REVISTA BIOTECNOLOGIA ED 33

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Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 1
ano VII • número 33 • julho/dezembro de 2004
Segurança biológica - entrevista
PCR em tempo real
Micropropagação de copaíba
Controle bacteriano de efluentes
Produção de esferas de quitosana
Análise serial da expressão gênica
Metabolismo da celulose em isoptera
Quorum sensing em sistemas agrícolas
Patentes – Extratos de plantas e derivados
Goma Curdlana: propriedades e aplicações
Estudo ecofisiológico sobre endomicorrizas
Desenvolvimento sustentável e biodiversidade
Similaridade genética em grupos de avestruzes
Cultivo de anteras x cultivo de micrósporos isolados
Hibridização de cDNA bovino em Macroarray humano
Tendência de acidentes em laboratórios de pesquisa
Pragas de cana-de-açúcar x métodos alternativos de controle
ISSN 14146347
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9 7 7 1 4 1 4 6 3 4 0 0 6
2 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
EM MAIO DE 1997 PLANTAMOS A PRIMEIRA SEMENTE
DE BIOTECNOLOGIA NA IMPRENSA BRASILEIRA
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SEGURANÇA BIOLÓGICA
Entrevista
Entrevista concedida a
Maria Fernanda Diniz
Segurança biológica: agricultura, pecuária e florestas saudáveis e livres de doenças e pragas
Ministério da Agricultura, Embrapa e ABIN se preparam para desenvolver
plano estratégico de inteligência para livrar o Brasil do ataque de pragas e
doenças exóticas
A sociedade contemporânea
vivencia hoje um fenômeno chamado
globalização. Críticas e polêmicas à
parte, esse processo vem diminuindo
barreiras, distâncias, aproximando po-
vos e culturas. Graças a ele também, o
comércio internacional vem crescendo
significativamente nas últimas décadas.
De acordo com dados da Organização
Mundial do Comércio – OMC, no pri-
meiro semestre de 2004, houve um
crescimento de 8,5%, comparado com
anos anteriores. O Brasil, apesar de
ainda apresentar uma atuação modesta
nesse cenário vem também sendo be-
neficiado pelas trocas comerciais de
mercadorias entre países, com pers-
pectivas promissoras para décadas fu-
turas. Um dos itens principais da balan-
ça comercial brasileira é o agronegócio,
que teve uma participação de US$
39,016 bilhões no ano de 2004.
O crescimento exponencial do co-
mércio internacional é um dos fatores
que colaboram para que grandes quan-
tidades de mercadorias sejam levadas
rapidamente de uma região para outra
pelos mais diversos meios de transpor-
tes. Mas, se por um lado, esse cresci-
mento é saudável, pois favorece a en-
trada de divisas e uma posição de des-
taque do Brasil no mercado internacio-
nal, por outro lado, possibilita o movi-
mento de inimigos, quase sempre mi-
núsculos, como insetos e microrganis-
mos (bactérias, vírus, fungos,
nematóides e ácaros), mas que podem
causar danos inversamente proporcio-
nais ao seu tamanho à nossa agricultura,
pecuária e florestas. Exemplo recente
disso é a ferrugem da soja, que entrou
no Brasil em 2001 e já causou perdas
BC&D – Qual a relação entre
globalização e disseminação de pragas?
Valois – Com a intensificação do co-
mércio hoje existente, principalmente
por causa da globalização, o processo
de ida e vinda, que está inserido dentro
do direito legítimo de ir e vir, se inten-
sificou também. E é justamente neste
processo de ida e vinda, que as pessoas
podem carregar consigo condicionantes
biológicos que podem ser nocivos à
agricultura, à pecuária ou às nossas
florestas, de forma intencional ou não.
E é por isso que hoje se fala em
bioglobalização, que é a relação entre a
globalização de mercados e a dissemi-
nação de organismos vivos, microrga-
nismos ou plantas, que podem causar
prejuízos à agricultura, pecuária ou às
florestas brasileiras.
BC&D – Quais as medidas o Brasil
toma, nos dias de hoje para proteger a
nossa agricultura da entrada dessas
pragas?
Valois – O Brasil tem se preocupado
especialmente com a questão das bar-
reiras sanitárias e com o processo de
superiores a US$ 2 bilhões na safra de
2003.
Preocupados com esse estranho
fenômeno, ao qual chamam de
“bioglobalização”, ou seja, o desloca-
mento intencional ou não de organis-
mos vivos entre regiões, cientistas bra-
sileiros da Embrapa (Empresa Brasileira
de Pesquisa Agropecuária) e da ABIN
(Agência Brasileira de Inteligência) se
uniram para desenvolver um plano es-
tratégico inteligente de vigilância para
a segurança biológica da agricultura,
pecuária e florestas, sob a coordenação
do Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA). Esse plano
inclui uma série de ações emergenciais
para conter a entrada de pragas e doen-
ças no país e será desenvolvido primei-
ro no estado do Maranhão para depois
ser levado a outros estados brasileiros.
Para falar sobre essa parceria e
sobre as demais medidas que vêm sen-
do tomadas para proteger o Brasil do
ataque desses inimigos silenciosos, a
revista Biotecnologia, Ciência &
Desenvolvimento entrevistou o pes-
quisador da Embrapa, Afonso Celso
Candeira Valois.
Durante a entrevista, Valois ressal-
tou que a preocupação com a seguran-
ça biológica tem que ser considerada
prioridade para o Brasil, pois como ele
mesmo afirma, “apesar de ser o setor
que paga as contas do Brasil há mais de
seis anos, o agronegócio é hoje também
o setor mais vulnerável, em função do
risco da entrada de pragas e doenças
que podem devastar a nossa agricultu-
ra, se não forem tomadas as medidas
necessárias”.
Confiram a entrevista:
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quarentena, que é desenvolvido pela
Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, que é uma das 40 unida-
des de pesquisa da Embrapa e está
localizada em Brasília, para o caso de
plantas. A Unidade é o órgão oficial
designado pelo MAPA para executar a
quarentena de todo o material vegetal
que é introduzido no Brasil para fins de
pesquisa. As plantas são analisadas em
laboratórios e se apresentarem fungos,
bactérias, vírus, nematóides, ácaros ou
insetos exóticos, para os quais não exis-
ta tratamento conhecido, são incinera-
das. Em caso de pragas que já ocorram
no país, são recomendadas formas de
tratamento.
