Tecnologia do DNA Recombinante na Biotecnologia

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Curso de 
BIOTECNOLOGIA 
 
 
 
 
MÓDULO II 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Atenção: O material deste módulo está disponível apenas como parâmetro de estudos para 
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mesmo. Os créditos do conteúdo aqui contido são dados aos seus respectivos autores 
descritos na bibliografia consultada. 
 
 
 
 
 
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MÓDULO II 
 
A TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE 
 
As descobertas da estrutura e da função do DNA e da síntese protéica 
foram os primeiros passos para o isolamento e, conseqüentemente, uma 
análise mais detalhada dos genes. Alguns motivos justificam este interesse: 
I. O isolamento de um gene permite a determinação da seqüência 
nucleotídica, caracterizando marcos interno do mesmo, como introns e 
peptídeos sinais. Esta seqüência pode ainda ser utilizada na genômica 
comparativa, que consiste em comparações de seqüências entre organismos 
filogeneticamente próximos. Assim, além de possibilitar estudos de evolução, 
pode auxiliar também na descoberta da função do gene isolado; 
II. A composição de aminoácidos, assim como a de nucleotídeos, 
também auxilia na história da genômica comparativa, deduzindo-se a função de 
uma determinada proteína; 
III. Um gene pode ser transferido de um organismo a outro, 
possibilitando o desenvolvimento de organismos transgênicos. Estes possuem 
diversas utilizações na biotecnologia, seja na pesquisa básica ou mesmo em 
aplicações comerciais especializadas. Um exemplo é a produção de insulina a 
partir de bactérias transgênicas que contém e expressam o gene humano que 
codifica esta proteína. 
As aplicações a que o isolamento e caracterização de um gene 
permitem são inúmeras, incluindo a produção de medicamentos e de vacinas, 
por exemplo. Portanto, o isolamento gênico se tornou indispensável para a 
geração de novos bens e serviços biotecnológicos. Este módulo trata das 
metodologias envolvidas com este processo, a tecnologia do DNA 
recombinante. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3. TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE 
 
O aprofundamento em conhecimentos de genética abriu a imaginação 
dos pesquisadores e esta ciência se tornou uma das ferramentas mais 
importantes para o desenvolvimento de técnicas biotecnológicas. Aliado a isto, 
o conhecimento multidisciplinar de áreas como a biologia molecular e 
bioquímica permitiu que a biotecnologia avançasse a aplicações industriais. A 
metodologia envolvida neste processo abarca diversas técnicas que englobam 
a manipulação do DNA visando à produção de bens de interesse comercial. 
Esta tecnologia do DNA recombinante, também conhecida como clonagem 
gênica ou clonagem molecular, compreende processos de transferência da 
informação genética (DNA) de um organismo a outro. Apesar de não haver 
uma metodologia universal, os experimentos seguem um protocolo similar (Fig. 
26): 
I. O primeiro passo consiste em caracterizar um gene de interesse. 
Tendo-se um conhecimento prévio do mesmo, o segundo passo consiste em 
isolar o DNA do organismo que o contém; este é denominado organismo 
doador; 
II. O DNA de um organismo doador é extraído e sofre uma clivagem 
ou digestão enzimática. Em seguida, os fragmentos gerados na digestão são 
ligados a outra molécula de DNA que deve ter uma replicação autônoma, tais 
como os plasmídeos bacterianos. Esta molécula atua como portadora dos 
fragmentos de DNA e é denominada vetor de clonagem. Assim, há a 
formação de um DNA híbrido, ou uma molécula de DNA recombinante. Este é 
também designado como DNA quimérico, uma analogia ao monstro grego 
mitológico Quimera; 
III. O passo seguinte à obtenção da molécula de DNA que codifica 
uma proteína de interesse é permitir a perpetuação do vetor recombinante até 
a produção do bem de escolha. Para isso, há a necessidade de selecionar 
uma célula hospedeira apropriada a qual será introduzido o vetor 
 
 
 
 
 
recombinante. A introdução do material genético na célula hospedeira ocorre 
por um processo denominado transformação; 
IV. As células hospedeiras são então plaqueadas e deixadas crescer 
em colônias separadas. Uma célula individual transformada com um único 
vetor recombinante irá se dividir em uma colônia com milhões de células, 
todas portando o mesmo vetor recombinante. Portanto, esta célula individual 
é capaz de se multiplicar e gerar uma população que contém cópias idênticas 
do DNA híbrido; esta população é designada clone de DNA. Neste caso, diz-
se que o hospedeiro amplificou a molécula recombinante de interesse; 
V. Como o DNA foi digerido em muitos fragmentos que podem 
conter insertos de DNA diferentes, é necessário selecionar o clone bacteriano 
que contenha o material genético desejado; 
VI. Uma vez obtido o clone de interesse, o passo final consiste em 
submetê-lo a uma série de análises que permitam verificar se construção 
recombinante em um determinado hospedeiro é capaz de expressar, tanto 
quantitativamente quanto qualitativamente, a proteína de interesse. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Transformação da célula hospedeira
Expressão da proteína de interesse
Fonte de DNA
DNA alvo
Digestão enzimática
Digestão enzimática
Ligação entre vetor e inserto
Vetor
Transformação da célula hospedeira
Expressão da proteína de interesse
Fonte de DNA
DNA alvo
Digestão enzimática
Digestão enzimática
Ligação entre vetor e inserto
Vetor
 
Figura 26: Metodologia geral utilizada pela tecnologia do DNA recombinante. 
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O DNA do organismo doador e o do vetor são digeridos com enzimas 
de restrição. O fragmento de interesse e o vetor linearizado são ligados e 
transformados em uma célula hospedeira apropriada. Esta permite a expressão 
da proteína de interesse (representada pelas três bolinhas vermelhas). 
A geração de moléculas recombinantes pela clonagem molecular deve 
ser diferenciada daquelas obtidas por processos de “crossing-over” que ocorre 
entre cromossomos homólogos de eucariotos. A tecnologia do DNA 
recombinante consiste em procedimentos de manipulação experimental que 
permitem que DNA de fontes diferentes ou heterólogas seja inserido em um 
hospedeiro capaz de perpetuar o material genético de interesse, produzindo-o 
de maneira apropriada. 
 
3.1. ISOLAMENTO DE GENES 
 
3.1.1. EXTRAÇÃO DE DNA 
 
Como comentado anteriormente, o passo inicial no isolamento de um 
gene consiste em extrair o DNA do organismo doador. Diferentes tipos de 
protocolos estão disponíveis e permitem que a extração obtenha um material 
em grande quantidade e com alto grau de pureza. Após identificar quais genes 
se deseja estudar, procede-se ao isolamento do DNA genômico de eucariotos 
ou de procariotos. Para o vetor, o procedimento a ser adotado é dependente da 
natureza do mesmo. No caso de DNA plasmidial, este pode ser purificado do 
DNA genômicoapós a ultracentrifugação em um gradiente de densidade do 
cloreto de césio contendo brometo de etídeo. Este material, além de ser um 
agente intercalante de DNA, que permite que o mesmo seja visualizado após 
sua exposição à luz ultravioleta. Permite que o DNA plasmidial se torne mais 
denso que o genômico e com isso, os plasmídeos formam uma banda distinta 
na centrifugação e podem ser separados (Fig. 27). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DNA 
cromossômico
plasmídeo
21 3
4
DNA 
cromossômico
plasmídeo
21 3
4
 
 
Figura 27: Isolamento de DNA plasmidial por ultracentrifugação em cloreto de césio. 
 
