um anticorpo diferente. Existem 5 tipos de imunoglobulinas. Região que o anticorpo reconhece: epítopo. 
Anticorpo monoclonal: Isolam do camundongo células linfócitos B (produzem imunoglobulinas e secretam), colocam em placas com poços de forma que em cada poço tenha um linfócito B que secreta um tipo de anticorpo. Como essa célula em cultura não dura muito, desenvolveram uma técnica de fundir um linfócito em uma célula tumoral (linfoma) porque ela se replica eternamente. Com isso são produzidos vários anticorpos de um tipo só, contra um epítopo. Mais específico, porém, a chance de dar certo é menor que a do policlonal, pois às vezes na conformação da proteína o epitopo não está exposto e o anticorpo não dá resultado. 
Anticorpo policlonal: Exemplo: Isola a desmina (do músculo de galinha), injeta no coelho. Ele gera os anticorpos 1, 2 3 e 4 na corrente sanguínea. São gerados vários anticorpos contra a desmina, porque ela não é igual a que o próprio coelho tem. Vários clones misturados. Podem ter marcações inespecíficas. 
Observações importantes:
ATPases:
Tem cabeça, cauda, e uma parte chamada de pescoço. Todas as proteínas motoras têm essas três regiões. A região do pescoço faz com que a enzima consiga se mexer durante o movimento, quando tem uma mutação nessa região essas proteínas não funcionam normalmente e isso esta ligado a uma série de patologias do sistema nervoso. 
Domínio estrutural e/ou funcional de proteínas:
A proteína é feita de aminoácidos, e esses aminoácidos não estão ligados um no outro de maneira aleatória, juntos eles ligam a proteína a alguma coisa. Logo são regiões da proteína reconhecidas, por exemplo: a ligação da miosina à actina, a miosina tem uma região de ligação (domínio)ATP na cabeça (só o ATP sendo quebrado que o pescoço vai se mover).