Mas ainda é preciso aumentar esse
controle para enfrentar o crescimento
da chamada bioglobalização. Eu lembro
que quando a Embrapa inaugurou a sua
vitrine de tecnologias, no fim da década
de 90, um ex-ministro da agricultura fez
um comentário interessante. Ele afir-
mou que nós estávamos passando pela
terceira guerra mundial, que é a guerra
da globalização, e que só poderá vencer
essa guerra quem tiver o domínio da
tecnologia. Então, na minha opinião,
esse é o ponto chave. O Brasil tem que
ter o domínio da tecnologia não só para
evitar a entrada dessas pragas e doen-
ças, como também para se preparar
proativamente para controlar os efeitos
nocivos da sua introdução no país, quan-
do não for possível evitá-la.
Um exemplo recente, bem
marcante, foi a desastrosa entrada da
ferrugem da soja no Brasil, causada pelo
fungo Phakopsora pachyrhizi. Essa
praga foi identificada primeiramente
em Mato Grosso, em 2001, e já atingiu
diversos estados, causando sérios danos
à cultura da soja. Esse, aliás, é um
exemplo importante também para ilus-
trar uma nova terminologia, muito usa-
da no contexto atual: o bioterrorismo,
que é a introdução intencional de um
patógeno na agricultura.
Outro exemplo que eu gostaria de
citar, nesse caso para ilustrar a impor-
tância de se estar preparado para a
entrada de pragas indesejáveis, é o da
seringueira, que não se refereao Brasil
e sim à Ásia. Clones de seringueira da
espécie Hevea brasiliensis foram leva-
das do Brasil, da região do baixo Amazo-
nas, para a Ásia em 1876, e essa espécie
é altamente suscetível ao fungo
Microcyclus ulei, causador do mal das
folhas da seringueira. Hoje, os países
da Ásia - Tailândia, Indonésia e Malásia
– são os maiores produtores de borra-
cha do mundo. Se, porventura, esse
fungo chegasse à Ásia, seria um desas-
tre, pois dizimaria grande parte da pro-
dução e, por isso, para evitar a entrada
dele, por exemplo, rotas de avião foram
modificadas e até mesmo canceladas,
como uma que saía do Brasil, passava
em Joanesburgo, na África do Sul, e
chegava em Bangkok, na Tailândia. Eu
dou esse exemplo para enfatizar que,
muitas vezes, medidas radicais como
essa são necessárias para evitar a entra-
da dessas pragas em um país ou região.
O outro caminho é se preparar
para controlar os efeitos danosos da sua
entrada inadvertida na economia do
país, através do melhoramento genéti-
co de plantas, por exemplo, que permi-
te o desenvolvimento de variedades
com resistência a pragas e doenças da
agricultura. Um exemplo interessante
é com relação à ferrugem do café.
Antes que essa doença entrasse no
Brasil, o IAC – Instituto Agronômico
começou a fazer melhoramento gené-
tico do cafeeiro, de modo que quando
ela foi introduzida, nós já tínhamos va-
riedades resistentes. Por isso, hoje essa
doença não é considerada um proble-
ma no Brasil.
Outro exemplo de proatividade
foi com relação à sigatoka negra da
bananeira. Há 22 anos, a Embrapa,
através da sua Unidade de Recursos
Genéticos e Biotecnologia, já se preo-
cupava em introduzir no Brasil
germoplasma (qualquer parte da plan-
ta, animal ou microrganismo que tenha
capacidade de reprodução) de banana
de Honduras e da Venezuela para se
preparar para a chegada do fungo
Mycosphaerella fijiensis, causador da
doença. Esse exemplo ilustra a impor-
tância da coleta, introdução e uso de
recursos genéticos para a pesquisa
agropecuária brasileira. De posse do
germoplasma de banana introduzido, a
Embrapa, através de duas de suas uni-
dades de pesquisa: a Embrapa Mandio-
ca e Fruticultura, em Cruz das Almas, na
Bahia; e a Embrapa Amazônia Ociden-
tal, em Manaus, AM; começou a desen-
volver o melhoramento genético dessa
cultura, de forma que, quando a doença
chegou ao Brasil, já estávamos prepara-
dos para recebê-la com seis variedades
resistentes à sigatoka negra e, por isso,
os prejuízos estão sendo evitados ou
mitigados de maneira significativa.
BC&D – Quais são as doenças ou pra-
gas exóticas que ainda não existem no
Brasil e com as quais devemos nos
preocupar?
Valois – Uma delas é a monília
(Moniliophthora roreri) do cacaueiro,
que é pior do que a famosa vassoura de
bruxa porque fica no hospedeiro por
até oito meses, enquanto a vassoura de
bruxa, causada pelo fungo Crinipellis
perniciosa, permanece por cerca de
três meses. Essa doença já está no Peru,
país próximo ao nosso, e está para
entrar no Brasil pelo Acre. O que temos
que fazer é reforçar a barreira nessa
região, ou seja, dificultar a entrada dessa
praga em nosso país. Além disso, a
CEPLAC – Comissão Executiva do Plano
de Lavoura Cacaueira já está desenvol-
vendo pesquisas de melhoramento
genético para chegar a clones resisten-
tes.
Outras pragas cuja introdução no
“Precisamos trabalhar muito
na divulgação dos perigos da
entrada desses organismos,
pois, muitas vezes são introdu-
zidos no Brasil através de um
inocente “vasinho” ou souvenir
trazido de uma viagem”
“O agronegócio é o setor que
vem pagando as contas do
Brasil há cerca de seis anos.
Mas o risco da entrada de
pragas exóticas o torna extre-
mamente vulnerável. Basta
que um fungo entre no país
para causar um enorme prejuí-
zo, com conseqüências econô-
micas, sociais etc.”