Inicialmente, um clone é selecionado e certificado se contém o material 
de interesse, o que geralmente se faz por seleção a antibióticos. (1) O DNA é 
então, extraído e colocado em um gradiente de cloreto de césio e brometo de 
etídeo; (2) esta mistura é submetida a uma ultracentrifugação neste gradiente. 
Devido à ligação diferencial do brometo de etídeo nestas duas espécies de 
DNA, o DNA plasmidial se torna mais denso que o cromossômico. Assim, duas 
bandas distintas entre as duas espécies de DNA são formadas. Após um furo 
na porção de baixo do tubo, pode-se separar o (3) DNA cromossomal e (4) 
DNA plasmidial. 
O DNA plasmidial ainda pode ser extraído por uma técnica 
rotineiramente utilizada em laboratórios de biotecnologia, a lise alcalina. Este 
método se baseia na observação de que sob um determinado pH alcalino, o 
DNA genômico bacteriano se desnatura, o que não ocorre com os plasmídeos. 
Este material desnaturado é então submetido a uma neutralização que 
precipita o DNA genômico, mas os plasmídeos permanecem em solução. 
Procedimentos semelhantes ao utilizado no isolamento de plasmídeos 
são utilizados para outros vetores, como cosmídeos. No caso de fagos, 
recupera-se uma suspensão pura dos mesmos e o DNA é obtido após a lise 
das partículas virais. 
Após a extração e purificação do DNA genômico e do vetor, o 
fragmento de DNA contendo o gene de interesse precisa ser isolado e ligado a 
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um vetor de clonagem, proporcionando a perpetuação do DNA híbrido. O 
primeiro impasse a este procedimento é o isolamento do fragmento. 
Inicialmente, o DNA cromossômico era submetido a um processo de quebras 
mecânicas aleatórias, o que pode ser obtido por sucessivas passagens do 
material por uma seringa ou mesmo por sonicação. Contudo, este 
procedimento gera desde fragmentos grandes, como 5 Kb, até mesmo 
fragmentos muito pequenos. Aliado a isto, esta fragmentação é aleatória, o que 
aumenta a probabilidade de a seqüência de interesse seja fragmentada e 
somente porções desta sejam clonadas. Assim, para o isolamento de uma 
determinada seqüência, vários clones devem ser analisados. 
A fragmentação aleatória de seqüências de DNA ainda interfere na 
eficiência da clonagem. As extremidades geradas não são complementares, o 
que dificulta a ligação do inserto ao seu vetor de clonagem. A eficiência da 
clonagem ainda é afetada pelo tamanho dos fragmentos. Fragmentos menores, 
de baixo peso molecular, são mais fáceis de ligá-los ao vetor. Contudo, eles 
são facilmente perdidos ou não recuperados. Por outro lado, a clonagem de 
fragmentos de alto peso molecular é um procedimento mais complicado e de 
baixa eficiência. 
Uma grande conquista que permitiu o grande salto da tecnologia do 
DNA recombinante foi à descoberta de enzimas que clivam o DNA após o 
reconhecimento de seqüências específicas. As enzimas responsáveis por esta 
digestão enzimática são as enzimas de restrição. 
 
3.1.2. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 
 
As enzimas de restrição são endonucleases responsáveis pela quebra 
enzimática da ligação fosfodiéster do DNA. O termo “restrição” foi adotado 
devido à história da descoberta destas enzimas. Durante o estudo da infecção 
de E. coli por bacteriófagos, observou-se que somente algumas bactérias eram 
infectadas por estes vírus e, por isso, os pesquisadores relatavam que a 
infecção ficava “restrita”. Estudos posteriores demonstraram que após a 
 
 
 
 
 
penetração do DNA do fago na bactéria, certas enzimas de E. coli eram 
capazes de reconhecê-lo e clivá-lo. Estas enzimas foram denominadas 
genericamente como enzimas de restrição. 
A nomenclatura das enzimas de restrição é feita pelas iniciais do 
organismo a partir do qual ela foi isolada, incluindo a identificação da linhagem, 
e por algarismos romanos que indicam a ordem na qual foi encontrada na 
cepa. Assim, por exemplo, a EcoRI, uma enzima extremamente utilizada em 
procedimentos de biologia molecular, significa que esta foi a primeira enzima 
isolada de Escherichia coli, linhagem R. A primeira letra em maiúsculo 
representa o gênero e as primeiras duas letras da espécie são escritas em 
minúsculo. Os números em algarismos romanos são utilizados para designar a 
ordem de caracterização de diferentes enzimas de restrição isoladas do 
mesmo organismo. Muitas enzimas de restrição já foram isoladas e seus sítios 
de restrição identificados (Tabela 1). 
 
Enzima Sítio de 
restrição 
Tipo de 
extremidade 
EcoRI G A-A-T-T-C
C-T-T-A-A G
Extensão 5´ fosfato 
BamHI G G-A-T-C-
C 
C-C-T-A-G 
G 
Extensão 5´ fosfato 
PstI C-T-G-C-A 
G 
G A-C-G-T-
C 
Extensão 3´ fosfato 
PvuII C-A-G C-T-
G 
G-T-C G-A-
C 
Extremidade cega 
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HpaI G-T-T A-A-C
C-A-A T-T-G
Extremidade cega 
HaeIII G-G C-C 
C-C G-G 
Extremidade cega 
NotI G C-G-G-C-
C-G-C 
C-G-C-C-G-
G-C G 
Extensão 5´ fosfato 
 
Tabela 1: Sítios de restrição reconhecidos por diferentes enzimas de restrição e o tipo 
de extremidade que elas geram. (Tabela modificada de Glick & Paternak, 1994). 
 
As enzimas de restrição são endonucleases que reconhecem regiões 
específicas de DNA de 4 a 8 pb, chamados sítios de restrição. Qualquer 
molécula de DNA, desde vírus até o de humanos, contém sítios alvos de 
enzimas de restrição, que se encontram distribuídos ao acaso. Assim, com a 
digestão enzimática do DNA obtidos de diversas fontes, os fragmentos gerados 
apresentam um tamanho definido e adequado para os procedimentos de 
clonagem. A clivagem enzimática ocorre entre o oxigênio do carbono 3´ do 
açúcar de um nucleotídeo e ao grupo fosfato do carbono 5´ do carbono do 
açúcar adjacente. 
As enzimas de restrição são classificadas em três tipos: I, II e III. Todas 
estas enzimas reconhecem sítios de restrição específicos. Contudo, as 
enzimas I e III clivam fora desta seqüência. Por sua vez, as do tipo II clivam 
dentro do sítio reconhecido por elas. Portanto, as enzimas de restrição do tipo 
II são mais úteis em procedimentos que envolvem engenharia genética, pois 
seu padrão de clivagem é previsível quando a seqüência de DNA é conhecida. 
O sítio de restrição das enzimas do tipo II possui um duplo eixo de 
simetria rotacional, tendo a mesma seqüência quando lida no sentido 5' para 3' 
em ambas as fitas. Em outras palavras, ambos os filamentos de DNA 
reconhecidos pelas enzimas de restrição têm a mesma seqüência de 
nucleotídeos, porém em orientação antiparalela. Seqüências que possuem 
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estas características são denominadas palindrômicas. 
As aplicações das enzimas de restrição do tipo II para a tecnologia do 
DNA recombinante são inúmeras. Uma delas é a construção de mapas físicos. 
Como a amostra de DNA tratada com uma destas enzimas sempre apresentará 
sítios de restrição reconhecidos na digestão enzimática, estas enzimas 
permitem a construção de mapas que representam o conjunto de restrição 
reconhecido por enzimas diferentes dentro da mesma seqüência. Estes 
designam uma ordem linear de sítios de restrição referente a um fragmento de 
DNA específico. Este mapa é obtido após a clivagem unicamente com uma 
determinada enzima e depois com uma combinação delas. A posição dos sítios 
de clivagem é deduzida após a análise do peso molecular destes fragmentos 
em gel de agarose (Fig. 28). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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850
600
100
500
300
600
300
250
100
950
400
Digestão 
EcoRI
Digestão 
BamHI
Digestão 
EcoRI + BamHI
A
850
600
100
500
300
600
300
250
100
950
400
Digestão 
EcoRI
Digestão 
BamHI
Digestão 
EcoRI + BamHI
A
500
400100
300
600
950100
300 250
600
850
EcoRI EcoRI
BamHI BamHI
B
500
400100
300
600
950100
300 250
600
850500
400100
300
600
950100
300 250
600
850
EcoRI EcoRI
BamHI BamHI
B
 
 Figura 28: Mapa de restrição. 
(A) análise eletroforética representando o peso molecular da amostra 
de DNA obtida após a digestão enzimática com as enzimas EcoRI e BamHI 
 
 
 
 
 
separadamente e com as duas enzimas juntas. (B) mapa de restrição gerado 
após a digestão enzimática e separação por eletroforese. (Figura modificada 
de Glick & Paternak, 1994). 
Outras aplicações das enzimas de restrição do tipo II são decorrentes 
da característica que a clivagem gera nas extremidades. A posição em que 
ocorre a clivagem do DNA pode gerar dois tipos de extremidades: abruptas (ou 
cegas), quando a clivagem ocorre no centro de simetria, ou coesivas (pontas 
adesivas), quando a clivagem ocorre fora do centro de simetria (Fig. 29). Neste 
último caso, pode-se gerar uma extremidade saliente 5'ou 3' (Tabela 1). 
 
 
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CCGGGA TCCTAAG
GGCCCT AGGATTC
GGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
Figura 29: Extremidades cegas e coesivas geradas após a digestão com enzimas de 
restrição. 
 