6 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
Brasil causa preocupação são: o ácaro
do arroz (Steneotarsonemus spinki); a
cochonilha rosada (Maconellicoccus
hirsutus), que ataca especialmente fru-
teiras, além de muitos outros produtos;
e o besouro asiático, que é um proble-
ma seríssimo e que se entrar no Brasil
pode simplesmente dizimar a silvicul-
tura nacional, especialmente as culturas
de pinus e eucaliptos. A melhor forma
de evitar a entrada dessa praga no Brasil
é não importar nada da Ásia que venha
em embalagens de madeira, que é uma
das formas de disseminação do be-
souro.
Além dessas, existem ainda: o mal
de vaca louca, que voltou a aterrorizar o
mundo, levando os Estados Unidos a
suspenderem, novamente, a importa-
ção de carne do Canadá; e a gripe
asiática do frango.
BC&D – Pelo que o senhor falou, exis-
tem muitas ameaças externas à nossa
agropecuária, sem falar de outras que
surgem e se instalam como novas pra-
gas. Qual seria a forma rápida e eficien-
te de conhecermos essas pragas?
Valois – É fundamental que se faça um
levantamento nos países dos quais o
Brasil importa para saber as pragas e
doenças que podem ser classificadas
como potenciais ameaças a nossa
agropecuária e florestas. Isso já vem
sendo feito, mas precisa ser intensifica-
do. Vale lembrar o caso de um navio
que chegou ao Brasil em 1995 com um
carregamento de trigo contaminado
pelo fungo Tilletia controversa que foi
interceptado pela equipe de quarente-
na da Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia. A entrada dessa praga
poderia ter causado sérios danos à cul-
tura de trigo no Brasil.
Outra questão importantíssima se
refere à exportação. É imprescindível
que o Brasil conheça as exigências
fitossanitárias dos países para os quais
exporta. O fato de o Brasil não ter adido
agrícola nos países dificulta essa ques-
tão, pois, na maior parte das vezes, os
adidos comerciais não têm o conheci-
mento necessário sobre as exigências
agrícolas e fitossanitárias.
Temos que considerar, no proces-
so como um todo, três situações de
pragas no sentido amplo: a primeira se
refere àquelas que estão há muito tem-
po no Brasil, como por exemplo, o
bicudo do algodoeiro e a mosca branca,
dentre outras.
A segunda diz respeito a pragas
que entraram mais recentemente, como
a mosca da carambola, há cerca de seis
anos, que, infelizmente foi introduzida
no Brasil pelo Suriname, apesar de to-
dos os esforços para evitar. Esse inseto
está no Amapá e a maior preocupação
é que, além da carambola, ele ataca
mais 99 espécies de frutas, principal-
mente goiaba. Para evitar que chegue
ao Pará, que é um produtor expressivo
de frutas, as autoridades do estado es-
tão intensificando as barreiras. Temos
ainda a mosca dos citros, que entrou no
País há seis ou sete anos. Ela foi
introduzida provavelmente da Colôm-
bia e foi vista pela primeira vez no
quintal de uma casa no centro de Belém
(PA). Esse exemplo é interessante para
ilustrar uma situação muito comum e
sobre a qual devemos estar sempre
atentos: a introdução inadvertida de
organismos nocivos à nossa economia.
Precisamos trabalhar muito na divulga-
ção dos perigos da entrada desses orga-
nismos, pois muitas vezes são introdu-
zidos no Brasil através de um inocente
“vasinho” ou souvenir trazido de uma
viagem. Ainda como pragas que entra-
ram recentemente no Brasil, temos a
sigatoka negra da banana e a ferrugem
da soja.
A terceira e última situação é com
relação àquelas que ainda não entraram
no Brasil, sobre as quais eu já falei em
questão anterior.
BC&D – As ameaças de riscos de entra-
da dessas pragas no Brasil não tornam o
agronegócio, de certa forma, vulnerá-
vel?
Valois – Agora você tocou no ponto
principal dessa questão. O agronegócio
é o setor que vem pagando as contas do
Brasil há cerca de seis anos. Mas, o risco
da entrada de pragas exóticas o torna
extremamente vulnerável. Basta que
um fungo entre no país para causar umenorme prejuízo, com conseqüências
econômicas, sociais etc. Quer dizer,
apesar de ser o setor onde se assenta
hoje a economia brasileira, em termos
de renda, serviços, empregos, oportu-
nidades etc., é também o que possui a
maior vulnerabilidade.
BC&D – E qual seria a solução para
diminuir essa vulnerabilidade?
Valois – A solução é nos organizarmos
dentro de um plano estratégico inteli-
gente de vigilância para a segurança
biológica da agricultura, pecuária e flo-
restas no Brasil. Esse plano está sendo
elaborado em parceria entre a Embrapa
e a Agência Brasileira de Inteligência
(ABIN) e tem como objetivo maior
proteger a segurança biológica brasilei-
ra, que envolve o manejo de todos os
riscos bióticos e abióticos associados,
incluindo agricultura, pecuária, flores-
tas, espécies invasoras exóticas, sanida-
de animal e vegetal, bioterrorismo,
agroterrorismo, “bioburla”, além da se-
gurança e qualidade dos alimentos.
Quanto a esse último item, devemos
estar atentos para o controle de, princi-
palmente, três perigos: o físico, como
por exemplo, a presença de partes de
animais ou de outros objetos nos ali-
mentos; o biológico, que se refere à
presença de microrganismos; e o quími-
co, que se divide em duas classes - a
primeira refere-se ao uso dos
agroquímicos que, quando mal aplica-
dos podem ser perigosos, sendo inclu-
sive a quarta maior causa de intoxicação
no mundo; e a outra são as toxinas,
como as micotoxinas (produzidas por
fungos). Temos hoje no Brasil o “Pro-
grama Alimentos Seguros” que se pre-
ocupa com a qualidade dos alimentos
do campo à mesa. Esse programa está
calcado na segurança ao longo de toda
a cadeia produtiva, englobando: consu-
midor, lavoura, alimentos, meio ambi-
ente e produtor rural. Por exemplo,
quanto custou ao Brasil a entrada da
ferrugem da soja? Sabemos que o
prejuízo direto foi de US$ 2 bilhões na
safra de 2003. Mas, na verdade, foi
muito maior, pois foram gastos cerca de
“Muito importante é introduzir
os novos conceitos de
segurança do produtor rural e
de todos os outros atores
envolvidos na cadeia produtiva
nos municípios, associações,
cooperativas etc.”