Enzimas de restrição que clivem o DNA gerando desde extremidades 
cegas ou mesmo coesivas podem ser utilizas com sucesso na clonagem 
molecular. Contudo, a ligação do inserto ao seu vetor é facilitada quando 
ambos sofrem uma digestão enzimática que gerem par de pontas adesivas 
unifilamentares idênticas. Estas pontas são chamadas de adesivas porque 
permitem que haja um pareamento com seqüências complementares que 
serão unidas (“grudadas”) por pontes de hidrogênio. 
CCG
CCGG GATCCTAAG
GGCCCTAG GATTC
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
Digestão com 
enzima de 
restrição
Digestão com 
enzima de 
restrição
Extremidades coesivas Extremidades cegas
CCGGGA TCCTAAG
GGCCCT AGGATTC
GGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
CCGCCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
CCGG GATCCTAAG
GGCCCTAG GATTC
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
Digestão com 
enzima de 
restrição
Digestão com 
enzima de 
restrição
Extremidades coesivas Extremidades cegas 
 
 
 
 
 
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As enzimas de restrição que geram fragmentos de extremidades 
coesivas são extremamente interessantes quando se deseja a inserção de uma 
seqüência codificadora em específico. Isto se deve ao fato de que somente 
filamentos complementares sejam capazes de se ligar. Assim, uma digestão 
dupla com duas enzimas diferentes permite que a clonagem seja direcional; ou 
seja, que a seqüência codificadora se ligue a um sítio de distância ideal ao seu 
promotor e na correta fase de leitura para a proteína. 
Analisando a ação das enzimas de restrição, pode-se afirmar que as 
mesmas têm pelo menos duas propriedades úteis à clonagem molecular: 
primeiramente, os fragmentos de restrição apresentam um peso molecular 
adequado para a clonagem. Segundo muitas enzimas de restrição clivam o 
DNA de forma a gerar extremidades coesivas, facilitando a ligação de fontes 
diferentes de DNA que possuam extremidades complementares. Esta ligação 
ainda ocorre de forma que a seqüência codificadora ocorra de maneira 
direcional, ou seja, na fase correta de leitura. 
O uso unicamente de enzimas de restrição, entretanto, é insuficiente 
para finalizar o procedimento de clonagem molecular. As extremidades geradas 
pela clivagem enzimática podem se alinhar, mas a força das pontes de 
hidrogênio envolvidas na complementaridade de bases não é suficiente para 
manter as moléculas de DNA referentes ao inserto e ao vetor juntas. Há a 
necessidade de refazer a ligação internucleotídica entre o grupo hidroxila 3' e o 
grupo fosfato 5' das extremidades onde a quebra das moléculas de DNA foi 
gerada. A análise da replicação do DNA forneceu uma alternativa enzimática. 
Este problema é resolvido após o passo da ligação enzimática. 
 
3.1.3. LIGAÇÃO ENZIMÁTICA 
 
Recapitulando, o DNA de um organismo doador sofre uma digestão 
enzimática a fim de produzir fragmentos com peso molecular adequados para a 
clonagem molecular. Para que este procedimento seja facilitado, rotineiramente 
se adota como estratégia a digestão, tanto do inserto como do vetor, com a 
 
 
 
 
 
mesma enzima de restrição. De preferência, se utiliza enzimas que produzam 
sítios de restrição com extremidades coesivas para facilitar a ligação. Embora 
os filamentos complementares permitam que as moléculas se liguem por 
complementaridade de bases, as seqüências açúcar fosfato ainda não estão 
completas nas duas posições de cada junção (Fig. 30). Para selar esta ligação, 
são utilizadas enzimas como a ligase. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 Figura 30: Ligação entre extremidades coesivas pela ação da Ligase. 
 
Após a digestão enzimática, são geradas extremidades coesivas. 
 
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
Digestão com 
enzima de 
restrição
CCGG GATCCTAAG
GGCCCTAG GATTC
OH
P
P
OH
Anelamento
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
OH P
P OH
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
Ligação
Ligase T4
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
Digestão com 
enzima de 
restrição
CCGG GATCCTAAG
GGCCCTAG GATTC
OH
P
P
OH
Anelamento
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
OH P
P OH
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
Digestão com 
enzima de 
restriçãoCCGG GATCCTAAG
GGCCCTAG GATTC
OH
P
P
OH
CCGG GATCCTAAG
GGCCCTAG GATTC
OH
P
P
OH
Anelamento
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
OH P
P OH
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
Ligação
Ligase T4
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
Ligação
Ligase T4
 
 
 
 
 
 
 
 
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Moléculas digeridas com a mesma enzima irão se unir pela 
complementaridade de bases. A especificidade entre o pareamento de bases 
permite a formação de pontes de hidrogênio. Contudo, a união entre moléculas 
de DNA é finalizada pela formação de uma ligação fosfodiéster entre as duas 
fitas de DNA por ação da enzima ligase. 
As ligases são capazes de catalisar a formação de pontes fosfodiéster 
ao final das fitas de DNA que estejam mantidas juntas pela complementaridade 
de bases ou mesmo quando as extremidades cegas estejam em contato ao se 
ligarem à enzima. A enzima responsável por este processo é a DNA ligase e 
em procedimentos biotecnológicos freqüentemente se utiliza a isolada do 
bacteriófago T4. 
Conhecendo as técnicas e os procedimentos genéricos para a 
tecnologia do DNA recombinante, os próximos tópicos tratarão de 
procedimentos mais específicos, como os procedimentos para o isolamento de 
genes específicos. Contudo, inicialmente é preciso ter claro a diferença de 
estrutura entre um gene eucarioto e um procarioto. 
 
3.1.4. DIFERENÇA ESTRUTURAL ENTRE GENES EUCARIOTOS E 
PROCARIOTOS 
 
Para a obtenção do inserto, inicialmente deve-se considerar se o gene 
de interesse pertence a um organismo procarioto ou a um eucarioto. Esta 
diferenciação deve-se às características estruturais dos genes destes dois 
organismos. Em procariotos, a seqüência codificadora de uma proteína 
freqüentemente representa uma minúscula parcela do DNA cromossomal 
(<0,02%). Os genes são seqüências de DNA contínuas e organizadas em um 
operon. Esta unidade transcricional permite que todos os genes relacionados a 
uma determinada função sejam transcritos em um único RNAm policistrônico. 
Por outro lado, o gene de eucariotos é formado pela seqüência codificadora, os 
exons, que são interrompidos por seqüências grandes e não codificadoras, os 
introns. Portanto, diferentes estratégias de clonagem devem ser adotadas para 
 
 
 
 
 
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o isolamento e clonagem de genes eucariotos e procariotos. 
 
3.1.5. OBTENÇÃO DO INSERTO 
 
3.1.5.1. CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS GENÔMICAS E DE 
BIBLIOTECAS DE cDNA 
 
A obtenção de um determinado gene depende dos objetivos da 
clonagem, das características do gene e, enfim, do conhecimento prévio que se 
tem a respeito do mesmo. Se não há um conhecimento prévio da seqüência, 
uma das alternativas para o isolamento do inserto consiste em subdividir o 
DNA cromossomal em pequenos fragmentos que serão então clonados em 
vetores. Em seguida, os vetores recombinantes são transformados em um 
hospedeiro e então analisados e caracterizados. Teoricamente, este 
procedimento é capaz de obter clones que representem todo o DNA genômico 
do organismo a ser estudado. Este é o princípio da criação de uma biblioteca 
genômica ou banco gênico, elemento básico do processo inicial do 
seqüenciamento de genomas. 
Uma das maneiras de criar uma biblioteca genômica é tratando o DNA 
com uma endonuclease de restrição cujo sítio de restrição reconheça quatro 
pares de bases. Assim, teoricamente o DNA será clivado aproximadamente a 
cada 256 pb. Entretanto, como as enzimas de restrição reconhecem sítios 
específicos, pode ocorrer que os fragmentos gerados sejam muito grandes, o 
que dificulta a clonagem. Se nem todos os fragmentos referentes ao genoma 
total são clonados, então a biblioteca disponível para a seleção está incompleta 
e assim, o fragmento de interesse pode estar interrompido ou mesmo ausente, 
dificultando a seleção de um determinado gene. Para solucionar este problema, 
o DNA cromossomal é então submetido a uma digestão parcial. Assim, geram-
se fragmentos de diferentes tamanhos, permitindo que todos os fragmentos 
estejam representados após a clonagem em um determinado vetor (Fig. 31). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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b c d
a b c d
c d
d
a
a + b
a
a + b
a d
a b
a + b + c
b + c + d
c + d
c + d
b + c
Digestão parcial
Sítio de 
restrição
Sítio de 
restrição
Sítio de 
restrição
bb c dd
a b c da b c d
cc dd
dd
aa
a + ba + b
aa
a + ba + b
aa dd
aa bb
a + b + c
b + c + d
c + d
c + d
b + c
Digestão parcial
Sítio de 
restrição
Sítio de 
restrição
Sítio de 
restrição
Figura 31: Digestão parcial 
de uma amostra de DNA 
com enzimas de restrição. 
 