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US$ 500 milhões em fungicidas, além
dos danos indiretos à saúde, dos produ-
tores, e do meio ambiente. Devemos
manter sempre um enfoque sistêmico
sobre essa questão, não podemos con-
siderar apenas os danos aos alimentos,
mas sim a todas as etapas da cadeia
produtiva. E um passo muito importan-
te nesse sentido é a municipalização,
ou seja, introduzir os novos conceitos
de segurança do produtor rural e de
todos os outros atores envolvidos na
cadeia produtiva nos municípios, asso-
ciações, cooperativas etc. Esse proces-
so pressupõe mudanças em quatro ní-
veis: hábito, cultura, postura e atitude.
O nosso objetivo daqui para frente é
expandir o programa de segurança para
outros produtos, como borracha, óleo
de dendê etc. Com isso será fortalecido
o processo para evitar as barreiras
tarifárias e não tarifárias (técnicas) e
constantes rechaços de produtos brasi-
leiros resultantes das exportações.
BC&D – Ao longo dessa entrevista,
nota-se que essa discussão tem trazido
à pauta uma série de novas terminolo-
gias, como “bioterrorismo”, “bioglobali-
zação” e outros. Agora, o senhor falou
em “agroterrorismo” e “bioburla”, po-
deria explicar melhor esses conceitos?
Valois – Agroterrorismo pode ser en-
tendido como a introdução intencional
de organismos nocivos em um país,
como resultado da competição interna-
cional por mercados ou mesmo a inter-
ferência danosa de um terceiro país em
transações comerciais no setor de
agronegócio entre outros dois países; e
“bioburla” foi um termo criado por mim
e pela pesquisadora da Embrapa Recur-
sos Genéticos e Biotecnologia, Maria
Regina Vilarinho de Oliveira, que desig-
na o não cumprimento de leis ambientais,
como por exemplo, a derrubada
indiscriminada de florestas, como vem
ocorrendo na Amazônia.
BC&D – Voltando ao plano estratégico
que está sendo desenvolvido entre a
Embrapa e a ABIN, como vai funcionar?
Valois – O plano identifica os princi-
pais “gargalos” que existem hoje no
Brasil na área de segurança biológica e
propõe ações para solucioná-los. Estão
previstas as seguintes ações: elabora-
ção de planos de contingência para
pragas e doenças, que vai possibilitar
maior agilidade na tomada de decisões
para reduzir os riscos de dispersão de
pragas e doenças; implantação de um
sistema em rede de consulta para pra-
gas e doenças, de modo a dinamizar o
processo de inspeção, vigilância, fisca-
lização sanitária e contribuição para pro-
jetos estratégicos de pesquisas técnico-
científicas e inovação tecnológica; de-
senvolvimento de metodologia de
amostragem em portos e aeroportos,
visando diminuir os riscos de entrada de
pragas e doenças; quantificação de im-
pactos para pragas e doenças dos pon-
tos de vista: econômico, social,
ambiental, e níveis de dano e de tole-
rância; desenvolvimento de métodos
de diagnóstico para a detecção e iden-
tificação de pragas e doenças;
mapeamento geográfico de pragas e
doenças; desenvolvimento de um siste-
ma integrado de informações de Análi-
se de Risco de Pragas (ARP); levanta-
mentos sobre as exigências de países
importadores quanto à sanidade; comu-
nicação de riscos; e, finalmente, levan-
tamentos proativos sobre a ocorrência
de pragas e doenças em países expor-
tadores.
BC&D – E de que forma essas ações
serão conduzidas?
Valois – O plano será iniciado no esta-
do do Maranhão. A pré-proposta já foi
apresentada a AGED – Agência Estadu-
al de Defesa Agropecuária do Maranhão
e ao governo do estado e, após a
aprovação, o projeto final do plano
piloto será elaborado em conjunto en-
tre a AGED, UEMA (Universidade Esta-
dual do Maranhão); Secretaria de Estado
do Meio Ambiente do Maranhão; MAPA/
Superintendência Federal de Agricultu-
ra do estado; ABIN e a Embrapa Recur-
sos Genéticos e Biotecnologia. No
Maranhão, já existem experiências bem
sucedidas quanto ao desenvolvimento
de programas de controle de doenças e
pragas da agropecuária e também com
a implantação de barreiras sanitárias
contra a sigatoka negra da bananeira. O
plano piloto no Maranhão poderá servir
de modelo para outros estados brasilei-
ros e já há, inclusive, um início de
entendimento para que a segunda eta-
pa seja conduzida no Paraná.
BC&D – Quais serão as principais ações
do programa piloto a ser desenvolvido
no Maranhão?
Valois – O plano piloto prevê o desen-
volvimento de ações em áreas estraté-
gicas do Maranhão, visando à soberania
do estado e a segurança biológica de
suas áreas agrícolas, ambientais e urba-
nas. Com isso, além de evitar ou reduzir
danos causados por pragas e doenças e
por possíveis ações de bioterrorismo e
agroterrorismo, contribuirá para melho-
rar a qualidade de vida da população,
beneficiando comunidades regionais e
locais, com a produção de alimentos de
melhor qualidade. As ações incluem: o
mapeamento de fronteiras, portos e
aeroportos do estado, com o objetivo
de estabelecer barreiras sanitárias; di-
vulgação junto a agricultores e
pecuaristas acerca de procedimentos
sanitários adequados quanto ao uso de
agroquímicos para que não se transfor-
mem em agrotóxicos, vacinação de
gado bovino, levantamento das pragas
e doenças que já entraram no estado,
como o bicudo do algodoeiro e mosca
branca e daquelas avaliadas como ame-
aças potenciais, com o objetivo de esta-
belecer estratégia e tática de controle
inteligente de vigilância; desenvolvi-
mento de campanhas de conscientização
pública sobre a importância da seguran-
ça biológica no meio rural, com a parti-
cipação do governo do estado, prefei-
turas municipais, associações e coope-
rativas de produtores; e modernização
da infra-estrutura institucionalpara o
desempenho adequado dessas ações.
“Agroterrorismo pode ser
entendido como a introdução
intencional de organismos
nocivos em um país, como
resultado da competição
internacional por mercados ou
mesmo interferência danosa de
um terceiro país em transações
comerciais no setor de
agronegócio entre outros dois
países”
Colaboraram nesta edição
BIOTECNOLOGIA Ciência & Desenvolvimento
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Controle bacteriano de efluentes pág 27
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Cultivo de anteras x cultivo de micrósporos isolados pág 51
Goma Curdlana: propriedades e aplicações pág 55
Patentes – Extratos de plantas e derivados pág 62
Desenvolvimento sustentável e biodiversidade pág 72
Metabolismo da celulose em isoptera pág 76
Hibridização de cDNA bovino em Macroarray humano pág 82
Análise serial da expressão gênica pág 88
Tendência de acidentes em laboratórios de pesquisa pág 101
Micropropagação de copaíba pág 109
10 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
Pesquisa
PCR em tempo real
Uma Inovação tecnológica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Caroline Monteiro Novais
Estudante do curso de farmácia do
Centro Universitário de Barra Mansa.
E-mail: carol_farmacia@hotmail.com
Melissa Pires-Alves
Doutora em Biologia Celular e Molecular pela
Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
Professora do Centro Universitário de Barra Mansa.
E-mail: melalves@ig.com.br
Colaborador
Fábio Freitas Silva
Introdução
advento da biologia
molecular foi certamente
um dos maiores passos das
ciências biológicas durante
o Século XX. A descoberta da Reação
em Cadeia da Polimerase (PCR) trou-
xe enormes benefícios e desenvolvi-
mentos científicos como o
seqüenciamento de genomas, a ex-
pressão de genes em sistemas
recombinantes, o estudo de genética
molecular, a determinação rápida da
paternidade e o diagnóstico rápido de
doenças infecciosas.
Ultimamente, uma inovação
tecnológica resultante da PCR, deno-
minada de PCR em Tempo Real, vem
ganhando espaço nos diagnósticos clí-
nicos e nos laboratórios de pesquisa
por apresentar a capacidade de gerar
resultados quantitativos. Essa técnica
permite o acompanhamento da rea-
ção e a apresentação dos resultados de
forma mais precisa e rápida, em rela-
ção à PCR que apresenta somente
resultados qualitativos.
PCR
A Reação em Cadeia de Polimerase
(PCR, do inglês Polymerase Chain
Reaction), é uma metodologia que
pode ser executada inteiramente in
vitro sem o uso de células (BRUCE,
1999). A técnica da PCR foi desenvol-
vida nos anos 80 por Kary Mullis, que
recebeu, em 1994, o prêmio Nobel.
A PCR possibilita a síntese de
fragmentos de DNA, usando a enzima
DNA-polimerase, a mesma que parti-
cipa da replicação do material genéti-
co nas células. Esta enzima sintetiza
uma seqüência complementar de DNA,
desde que um pequeno fragmento (o
iniciador, ou primer, em inglês) já
esteja ligado a uma das cadeias do
DNA no ponto escolhido para o início
da síntese. Os iniciadores definem a
seqüência a ser replicada e o resultado
obtido é a amplificação de uma deter-
minada seqüência DNA com bilhões
de cópias (MULLIS, 1990).
Utilização da técnica da PCR
O desenvolvimento da técnica
de amplificação de segmentos de DNA
utilizando a PCR abriu enormes pers-
pectivas para a análise de genes, diag-
nóstico de doenças genéticas e
detecção de agentes infecciosos como
citomegalovírus, vírus da hepatite B e
C, herpes vírus simples, vírus da rubé-
ola, vírus da imunodeficiência humana
(HIV), Chlamydia trachomatis,
Helicobater pylori, Mycobacterium
tuberculosis e Pneumocistis carinii.
O avanço da ciência sobre a com-
preensão dos genes trouxe para a
rotina do laboratório de genética, fer-
ramentas que permitem o diagnóstico
em nível molecular. Na linha das doen-
ças genéticas, o permanente desen-
volvimento de novos protocolos tem
permitido a pesquisa de pequenas
alterações na seqüência de DNA, como,
por exemplo, na fibrose cística.
Outras aplicações especialmente
úteis para a PCR é a clonagem de um
determinado fragmento de DNA, que
pode ser um gene e o conhecimento
do DNA codificante (cDNA) obtido a
partir da molécula de RNA, o que
permite o estudo da expressão de
genes.
Finalmente, a PCR tem um gran-
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro2004 11
de potencial na medicina forense. Sua
sensibilidade torna possível utilizar uma
amostra bastante pequena (traços mí-
nimos de sangue e tecidos que pode-
riam conter os restos de somente uma
única célula) e ainda se obter uma
“impressão digital de DNA” da pessoa
da qual a amostra foi coletada, poden-
do assim fazer comparações com aque-
les obtidos de vítimas e/ou suspeitos
de casos de infração penal (SILVA &
PASSOS, 2002).
O genoma de cada ser humano
(exceto dos gêmeos idênticos) é dife-
rente nas regiões polimórficas, sendo
possível amplificar essas regiões. As-
sim, a pesquisa de STRs (Small Tan-
dem Repeats) através da PCR, utilizan-
do um conjunto de iniciadores que
cobrem estas partes altamente variá-
veis do genoma humano, pode gerar
uma impressão digital característica de
DNA para cada indivíduo (BRUCE,
1999).
PCR em Tempo Real
A possibilidade de monitorar a
PCR em tempo real revolucionou o
processo de quantificação de frag-
mentos de DNA e RNA. A PCR em
tempo real realiza a quantificação des-
tes ácidos nucléicos de maneira preci-
sa e com maior reprodutibilidade, por-
que determina valores durante a fase
exponencial da reação. O ponto que
detecta o ciclo na qual a reação atinge
o limiar da fase exponencial é denomi-
nado de Cycle Threshold (C
T
) (Figura
1). Este ponto permite a quantificação
exata e reprodutível baseado na
fluorescência.