A digestão parcial é realizada por variações no tempo ou na quantidade 
de enzima utilizada. O resultado é a geração de fragmentos de vários 
tamanhos, o que permite que todos sejam clonados e que a biblioteca 
genômica seja representativa. (Figura modificada de Glick & Paternak, 1994). 
Além da biblioteca genômica, há a possibilidade de desenvolver uma 
biblioteca de DNA complementar ou cDNA. O cDNA é um DNA sintético que 
tem como molde moléculas de RNAm total de uma célula. Para este 
procedimento, utiliza-se uma enzima especial chamada transcriptase reversa 
que irá fazer uma fita de DNA a partir de um molde de RNA. Essa enzima foi 
originalmente isolada de membros da família Retrovidea, como o vírus da 
imunodeficiência humana (HIV). 
A geração de cDNA inicialmente se baseia em uma característica 
estrutural do RNAm, a cauda poliA. Esta característica é usada para separar a 
fração composta por RNAm de outros componentes, inclusive de outros tipos 
de RNA, como RNAr e RNAt. Isto é possível, pois somente o RNAm possui a 
cauda de poliA em sua estrutura. Para a sua purificação, o material derivado da 
extração de RNA é passado por uma coluna seletiva, a qual está ligada 
 
 
 
 
 
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pequenas cadeias curtas de resíduos de timina de aproximadamente 15 
nucleotídeos. Então, o RNAm se liga à coluna devido ao pareamento de bases 
entra a cauda poliA e os resíduos de timina. Por outro lado, os RNAt e os RNAr 
passam com o fluxo e não são retidos na coluna, pois não há um pareamento 
de bases que permita a ligação. Finalmente, o RNAm é eluído da coluna após 
um tratamento com um tampão capaz de interromper as pontes de hidrogênio 
formadas entre adenina e timina, liberando a molécula de RNAm. 
Antes que as moléculas de RNAm possam ser clonadas em um 
determinado vetor, elas precisam ser convertidas em uma molécula de DNA 
dupla fita. O sucesso deste experimento depende da ação sucessiva de duas 
enzimas diferentes: a transcriptase reversa e do fragmento de Klenow da 
DNAP I. Inicialmente, são adicionadas pequenas moléculas de 
oligonucleotídeos compostos somente por timinas ao material de RNAm eluído 
da coluna seletiva. Adicionalmente, é adicionada a enzimatranscriptase 
reversa e os quatro desoxirribonucleotídeos (dATP, dTTP, dGTP e dCTP). 
Neste procedimento, os pequenos oligonucleotídeos de timina se pareiam a 
região da cauda poliA, providenciando uma extremidade 3´ hidroxila para que a 
síntese de uma fita de DNA complementar seja iniciada. 
A transcriptase reversa utiliza como molde uma fita simples de RNA 
para polimerizar uma cadeia de DNA. Assim, os oligonucleotídeos referentes à 
composição estrutural do DNA vão sendo incorporados à cadeia que está 
sendo polimerizada pela transcriptase reversa, baseando-se na 
complementaridade de bases. Entretanto, a síntese in vitro realizada por esta 
enzima é freqüentemente um procedimento incompleto e somente uma fita 
simples de DNA é produzida. Contudo, antes que a síntese desta fita simples 
de DNA seja finalizada, há a formação de um “looping”, ou uma volta, na 
porção 5´, onde a fita de DNA se dobra sobre si mesma. Esta seqüência pode 
então ser utilizada como um “primer” para a polimerização da fita dupla de 
DNA. 
A segunda fita de DNA é sintetizada após a adição do fragmento de 
Klenow. Esta enzima adiciona nucleotídeos complementares aos especificados 
 
 
 
 
 
pela fita simples sintetizada pela transcriptase reversa, concluindo então a 
cadeia dupla de DNA. Para isto, o fragmento utiliza como iniciador a volta 
formada pela dobra na porção 5´do cDNA. 
Para finalizar o processo de geração de uma fita dupla de DNA a partir 
de RNAm, a amostra é tratada com a enzima RNase H que tem por finalidade 
degradar moléculas de RNAm molde. Finalmente, a volta de DNA formado na 
extremidade 5´ do cDNA é desfeito pela ação da nuclease S1, que tem como 
princípio geral degradar extensões de DNA fita simples. Ao final de todo o 
procedimento, tem-se uma amostra que apresenta uma mistura composta de 
cDNA de dupla fita correspondente aos RNAm que sejam os mais 
representativos na amostra inicial. Este material será clonado em um vetor 
apropriado. Um esquema geral do procedimento envolvido na geração de 
cDNA está descrito na Fig. 32. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Figura 32: Síntese de cDNA. 
RNAm
Oligo (dT)
Transcriptase reversa e 
polimerização de cDNA
Fragmento de 
Klenow
RNAm
cDNA
cDNA
DNA dupla fita
RNase H 
Degrada fita de RNA
Nuclease S1
RNAm
Oligo (dT)
Transcriptase reversa e 
polimerização de cDNA
Fragmento de 
Klenow
RNAm
cDNA
cDNA
DNA dupla fita
RNase H 
Degrada fita de RNA
Nuclease S1
 
 
Um iniciador composto de nucleotídeos de timina é adicionado à 
amostra contendo os RNAm purificados. A transcriptase reversa e os quatro 
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nucleotídeos constituintes da molécula de DNA são adicionados ao RNAm. A 
fita simples de DNA complementar ao RNAm – cDNA – é polimerizada, sendo 
que na porção 3´ do cDNA há a formação de uma volta sobre esta molécula fita 
simples de DNA, que servirá como iniciador para a fita complementar ao cDNA 
para a de DNA fita dupla. O “looping” que serviu de iniciador é rompido pela 
ação da nuclease S1. As fitas de RNAm são degradadas pela ação da 
RNaseH. 
A escolha entre as abordagens de construção de uma biblioteca 
genômica ou de uma biblioteca de cDNA depende do experimento em questão 
e das perguntas que se deseja responder. Se a pesquisa tem por finalidade o 
seqüenciamento de um genoma, a biblioteca necessita obter clones que 
representem todo o material genético daquele organismo. Somente assim a 
seqüência pode ser finalizada e anotada. A procura de um determinado gene 
em específico e a análise de como ele se encontra estruturado no genoma, 
como em um operon, além a análises de seqüências reguladoras, requerem 
que uma determinada seqüência grande esteja contida em um determinado 
clone. Nestes casos, a melhor opção se faz pela construção de uma biblioteca 
genômica. 
Há casos em que a intenção de realizar um experimento é a análise de 
um determinado produto protéico. Um exemplo é a análise de expressão de um 
gene específico e peculiar a um determinado tipo de tecido ou mesmo que se 
suspeita estar envolvido com o desenvolvimento de uma determinada 
patologia. O conhecimento de qual tecido o gene está sendo expresso facilita a 
seleção deste gene de interesse, já que o mesmo deve estar enriquecido de 
seus transcritos. Portanto, este tecido é utilizado como fonte de extração de 
RNAm. 
Outro aspecto é se a finalidade em isolar um gene é para que o mesmo 
seja expresso em um hospedeiro diferente para fins comercias. Nestes casos, 
a biblioteca de cDNA é uma opção. Isto é vantajoso principalmente quando se 
deseja expressar genes de eucariotos em células bacterianas. Como o cDNA é 
uma cópia complementar ao RNAm maduro, que já sofreu processamentos, 
 
 
 
 
 
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então este cDNA não irá conter introns em sua seqüência. Como as células 
bacterianas não são capazes de remover os introns e unir somente os exons, a 
biblioteca de cDNA é mais útil nestes casos. Contudo, deve-se lembrar que o 
cDNA não apresenta as regiões reguladoras que constituem um gene. Assim, 
neste último caso, a biblioteca genômica é mais útil. 
Em casos em que um determinado gene a ser estudado quanto a sua 
estrutura e composição, o que não é possível simplesmente pela análise de 
cDNA, pode-se restringir a fração genômica usada na construção da biblioteca 
genômica. Levando em consideração que determinados genomas são 
extremamente grandes e até mesmo composto por um conjunto de 
cromossomos, a restrição se faz possível se o pesquisador conhecer 
previamente em qual cromossomo o gene está localizado. 
Uma das técnicas utilizadas com este processo baseia-se na seleção 
de cromossomos com o uso de um instrumento denominado citômetro de fluxo. 
Uma suspensão de cromossomos é separada por este aparelho de acordo com 
o peso molecular e a fração contendo o gene de interesse é utilizada na 
construção da biblioteca genômica. 
Outra técnica possível é fracionar cromossomos inteiros pela técnica 
de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). A eletroforese é uma técnica 
que separa fragmentos de ácido nucléico ou proteínas em géis de acordo com 
o tamanho quando expostos a um campo elétrico. A PFGE ou “pulse field” é 
uma eletroforese mais especializada que permite a separação de moléculas 
muito longas de DNA. 
A técnica consiste em imprimir vários campos elétricos oscilantes 
orientados em várias direções diferentes. Esta estratégia permite até mesmo 
que determinadas moléculas cromossomais inteiras passem no gel para 
posições diferentes de acordo com o tamanho de cada uma (Fig. 33). O 
cromossomo desejado é então separado do gel, eluído e finalmente utilizado 
na construção da biblioteca genômica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Aparelho de PFGE
Resolução dos fragmentos de DNA
Visualização em gel de agarose corado com brometo de etídeo
Aparelho de PFGE
Resolução dos fragmentos de DNA
Visualização em gel deagarose corado com brometo de etídeo
Figura 33: Metodologia do PGFE. 
 
 
O gel de agarose com as amostras de DNA são corridas em um 
aparelho hexagonal que permite que o campo elétrico seja alternado a 120° a 
cada 90 segundos por 18 a 24 horas a 14°C. As moléculas de DNA migram 
paralelamente ao campo elétrico. Os fragmentos de peso molecular maior 
levam mais tempo para migrarem no gel em relação às de peso molecular 
menor. Isto permite que bandas distintas sejam visualizadas em um gel de 
agarose. S1, S2 e S3 são amostras diferentes; Mkr: marcador de peso 
molecular. 
A construção de bibliotecas é utilizada quando não há um 
conhecimento prévio a respeito da seqüência de nucleotídeos que constituem 
um gene. Em casos de organismos em que o genoma já foi seqüenciado, o 
isolamento de seqüências específicas é extremamente facilitado, sendo que a 
 
 
 
 
 
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produção pode ser sintética ou mesmo por técnicas de biologia molecular, 
como o PCR. 
 
3.1.5.2. PRODUÇÃO SINTÉTICA DE GENES 
 
A produção química de um gene ou mesmo de seus fragmentos ocorre 
pela síntese de cada fita complementar separadamente. Fragmentos curtos, 
entre 60 a 80 pb, podem ser produzidos por fitas complementares 
separadamente que depois são aneladas entre si. Contudo, para a produção 
de fragmentos maiores, como acima de 300 pb, técnicas mais apuradas devem 
ser utilizadas. Isto se deve ao fato da eficiência de ciclos envolvidos durante a 
síntese química não apresentarem uma eficiência de 100%. 
Um dos métodos para a síntese de fragmentos maiores consiste na 
síntese inicial de oligonucleotídeos complementares e sobrepostos, compostos 
de 20 a 60 nucleotídeos. O planejamento para a síntese de cada fita ocorre de 
maneira que após o anelamento, os dois fragmentos de um gene sejam 
alinhados de forma que as extremidades de seus fragmentos se apresentem 
cegas, sem fitas complementares. Cada fita sintetizada apresenta seu 
segmento complementar e as extremidades 5´ e 3´ são também projetadas 
para que apresentem uma complementaridade, o que permite a montagem dos 
fragmentos de acordo com a seqüência do gene (Fig. 34). 
Após o anelamento entre os fragmentos, o último passo para concluir a 
síntese química de um gene é selar os fragmentos entre as extremidades 5´e 
3´ das fitas adjacentes. Isto é possível pela ação da T4 DNA ligase. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
P O H
1
P O H
2
P O H
3
P O H
4
P O H
5
P O H
6
O H 2
P
P
O H1 P 3 O H P 5 O H
O H
4
P O H
6
P
P
O H
O H
P
S ín tese d e fitas in d iv id u a is
A n elam en to 
L igação 
P O H
1
P O H
2
P O H
3
P O H
4
P O H
5
P O H
6
P O H
1
P O H
1
P O H
2
P O H
2
P O H
3
P O H
3
P O H
4
P O H
4
P O H
5
P O H
5
P O H
6
P O H
6
O H 2
P
P
O H1 P 3 O H P 5 O H
O H
4
P O H
6
P
O H 2
PP
P
O HO H1 P 3P 3 O HO H P 5P 5 O HO H
O H
4
PO H
4
PP O H
6
PO H
6
PP
P
O H
O H
P
P
O H
O H
P
S ín tese d e fitas in d iv id u a is
A n elam en to 
L igação 
Figura 34: Síntese de uma seqüência codificadora a partir do anelamento entre 
oligonucleotídeos. 
Estes são fabricados de forma que o anelamento entre as fitas 
complementares permita que uma fita dupla de DNA completa seja formada. 
Para selar a cadeia, as ligações fosfodiéster são ligadas por ação da enzima 
T4 ligase. (Figura modificada de Glick & Paternak, 1994). 
Uma modificação deste método foi criada como alternativa para a 
produção química de genes. Inicialmente, são sintetizados oligonucleotídeos 
complementares e sobrepostos por aproximadamente 40 a 100 nucleotídeos. 
Após o anelamento entre as fitas complementares, permanecem grandes 
regiões de seqüências que não anelaram a outra seqüência complementar, ou 
seja, compostas somente por fita simples (Fig. 35). Apesar disso, as fitas se 
mantém unidas, o que se deve à região de nucleotídeos sobrepostos. Estes 
buracos constituídos por fita simples são então completados pela ação de 
polimerização da DNAP I de E. coli. Após a finalização deste processo, as fitas 
são seladas pela ação da enzima T4 DNA ligase. 
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P OH
1
P OH
2
P OH
3
P OH
4
OH 2
P
P
OH1 P 3 OH
OH
4
P
P
OH
OH
P
Síntese de oligonucleotídeos
Anelamento 
Ligação 
P OH
1
P OH
1
P OH
2
P OH
2
P OH
3
P OH
3
P OH
4
P OH
4
OH 2
P
P
OH1 P 3 OH
OH
4
P
OH 2
PP
P
OH1
P
OHOH1 P 3P 3 OHOH
OH
4
POH
4
PP
P
OH
OH
P
P
OH
OH
P
Síntese de oligonucleotídeos
Anelamento 
Ligação 
 
 
 
Figura 35: Síntese in vitro de um gene a partir de oligonucleotídeos sintetizados quimicamente. 
 
As seqüências dos oligonucleotídeos são desenhadas de maneira que 
ao se anelarem à suas seqüências complementares, haja também fitas simples 
não pareadas (“gaps”). Para a formação de fita dupla por toda molécula de 
DNA, os “gaps” são preenchidos por meio de uma síntese enzimática pela 
DNAP I e, finalmente, a fita de DNA é selada pela ação da enzima T4 ligase. 
(Figura modificada de Glick & Paternak, 1994). 
Para fragmentos maiores que 1.000 pb, a seqüência gênica completa é 
freqüentemente feita a partir da união de fragmentos de fita dupla de 20 a 60 
pb, que se anelam entre si pela complementaridade entre quatro a seis 
nucleotídeos sobrepostos. Se há uma quantidade suficiente de fragmentos fita 
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dupla após a síntese e anelamento, eles são simplesmente ligados uns aos 
outros. Caso contrário cada fragmento deve ser clonado a um vetor para que a 
quantidade de DNA seja amplificada. Contudo, em ambos os casos as 
construções de fragmentos fita dupla de DNA são ligados de forma seqüencial, 
a fim de formar a seqüência completa de um determinado gene. 
Mesmo sendo a síntese química uma estratégia capaz de atingir seus 
objetivos com sucesso, como mencionado anteriormente ela não é 100% 
eficaz. Assim, o fragmento obtido por este procedimento deve ser 
necessariamente seqüenciado. Isto envolve gastos, que se somados ao alto 
custo do próprio procedimento de síntese química, pode se tornar inviável. 
Alternativas estão disponíveis, e que são capazes de realizar o mesmo 
procedimento quando se tem o prévio conhecimento a respeito da seqüência 
de um gene. Uma destas técnicas é a amplificação do DNA, através da reação 
em cadeia pela polimerase, o PCR. 
 
3.1.5.3. Reação em Cadeia pela Polimerase - PCR 
 
A reação em cadeia pela polimerase (PCR) é muito efetiva em gerar 
quantidades extraordinárias do DNA de interesse in vitro. É uma técnica 
extremamente sensível, sendo capaz de amplificar DNA a partir de picogramas 
da amostra. Alguns requerimentos são essenciais para a realização da técnica: 
I. Um par de oligonucleotídeos sintéticos, denominadosde 
oligonucleotídeos iniciadores (primers), deve ser desenhado de maneira 
complementar a seqüência de interesse. Estes iniciadores devem ser 
compostos por aproximadamente 20 pb e sua composição de nucleotídeos 
deve ser idealmente balanceada para que haja uma equivalência da proporção 
A + T e C + G. Um dos iniciadores deve ser desenhado de maneira 
complementar à fita molde e o outro, à codificadora. A seqüência dos dois 
iniciadores deve ser orientada de maneira oposta às fitas de DNA; 
II. A seqüência alvo a ser amplificada e que se encontra dentro da 
amplitude dos iniciadores deve ser composta de 100 a 5.000 nucleotídeos em 
 
 
 
 
 
85 
Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores. 
 