A emissão dos compostos fluo-
rescentes gera um sinal que aumenta
na proporção direta da quantidade de
produto da PCR. Sendo assim, os valo-
res da fluorescência são gravados du-
rante cada ciclo e representam a quan-
tidade de produto amplificado (http:/
/www.ncifcrf.gov/rtp/gel/rtqpcr/
WhatIs.asp, 2004). Os compostos flu-
orescentes mais utilizados são o SYBR®
Green e TaqMan®.
A PCR em tempo real requer uma
plataforma de instrumentação que con-
tém um termociclador com sistema
ótico para a excitação da fluorescência
e na coleção da emissão e um compu-
tador com um software para aquisição
de dados e análise final da reação.
Estas máquinas, disponíveis de diver-
sos fabricantes, diferem na capacidade
da amostra (96-poços padrão,
processamento de poucas amostras
ou requerem tubos capilares de vidro
especializados), no método da excita-
ção (lasers ou fontes claras do espec-
tro largo com filtros ajustáveis), e na
sensibilidade total. Há também dife-
renças nos softwares para o
processamento dos dados (http://
www.ambion.com/techlib/tn/81/
813.html, 2004).
Fluoróforos
Os fluoróforos são moléculas que
absorvem e emitem luz em um com-
primento de onda específico. Os siste-
mas de detecção da PCR em Tempo
Real utilizam estas moléculas que pro-
porcionam o acompanhamento da re-
ação ao longo dos ciclos.
SYBR® Green
O SYBR® Green se liga entre a
fita dupla de DNA (Figura 2) e com a
excitação da luz emitida pelo sistema
ótico do termociclador, emite uma
fluorescência verde. As vantagens da
utilização do SYBR® Green são: baixo
custo, facilidade no uso e sensibilida-
de. A desvantagem é a ligação em
todo DNA fita dupla que surge durante
a reação, incluindo os dímeros dos
iniciadores e outros produtos
inespecíficos, podendo superestimar
a concentração do fragmento alvo. O
SYBR® Green não ligado ao DNA
exibe uma fluorescência muito pe-
quena. Entretanto, a fluorescência é
realçada quando ligado na fita dupla
do DNA.
No começo da amplificação, a
mistura da reação contém o DNA
desnaturado, os iniciadores e o SYBR®
Green. As moléculas não-ligadas do
SYBR® Green apresentam
fluorescência fraca produzindo um si-
nal mínimo sendo este subtraído du-
rante a análise de computador. Após o
reconhecimento dos iniciadores, algu-
mas moléculas do SYBR® Green po-
dem ligar-se na fita dupla previamen-
te formada. Durante a polimerização
catalisada pela enzima Taq DNA
polimerase, as moléculas do SYBR®
Green vão se ligando ao DNA recen-
temente sintetizado. Assim, a reação é
Figura 1: Curva de amplificação do PCR em Tempo Real. C
T
 – Cycle Threshold. A
amplificação mostra 3 fases distintas (1) linha basal: não houve produtos da PCR
suficiente para detectar a fluorescência; (2) fase log: a quantidade de produtos da PCR
dobra a cada ciclo e (3) fase platô: não há mais aumento no número de produtos.
Figura 2: Molécula de SYBR
Green® entre a fita dupla de
DNA.
12 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
monitorada continuamente e um au-
mento da fluorescência é observado
em tempo real. No ciclo seguinte, na
etapa de desnaturação do DNA, as
moléculas do SYBR® Green são libe-
radas e há queda no sinal da
fluorescência. A detecção da
fluorescência no fim da etapa de ex-
tensão de cada ciclo da PCR permite
monitorar a quantidade crescente de
DNA amplificado (VITZTHUM et al.,
1999).
As duas alternativas mais utiliza-
das além do SYBR® Green são
TaqMan® e Molecular Beacons, am-
bos com capacidade de hibridização
gerando transferência de energia para
quantificação.
4.1.2. TaqMan®
TaqMan® é uma sonda (fragmen-
to de DNA marcado usado para
hibridizar outra molécula de
DNA) utilizada para detectar
seqüências específicas nos
fragmentos de DNA amplifi-
cados na PCR. Esta sonda apre-
senta em uma extremidade
um fluoróforo, e na outra ex-
tremidade um quencher (mo-
lécula que aceita energia do
fluoróforo na forma de luz e a
dissipa na forma de luz ou calor) como
mostrado na Figura 3. Os produtos da
reação são detectados pela
fluorescência gerada após a atividade
exonuclease 5'—>3' da Taq DNA
polimerase.
Durante a PCR em tempo real a
sonda TaqMan® hibridiza com a se-
qüência da fita simples de DNA com-
plementar alvo para a amplificação.
No processo da amplificação a sonda
TaqMan® é degradada devido à ativi-
dade exonuclease 5'—>3' da Taq DNA
polimerase, separando o quencher da
molécula fluorescente durante a ex-
tensão. A separação do fluoróforo do
quencher resulta em um aumento da
intensidade da fluorescência (Figura
4). Assim, durante o processo de am-
plificação a emissão de luz é aumenta-
da de forma exponencial. Esse au-
mento da fluorescência ocorre apenas
quando a sonda hibridiza e quando a
amplificação da seqüência alvo é
estabelecida (HEID et al., 1996).
A reação com a TaqMan® é con-
siderada um método sensível para
determinar a presença ou ausência de
seqüências específicas (HOLLAND et
al., 1991).
Molecular beacons
Molecular beacons são
oligonucleotídeos usados como son-
das de fita simples que formam uma
estrutura secundária entre as extremi-
dades 5’ e 3’, chamada de haste-e-
loop. O loop contém uma seqüência
que é complementar à seqüência-alvo
e a haste é formada pelo anelamento
das seqüências complementares que
estão localizadas nas extremidades.
Um fluoróforo é covalentemente liga-
do no final de uma extremidade e um
quencher é covalentemente ligado na
outra extremidade (Figura 5A). Os
oligonucleotídeos molecular beacons
não emitem fluorescência quando es-
tão livres em solução. Entretanto, quan-
do hibridizam com a fita de DNA
contendo a seqüência-alvo, as sondas
assumem uma mudança
conformacional tornando-a capaz de
emitir fluorescência (Figura 5B).