sua extensão. Entretanto, a biologia molecular moderna tem avançado 
enormemente, e muitos produtos novos têm sido aprimorados. Portanto, o 
tamanho do fragmento a ser amplificado deve ser condizente com a 
capacidade de polimerização de cada enzima polimerase específica a ser 
utilizada no processo; 
III. A enzima responsável pela a polimerização das cópias referente à 
seqüênciaespecífica, genericamente conhecida como Taq DNA polimerase, 
deve ser capaz de resistir a altas temperaturas, como 95°C ou mais; 
IV. Para que a reação de polimerização ocorra, devem ser 
adicionados à mistura contendo DNA, enzima e tampão, os quatros 
oligonucleotídeos (dNTPs, dATP, dTTP, dCTP, dGTP). 
 A metodologia adotada para a amplificação de fragmentos de 
DNA é muito similar ao processo de transcrição, sendo que uma das diferenças 
é que ao final da PCR são obtidas moléculas de DNA fita dupla ao invés de 
moléculas de RNA fita simples. A metodologia da PCR consiste em vários 
ciclos sucessivos, sendo que cada um têm pelo menos três passos básicos: 
I. Desnaturação: o primeiro passo consiste na desnaturação do DNA 
pelo aumento de temperatura, geralmente obtido a 95°C. Esta temperatura é 
mantida por aproximadamente um minuto; 
II. Anelamento: neste passo, realizado a aproximadamente 55ºC, o par 
de iniciadores se anela à seqüência complementar de DNA da amostra; 
III. Polimerização: este passo é realizado com uma temperatura média 
72ºC que é ótima para a função catalítica da Taq DNA polimerase. A síntese se 
inicia na porção hidroxila 3´ de cada iniciador. 
IV. A duração de cada um dos passos e a temperatura utilizada nos 
mesmos variam enormemente e, por isso, cada protocolo precisa ser 
padronizado para a sua utilização. A reação de amplificação ocorre em um 
aparelho automatizado e programável, o termociclador. 
Para entender como se sucede a amplificação dos fragmentos de DNA, 
deve-se ter em mente a localização de cada iniciador durante o anelamento. 
No primeiro ciclo, os iniciadores se ligam em direções opostas a cada uma das 
 
 
 
 
 
moléculas geradas pela desnaturação do DNA. Nos ciclos iniciais, a 
amplificação vai além da seqüência complementar ao outro iniciador (Fig. 36), 
gerando fitas mais longas. No segundo ciclo, isto também acontece; porém, há 
a amplificação de fragmentos mais curtos, que têm a seqüência de um iniciador 
na extremidade de uma fita e o outro, na outra extremidade da fita 
complementar. Em ciclos subseqüentes, os fragmentos de amplificação mais 
curtos vão se acumulando e, ao final de 30 ciclos, elas predominarão. 
 
 
 
 
 
 
86 
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Iniciador 1
 Figura 36: Reação de PCR. 
 
Durante os estágios iniciais de amplificação, são geradas fitas de DNA 
mais longas. Em ciclos subseqüentes, o material amplificado consistirá de uma 
fita de DNA composta pelos iniciadores em suas extremidades. Estes 
amplicons mais curtos predominarão ao final de 30 ciclos de amplificação. 
Uma das aplicações da PCR na tecnologia do DNA recombinante é o 
isolamento de um gene específico, que será produzido em grande quantidade e 
este pode ser clonado em um vetor apropriado. Para a clonagem, deve-se 
considerar que a Taq DNA polimerase têm uma atividade enzimática incomum, 
adicionando um nucleotídeo de adenina ao final 3´ de cada fita. Isto é ideal 
para a clonagem em vetores do tipo que apresentam um acréscimo de timina 
DNA fita 
dupla
desnaturação Anelamento Extensão 
Iniciador 2
Primeiro 
ciclo
Segundo 
ciclo
Terceiro 
ciclo
Iniciador 1 Iniciador 2
DNA fita 
dupla
desnaturação Anelamento Extensão 
Primeiro 
ciclo
Segundo 
ciclo
Terceiro 
ciclo
 
 
 
 
 
87 
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na porção 5´ de cada fita. Apesar de esta característica dificultar a clonagem de 
fragmentos que possuem extremidades cegas, este fato nem sempre é 
verdadeiro. Há diferentes tipos de Taq DNA polimerases especializadas em 
diferentes funções e nem todas possuem a característica de acrescentar 
adeninas à extremidade 3´ das fitas de DNA. 
A clonagem de insertos gerados por PCR é facilitada quando tanto o 
vetor como os insertos são digeridos com a mesma enzima de restrição, pois 
este procedimento gera extremidades coesivas que ainda permitem a 
clonagem direcional. Contudo, alguns insertos não possuem a seqüência a ser 
reconhecida pela enzima desejada e a digestão com a enzima de interesse 
ocorre de maneira que a seqüência codificadora seja clonada fora da fase de 
leitura. Este é um ponto crítico para procedimentos que têm por objetivo a 
expressão de proteínas. Para facilitar estes procedimentos, fragmentos de DNA 
adaptadores, contendo os fragmentos de restrição desejados, podem ser 
adicionados à seqüência dos insertos. 
 
3.1.5.3.1. ADAPATADORES 
 
Os adaptadores são pequenos fragmentos de nucleotídeos que contém 
a seqüência nucleotídica reconhecida por uma determinada enzima de 
restrição. Uma estratégia muito utilizada na construção destes adaptadores é 
inserir a seqüência da enzima de restrição ao desenhar o par de iniciadores a 
ser utilizado na PCR (Fig. 37). Esta técnica, além de ser de fácil realização, 
ainda permite que mesmo após a inserção do sítio de restrição, a seqüência 
codificadora de uma determinada proteína seja inserida no vetor com a fase de 
leitura correta. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Seqüência de DNA
ATGCCGATGGGCCCTT...........AAATGCCCCCTTACG
TACGGCTACCCGGGAA..........TTTACGGGGGAATGC
Desenho dos iniciadores
Iniciador 1:
5´ AAGCTT ATGCCGATG... 3´
(HindIII)
Iniciador 2:
5´ GGATCC CGTAAGGGG... 3´
(BamHI)
Seqüência de DNA
ATGCCGATGGGCCCTT...........AAATGCCCCCTTACG
TACGGCTACCCGGGAA..........TTTACGGGGGAATGC
Desenho dos iniciadores
Iniciador 1:
5´ AAGCTT ATGCCGATG... 3´
(HindIII)
Iniciador 2:
5´ GGATCC CGTAAGGGG... 3´
(BamHI)
Figura 37: Desenho de 
iniciadores com seqüências 
adaptadoras. 
 
 
 
O iniciador 1 é idêntico em seqüência à fita codificadora. O iniciador 2 é 
complementar à fita codificadora. Os sítios de restrição são acrescidos à 
porção 5´ de cada iniciador (estão em itálico e sublinhados; a enzima que os 
reconhece está entre parênteses). 
Os adaptadores constituem, portanto, uma estratégia que facilita a 
clonagem. O passo seguinte então é a escolha de um vetorde clonagem mais 
apropriado para um determinado inserto e para um dado experimento. 
 
3.2. VETORES DE CLONAGEM 
 
O vetor ideal deve reunir em uma molécula diversas características, 
como: 
I- Ser uma molécula pequena e de fácil manipulação; 
II- Ser capaz de se replicar de forma autônoma e intensa, o que 
permite a amplificação do fragmento de interesse; 
III- Deve conter diferentes seqüências que permitam o 
 
 
 
 
 
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reconhecimento por enzimas de restrição. Neste caso, sítios únicos são 
interessantes porque a inserção pode ser direcionada e não há problema de 
perda de fragmentos após a digestão enzimática. Com esta finalidade, vários 
vetores foram modificados para permitir a inserção de um sítio múltiplo de 
clonagem. Este representa uma seqüência sintética construída de maneira a 
portar somente um único sítio de restrição reconhecido por diferentes enzimas; 
IV- Ter um método fácil e rápido de identificação de clones que 
portam o vetor recombinante. 
Atualmente, estão disponíveis no mercado diversos tipos diferentes de 
vetores que permitem que o procedimento de clonagem seja realizado. A 
escolha entre eles depende basicamente das características do inserto e da 
aplicação pretendida para o gene clonado. 
 
3.2.1. PLASMÍDEOS 
 
Plasmídeos são moléculas de DNA dupla fita circular e 
extracromossomal, que apresentam a capacidade de auto-replicação. 
Virtualmente, quase todos os gêneros de bactérias possuem plasmídeos. Eles 
podem conter os mais variados tipos de informação. Alguns carregam 
informações que os permite se transferirem de uma célula para a outra 
(plasmídeos F); podem ainda conter genes de resistência a antibióticos ou 
codificarem proteínas envolvidas com metabolismos exóticos. Aparentemente, 
alguns plasmídeos podem não apresentar nenhuma função extra, quando são 
então denominados de crípticos. 
Os plasmídeos podem pertencer ao grupo de alto número de cópias 
com 10 a 100 cópias por célula hospedeira, ou ao grupo de baixo número de 
cópias com 4 a 10 cópias por célula hospedeira. Independente do número de 
cópias, mais de um plasmídeo com funções diferentes pode coexistir numa 
mesma célula. A literatura já descreveu microrganismos contendo até mesmo 
de um a oito plasmídeos diferentes por célula. Além disso, devido à 
especificidade da origem de replicação, os plasmídeos podem se replicar em 
 
 
 
 
 
uma espécie específica ou mesmo em várias espécies de células hospedeiras; 
por esta característica, os plasmídeos são denominados como estritos ou não a 
um hospedeiro. 
Por serem moléculas autoreplicativas, os plasmídeos são considerados 
como excelentes veículos para a clonagem molecular. Com este objetivo, os 
plasmídeos naturalmente isolados de bactérias foram modificados por 
engenharia genética para permitir a inclusão características essenciais a um 
vetor de alta eficiência, como: 
I. Serem moléculas de baixo peso molecular, pois a eficiência de 
transformação diminui com vetores de peso acima de 15Kb; 
II. A presença de um único sítio de restrição a ser reconhecido por 
uma determinada enzima de restrição; 
III. Possuir um ou mais marcadores de seleção que facilitem o 
reconhecimento e a seleção do vetor híbrido. 
IV. Dois vetores plasmidiais têm sido utilizados em genética, o 
pBR322 e pUC (Fig. 38). Eles se derivam de plasmídeos encontrados 
naturalmente em espécies bacterianas, porém com modificações genéticas que 
permitiram sua adaptação como vetores de clonagem eficientes. 
 
 
 
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A BA B
 
 
 Figura 38: Plasmídeos. (A) pBR322; (B) pUC19 
 
 
 
 
 
 
O pBR322 possui uma estrutura mais simples que a do pUC. Possui 
dois genes de resistência a drogas: um codifica a ampicilina e outro, a 
tetraciclina. Dentro da seqüência codificadora de cada um destes genes há 
sítios de restrição únicos, os quais têm sido utilizados na clonagem. Contudo, 
geralmente a inserção é realizada no sítio de BamHI presente na seqüência 
codificadora da tetraciclina. Isto tem implicações na seleção dos 
transformantes, como será discutido mais adiante. 
O vetor pUC é mais avançado e permite uma segunda alternativa de 
seleção dos transformantes. Além da resistência ao antibiótico ampicilina, é 
possível uma seleção fenotípica por coloração. O vetor é constituído por parte 
do operon Lac. Uma fração do gene lacZ (Z´) está sob o controle do promotor 
indutível do operon Lac e da proteína repressora LacI. Dentro da região 
codificadora do gene lacZ´ foi inserido o sítio múltiplo de clonagem. 
Outros plasmídeos que permitem uma clonagem eficiente em até 5 
minutos são aqueles que possuem adição de timinas as extremidades 5´ de 
cada fita do vetor linearizado. Estes vetores são rotineiramente utilizados em 
laboratórios para a clonagem de produtos de PCR. Isto se deve à adição de 
adeninas às extremidades 3´ dos amplicons, como já referido anteriormente 
(Fig. 39). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 39: Vetor para clonagem de produtos de PCR. 
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O vetor apresenta em suas extremidades 5´ um nucleotídeo de timina, 
que pode se parear com um resíduo de adenina presente no inserto devido à 
ação da Taq Polimerase. 
Os pequenos plasmídeos que contêm grandes inserções de DNA 
heterólogo tendem a perder espontaneamente a inserção. Portanto, a escolha 
de plasmídeos como vetor de clonagem deve ser feita quando os fragmentos 
de inserção contenham até 10 kb de tamanho. Assim, a clonagem de 
fragmentos maiores deve levar em consideração as características de outros 
vetores. 
 
3.2.2. BACTERIÓFAGOS 
 
Para a formação de uma biblioteca genômica, a clonagem de 
fragmentos maiores facilita para que a mesma seja mais representativa, 
contendo todo ou a maior parte do conteúdo cromossômico. Com essa 
finalidade, foram desenvolvidos veículos de clonagem como os bacteriófagos 
ou fagos lambda. 
Em seu ciclo de vida, o bacteriófago infecta a E. coli, e pode culminar 
em dois destinos diferentes: no ciclo lisogênico ou no lítico. No ciclo lisogênico, 
o DNA do fago injetado na célula hospedeira pode ser integrado ao 
cromossomo da bactéria. Este material é conhecido como profago e pode ser 
mantido indefinidamente na célula hospedeira. Contudo, sob determinadas 
condições de estresse ambiental ou nutricional, o fago pode entrar no ciclo 
lítico. Neste caso, o DNA do fago pode ser excisado e utilizado na formação de 
novas partículas virais, resultando na lise da célula hospedeira. Com propósitos 
de usá-lo na tecnologia do DNA recombinante, o DNA do fago recombinante 
contendo o inserto, precisa ser perpetuado como um bacteriófago por meio de 
vários ciclos líticos. 
A formação de partículas completas do fago é uma seqüência de 
eventos altamente coordenada. Um bacteriófago é formado por uma cauda de 
proteínas tubulares e por um capsídeo que comporta cerca de 50 kb de DNA 
 
 
 
 
 
(Fig. 40), sendo que aproximadamente 20 kb são essenciais para os eventos 
de integração e excisão destematerial genético no cromossomo da célula 
hospedeira. Cada extremidade 5’ da molécula linear é composta por uma fita 
simples de doze nucleotídeos. Estas seqüências são complementares e por 
isso, conhecidas por extremidades coesivas ou seqüência ‘’cos’’. Por serem 
complementares, elas permitem que este DNA linear possa se circularizar 
como um plasmídeo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Figura 40: Composição estrutural do fago lamba. 
 
Na fase inicial do ciclo lítico, há a replicação do material genético do 
fago com a criação de uma molécula linear compostas por muitas unidades de 
50 kb. Cada capsídeo comporta entre 38 a 50 kb de DNA e a localização das 
seqüências cos assegura isto (Fig. 41). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 41: Empacotamento do DNA no capsídeo do fago lamba durante o ciclo lítico. 
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As seqüências cós asseguram que somente 50 kb de DNA serão 
utilizados na formação de cada partícula viral. (Figura modificada de Glick & 
Paternak, 1994). 
Os bacteriófagos foram então manipulados por engenharia genética 
para permitir a inclusão de sítios BamHI nas regiões flanqueadoras da 
seqüência que codifica proteínas relacionadas com a integração do genoma do 
fago. O uso da enzima gera três fragmentos de restrição: o L, o I/E e o R. O 
fragmento L contém a informação genética para a produção do capsídeo e da 
cauda. O R codifica os genes relacionados com a replicação do DNA e do ciclo 
lítico. O I/E contém os genes necessários para a integração e excisão do DNA 
do fago. 
Com o propósito de utilizar os bacteriófagos na clonagem molecular, as 
seqüências I/E são substituídas pelo inserto de interesse. Para isso, o DNA de 
interesse é submetido a uma digestão enzimática com BamHI e fragmentos de 
aproximadamente 20 kb são selecionados como inserto. Estas amostras são 
então ligadas ao DNA do fago digerido com a mesma enzima (Fig. 42). O DNA 
recombinante é então empacotado e utilizado na formação de novas partículas 
de fago durante o ciclo lítico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 42: Sistema de clonagem do bacteriófago lambda. 
cos
L RI/E
L RI/E
BamHI BamHI
cos
Digestão BamHI
BamHI BamHI
Digestão BamHI
Seleção fragmento 
de 20kb
L R
T4 ligase
cos
cos
cos
L RI/EL RI/E
L RI/E
BamHI BamHI
cos
Digestão BamHI
BamHI BamHI
Digestão BamHI
BamHI BamHI
Digestão BamHI
Seleção fragmento 
de 20kb
L RL R
T4 ligase
cos
cos 
 
O Bacteriófago lamba é modificado por engenharia genética para 
permitir que sítios de restrição da enzima BamHI sejam inseridos nas 
extremidades flanqueadoras da região I/E. O DNA de interesse também é 
digerido com a mesma enzima e fragmentos resultantes de peso molecular de 
20 kb são selecionados para a clonagem. Com o auxílio da T4 ligase, o inserto 
selecionado é ligado às regiões L e R. (Figura modificada de Glick & Paternak, 
1994). 
A formação da partícula do fago contendo o DNA recombinante foi 
possível após estudos in vitro que demonstraram a viabilidade do processo. 
Partículas infectivas podem ser produzidas após uma simples mistura dos 
elementos constituintes da partícula do fago: capsídeo, a cauda e o DNA 
recombinante. 
Os fagos são, portanto, úteis na clonagem de fragmentos que 
apresentem peso molecular variando entre 20 a 25 Kb. Contudo, a obtenção de 
insertos maiores é desejável em determinadas situações, como para o 
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seqüenciamento de longas moléculas de DNA do cromossomo eucarioto. Para 
a clonagem de genes destes organismos, freqüentemente é necessário obter 
fragmentos superiores a 25 kb. Como os genes de eucariotos podem variar de 
30 a 40kb, o que se deve a presença de introns, a clonagem de fragmentos 
maiores possibilita a inclusão de toda uma seqüência em um único clone. Por 
este motivo, outros vetores têm sido desenvolvidos para a clonagem destes 
fragmentos. Entre eles estão os cosmídeos, os YACs (cromossomo artificial de 
leveduras) e os BACs (cromossomo artificial bacteriano). 
 