Figura 3: Ilustração de uma sonda TaqMan®.
F – Fluoróforo e Q – quencher.
Figura 4: PCR em tempo real com sonda TaqMan®.
1.Polimerização
3.Clivagem
2.Substituição da fita
Fluoróforo
Quencher
4.Polimerização finalizada
Iniciador reverso
Iniciador “foward”
SONDA
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 13
Na ausência de alvos, o
oligonucleotídeo não emite
fluorescência, pois o quencher está
próximo do fluoróforo captando ener-
gia. No momento em que o molecular
beacon encontra o seu alvo, ocorre a
hibridização resultando em uma reor-
ganização conformacional, onde o
fluoróforo de dissocia do quencher,emitindo assim a fluorescência.
Os molecular beacons podem
ser sintetizados com diferentes cores
de fluoróforos, possibilitando ensaios
que necessitam detectar diferentes
alvos em uma mesma reação. São
altamente específicos permitindo dis-
criminar seqüências-alvo que diferem
entre si por apenas um nucleotídeo
substituído. São sondas ideais, no en-
saio diagnóstico para identificação ge-
nética, detecção de SNP (single
nucleotide polymorfism) e aplicações
farmacogenéticas (KRAMER, 2004).
Utilização da PCR em
Tempo Real
O sistema de quantificação em
tempo real tem as seguintes aplica-
ções:
· Identificação de alelos em DNA
genômico;
· Análise de seqüências virais,
bacterianas ou de protozoários a partir
de várias fontes;
· Análise de patógenos em ali-
mentos;
· Análise de produtos
transgênicos;
A aplicação em diagnósticos, como
a detecção de patógenos, ou doenças,
torna-se interessante uma vez que
esta técnica permite a quantificação e
rapidez do resultado, pois não mais
requer a detecção em gel de
eletroforese, necessário na análise da
PCR.
Conclusão
As técnicas associadas à biologia
molecular e à engenharia genética
progrediram muito desde a década de
50, quando o DNA teve sua estrutura
descrita. O avanço foi tão grande que
em pouco tempo, pouco mais de 50
anos, suas aplicações práticas já
permeiam o nosso cotidiano.
A descoberta da PCR faz parte
desse progresso, sendo que o mais
novo avanço tecnológico partiu da
própria PCR, gerando a PCR em Tem-
po Real, que permite a quantificação
das amostras amplificadas, sendo de
grande relevância para diagnósticos
de patógenos e doenças genéticas.
Dentre as vantagens, esta técnica em
relação à PCR qualitativa estão a faci-
lidade na quantificação, maior sensibi-
l idade, maior precisão,
reprodutibilidade e acurácia, velocida-
de na análise, melhor controle de qua-
lidade no processo e menor risco de
contaminação.
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vel em: <http://www.ncifcrf.gov/
rtp/gel/rtqpcr/WhatIs.asp>. Aces-
so em: 15 fevereiro 2004.
Figura 5: (A) Oligonucleotídeo usado como sonda é sintetizado de modo a
possibilitar a formação de uma estrutura secundária nas extremidades 5’e 3’. (B)
Toda fita nova formada durante a amplificação é alvo para o anelamento do
molecular beacon, aumentando a intensidade da fluorescência.
A B
14 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
Ricardo Antônio Polanczyk
Eng. Agrônomo, Prof. Dr. Laboratório de
Entomologia, Centro de Ciências Agrárias –
Universidade Federal do Espírito Santo
E-mail: ricardo@cca.ufes.br
Luiz Carlos de Almeida
Eng. Agrônomo, MSc. Coordenadorias de Recursos de
Variedades. Centro de Tecnologia COPERSUCAR.
E-mail:almeida@copersucar.com.br
Luiz Padulla
Biólogo. Laboratório de Patologia e Controle
Microbiano de Insetos (ESALQ/USP)
E-mail: luizpadulla@bol.com.br
Sérgio Batista Alves
Eng. Agr. Prof. Dr. Laboratório de Patologia e
Controle Microbiano de Insetos (ESALQ/USP)
E-mail: sebalves@esalq.usp.br
Ilustrações cedidas pelos autores
Pesquisa
Manejo de pragas de cana-de-açúcar, monitoramento, controle biológico e transgenia visando ao controle de praga de solo
Resumo
Este artigo aborda duas situações reais: controle de Diatraea saccharalis
(broca-da-cana-de-açúcar) com o parasitóide Cotesia flavipes; monitoramento do
besouro Migdolus fryanus com feromônio e um etapa a ser desenvolvida que
visa ao controle de outro besouro (Sphenophorus levis); a geração de plantas
expressando toxina(s) da bactéria entomopatogênica Bacillus thuringiensis
(Bt), visando minimizar ou substituir o uso de agrotóxicos. Este trabalho descreve
a importâncias dessas pragas e de como as alternativas de controle não-
convencionais podem contribuir no seu manejo, de forma mais eficiente e menos
agressiva ao ambiente do que a utilização de inseticidas convencionais. Como
etapa inicial de estudo, foi realizada a seleção de isolados de Bt para o
sphenophorus, resultando no primeiro relato de suscetibilidade de S. levis para
esse entomopatógeno.
Introdução
Diatraea saccharalis (broca-da-
cana-de-açúcar)
É a principal praga da cana,
sendo provavelmente originária da
América Central e do Sul. O adulto é
uma mariposa com as asas anteriores
de coloração amarelo-palha, com al-
guns desenhos pardacentos e as asas
posteriores esbranquiçadas e com 25
mm de envergadura. As lagartas após
a eclosão alimentam-se do
parênquima das folhas, depois se des-
locam para a bainha e penetram pela
parte mais mole do colmo abrindo
galerias de baixo para cima. Os preju-
ízos são diretos pela abertura de gale-
rias, que ocasionam perda de peso da
cana e provocam a morte das gemas,
causando falhas na germinação. Quan-
do a broca faz galerias transversais,
seccionando o colmo, elas provocam
o tombamento da cana pelo vento.