3.2.3. COSMÍDEOS 
 
Os cosmídeos são vetores híbridos que associam elementos de 
plasmídeos – origem de replicação, gene de resistência a antibióticos e o sítio 
múltiplo de clonagem - e de fagos. Assim, o inserto de DNA pode ser 
englobado no capsídeo do fago, responsável por inserir o DNA recombinante 
na célula hospedeira. Ao entrar na célula, as seqüências cos complementares, 
derivadas dos fagos, permitem que o DNA linear do fago possa se circularizar 
como um plasmídeo (Fig. 43). A diferença entre fagos e cosmídeos é o 
tamanho do inserto que pode ser clonado nos dois vetores. O inserto 
heterólogo que o cosmídeo carrega é cerca de três vezes maior que o do fago 
(aproximadamente 45kb). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
BamHI
CosCos ScaI
Cos
BamHI
ScaICos
BamHI
Tet R
Cos Cos
50kb
DNA
Digestão BamHI
Ligação T4 ligase
Formação de Partículas 
de fagos
Infecção
BamHI
CosCos ScaI
Cos
BamHI
ScaICos
BamHI
Tet R
Cos Cos
50kb
DNA
Digestão BamHI
Ligação T4 ligase
Formação de Partículas 
de fagos
Infecção
BamHI
CosCos ScaI
Cos
BamHI
ScaICos
BamHI
Tet R
Cos Cos
50kb
Cos Cos
50kb
DNA
Digestão BamHI
Ligação T4 ligase
Formação de Partículas 
de fagos
Infecção
 Figura 43: Sistema de clonagem utilizando cosmídeo como vetor. 
 
O cosmídeo contém duas seqüências intactas de sítios cos 
flanqueando o sítio único da enzima ScaI, um único sítio de BamHI e a 
seqüência codificadora da tetraciclina, o que permite a seleção por antibiótico 
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de clones transformados com os cosmídeos. O vetor é então digerido com ScaI 
e BamHI. A fonte de DNA é digerida com BamHI, e os fragmentos de 40kb são 
selecionados como insertos. O vetor e o inserto são ligados com o auxílio da 
T4 ligase e utilizados na formação de novas partículas infectivas de fagos. 
Estes infectam E. coli e as seqüências cós permitem que este DNA 
recombinante se circularize como um plasmídeo. Finalmente, os 
transformantes são selecionados por sua capacidade de crescerem em meio 
contendo tetraciclina. (Figura modificada de Glick & Paternak, 1994). 
Para a construção de um cosmídeo, a maior parte do DNA relacionado 
com a estrutura do fago é deletada, permanecendo somente os sítios cos. Esta 
estrutura modificada permite que quase toda a seqüência do DNA doadora 
possaser inserida, desde que não exceda 50 kb, capacidade máxima de DNA 
que o capsídeo do fago comporta. 
Estratégias similares aos cosmídeos foram desenvolvidas, como os 
bacteriófagos P1. A vantagem do uso destes outros vírus é que os mesmos 
podem acomodar moléculas de DNA de até 100 kb. Fragmentos ainda maiores 
podem ser clonados em outros vetores, como os BAC e os YAC. 
 
3.2.4. BAC E YAC 
 
Os BAC são vetores similares a outros plasmídeos, exceto que sua 
origem de replicação e as proteínas envolvidas com na replicação são 
derivadas do plasmídeo “fator F” de E. coli. Isto permite que os BAC sejam 
transferidos à célula hospedeira por conjugação (Fig. 44). Estes vetores podem 
conter fragmentos de até 300 kb. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
cromossomo BAC
pilus
Célula F-Célula F+
Célula F+ Célula F+
Estabilização no pareamento 
entre as células
Replicação e transferência de 
uma das fitas
Síntese da fita complementar
Finalização da transferência 
com a separação das células
cromossomo BAC
pilus
Célula F-Célula F+
Célula F+ Célula F+
Estabilização no pareamento 
entre as células
Replicação e transferência de 
uma das fitas
Síntese da fita complementar
Finalização da transferência 
com a separação das células
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Figura 44: Transferência de BAC às células hospedeiras. 
 
Por serem derivados do plasmídeo F, que possuem os elementos 
genéticos necessários à conjugação bacteriana, o BAC contendo o gene de 
interesse pode ser transferido à célula hospedeira através da conjugação. 
Contudo, rotineiramente se tem utilizado a transformação como meio de 
transferir o BAC para as bactérias. 
A clonagem de fragmentos ainda maiores de DNA foi possível após a 
descoberta de elementos funcionais de cromossomos de leveduras, como 
centrômero, telômero e seqüências que asseguram a replicação autônoma e a 
segregação correta dos cromossomos. Isto permitiu a construção de 
cromossomos artificiais de leveduras que funcionam como vetores de 
clonagem. Os YAC são moléculas de DNA fita dupla linear que podem conter 
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insertos de até um megabase (1.000 Kb). Assim, podem-se isolar clones que 
apresentem seqüências sobrepostas de insertos e que contenham 
coletivamente quase um cromossomo humano inteiro (Fig. 45). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Digestão com 
BamHI e EcoRI
Ligação
DNA de interesse
Seleção
Digestão com 
BamHI e EcoRI
Ligação
DNA de interesse
Seleção
 Figura 45: Construção de YAC. 
 
 
A partir de um vetor que contém todos os elementos necessários para 
a perpetuação de um cromossomo eucarioto, é feita uma digestão enzimática 
para a linearização do vetor. O DNA de interesse é extraído, purificado e 
digerido com as mesmas enzimas. Procede-se com a ligação entre as 
extremidades coesivas do vetor e do inserto, sendo que este DNA 
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recombinante será transformado em uma levedura de eleição e os clones 
recombinantes serão selecionados por resistência a antibióticos. 
 
3.2.5. VETORES DE EXPRESSÃO 
 
Os vetores de expressão são vetores de clonagem que possuem todos 
os elementos genéticos que permitem a expressão de proteínas 
recombinantes. Se os elementos genéticos permitem a expressão em células 
bacterianas, este é um vetor de expressão procarioto. É o tipo mais utilizado 
em pesquisas, pois a manipulação de culturas bacterianas é mais fácil. 
Contudo, bactérias não são capazes de processar o RNAm de eucariotos e, 
neste caso, os insertos a serem utilizados devem ser derivados de bibliotecas 
de cDNA. Uma alternativa a esta questão é o uso de vetores de expressão 
eucariotos, que possuem um promotor eucarioto e sinais de poliadenilação, por 
exemplo. 
Os vetores de expressão são utilizados quando a busca de uma 
determinada seqüência se faz por meio da detecção da proteína por ela 
codificada. Para isso, o sítio múltiplo de clonagem é inserido próximo à região 
promotora. 
As desvantagens do uso de vetores de expressão para o isolamento de 
um determinado gene de interesse se devem ao desconhecimento da 
seqüência do inserto. Para que haja a expressão de uma determinada proteína, 
o inserto deve se ligar ao vetor de forma que a fase de leitura correta seja 
reconhecida pela maquinaria celular. Se isto não ocorrer, novas proteínas 
serão formadas e, portanto, a seqüência de interesse não será detectada, 
mesmo que ela esteja presente em um determinado clone. 
 
3.3. TRANSFORMAÇÃO DA CÉLULA HOSPEDEIRA 
 
O processo de transformação refere-se à introdução de um DNA 
exógeno em uma célula hospedeira. Este processo foi inicialmente 
 
 
 
 
 
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desenvolvido em células bacterianas e, posteriormente, adaptado a células de 
diferentes organismos, como leveduras, fungos, células vegetais e células de 
mamíferos. 
A transferência de material genético para células bacterianas pode 
ocorrer por meio de três processos distintos: transdução, conjugação e 
transformação. 
A transdução é o processo em que a aquisição do material genético é 
mediada pela ação de bacteriófagos. Para isso, inicialmente o fago deve 
infectar e realizar o ciclo lítico. Durante a replicação e formação das partículas 
do fago, há a aquisição do material genético da célula infectada, que é 
considerada como a célula doadora. A troca de material genético ocorrerá 
quando a partícula viral infectar a célula receptora e nela introduzir o DNA 
bacteriano da célula doadora. Em biotecnologia, esse processo é utilizado em 
determinados procedimentos, como na transferência do material genético 
clonado na seqüência do fago ou mesmo de cosmídeos, como já exposto 
anteriormente. 
A conjugação é o processo por meio do qual o material genético é 
transferido de uma célula doadora para uma receptora por meio de contato 
célula a célula. Para que o material genético seja transferido de uma célula a 
outra, é necessário um íntimo contato entre as células, com a formação de uma 
junção através da qual o material será transportado. Na biotecnologia, a 
realização da conjugação normalmente necessita da presença de plasmídeos 
que contenham as funções conjugativas, ou seja, que possibilitem a junção 
célula a célula. Se o plasmídeo portando o inseto de interesse não possui estas 
funções, pode-se introduzir na mesma célula outro plasmídeo que contenha as 
funções de conjugação. 
O protocolo envolve o uso de três receptores bacterianos distintos: O 
primeiro, contendo o plasmídeo conjugável, deve estar em contato com a célula 
que contém o plasmídeo recombinante. Neste processo, o conjugável é 
transferido à segunda célula. Então, a célula contendo os dois plasmídeos deve 
entrar em contato com uma terceira. Esta será transformada com o plasmídeo 
 
 
 
 
 
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recombinante