Nas canas novas, a broca produz o
secamento dos ponteiros (coração
morto). Os prejuízos indiretos são
consideráveis, uma vez que através
dos orifícios e galerias penetram fun-
gos que causam a podridão vermelha
do colmo. Os fungos causadores são
Colletotrichum falcatum e Fusarium
moniliforme,que invertem a sacarose,
diminuindo a pureza do caldo e dando
menos rendimento de açúcar e álcool.
Trabalhos desenvolvidos pela ESALQ/
USP, COPERSUCAR e UFSCar mostram
que para cada 1% de intensidade de
infestação da praga, ocorrem prejuízos
de 0,25% de açúcar, 0,20% de álcool e
0,77% de peso (Gallo et al., 2002).
Juntamente com medidas de
controle cultural, o controle biológico
com o parasitóide Cotesia flavipes é
uma alternativa não convencional de
manejo dessa praga que contribuiu
significativamente para a diminuição
do impacto da broca sobre a cana. Este
himenóptero foi introduzido no Brasil
em 1974 e entre 1980 e 2002 a inten-
sidade de infestação dessa praga dimi-
nuiu de 11% para 2,8%. Neste período
foram liberados 14,8 bilhões de adultos
em 2,44 milhões de hectares a um
custo de R$ 7,14 por hectare, implican-
do um custo de R$ 16,7 milhões. Isto
Figura1: Adulto de Sphenophorus le-
vis (bicudo da cana-de-açúcar)
Pragas de Cana-de-açúcar
X métodos alternativos
de controle
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro2004 15
significou uma economia de R$ 88,4
milhões, pois não foram aplicados mais
de 700.000 litros de inseticidas para o
controle da D. saccharalis.
Migdolus fryanus
(besouro migdolus)
M. fryanus é um besouro da
família Cerambycidae cuja fase larval
causa danos ao sistema radicular da
cana-de-açúcar, que passa a exibir sin-
tomas de seca, iniciando com o
secamento das folhas mais velhas. Com
a evolução dos sintomas pode ocorrer
o secamento de todas as folhas, morte
da gema apical e até murcha dos
colmos. Os danos podem se estender
aos internódios basais dos colmos, pre-
judicando a brotação das soqueiras nos
próximos cortes, o que contribui para
o declínio acentuado na produtividade
das áreas infestadas e obriga o produ-
tor a renovar precocemente o seu
canavial, existindo relatos de renova-
ções de áreas que foram feitas logo
após o segundo corte. Ocorre, em
média, uma redução de 25 toneladas/
ha/ano nas áreas infestadas, compara-
das com parcelas tratadas com inseti-
cidas de solo.
O conhecimento restrito sobre a
biologia e ecologia da praga dificulta a
adoção de métodos alternativos de
controle. Sabe-se que apenas a larva
causa danos e que a duração desta fase
é de, no mínimo, dois anos, sendo
encontrados indivíduos até a profundi-
dade de cinco metros no solo. Todo o
ciclo biológico é subterrâneo, sendo
possível coletar adultos na superfície
do solo apenas por ocasião das
“revoadas”, quando só os machos,
que apresentam asas funcionais,
voam nas áreas infestadas até locali-
zarem as fêmeas que se encontram
abrigadas no solo ou expostas na
superfície e que não possuem asas
funcionais. A atração ocorre em fun-
ção de um potente feromônio sexu-
al emitido pelas fêmeas, sendo que
estas, logo após o acasalamento,
penetram novamente no solo e rea-
lizam a deposição dos ovos isolados,
em número médio de 25 ovos por
fêmea, a profundidades que ultra-
passam 1,5 metro.
No estado de São Paulo estima-
se a existência de 50.000 ha de cana
afetados por esta praga e sua pre-
sença foi constatada também nos
estados do Paraná, Mato Grosso do
Sul, Mato Grosso, Goiás e Minas
Gerais.
Existe no mercado um
feromônio sexual para essa praga do
grupo amida, que é comercializado
em “pellets” de 3,5%, ou seja, 1 mg/
”pellet”. Ele pode ser usado para
monitoramento empregando-se uma
armadilha por talhão de 10 a 20 ha,
entre outubro e março, com substi-
tuição dos “pellets” a cada 3 a 4
semanas (Gallo et al., 2002). A des-
coberta, identificação, isolamento e
síntese do feromônio contou com a
participação de pesquisadores brasi-
leiros. Da sua identificação até a
síntese passaram-se pouco mais de
três anos, sendo hoje utilizado na
quase totalidade das usinas e destila-
rias da região Centro Sul do Brasil.
Além do grande potencial de uso no
monitoramento, este foi o primeiro
caso no mundo de um feromônio
sexual de ação a longa distância
entre os cerambicídeos (Bento et al.,
2001).
Sphenophorus levis
(Coleoptera:Curculionidae)
Conhecido como sphenophorus
ou besouro-bicudo da cana-de-açú-
car (Figura 1), causa danos aos
perfilhos e na base dos colmos em
desenvolvimento, reduzindo o nú-
mero de plantas por área e a produ-
tividade das áreas infestadas. As fêmeas
perfuram a base de colmos e de perfilhos
e efetuam a deposição de ovos que
darão origem às larvas (Figura 2) res-
ponsáveis pelos danos. Estas, ao se ali-
mentarem, escavam galerias e danifi-
cam os tecidos no interior das bases,
podendo provocar a morte das plantas,
falhas nas brotações das soqueiras e
redução na longevidade dos canaviais,
que muitas vezes não passam do segun-
do corte. Ocorrem prejuízos de, em
média, 20 a 23 toneladas/ha/ano nas
áreas infestadas.
Atualmente a praga encontra-se
disseminada em 30 municípios próxi-
mos à região de Piracicaba, além de
cinco municípios mais distantes, existin-
do a perspectiva de aumento de sua
dispersão de ano a ano. A disseminação
da praga por meio do trânsito de mudas
é a hipótese mais provável para expli-
car a rápida expansão da área infestada,
visto que o inseto praticamente não voa
e seu caminhamento é lento, com uma
reduzida taxa de dispersão.
O método mais recomendado para
o controle da praga é o cultural, que
consiste na destruição antecipada das
soqueiras nas áreas infestadas, destina-
das à reforma, preferencialmente no
período de maio a setembro. A seguir a
área deverá ser mantida livre de plantas
hospedeiras da praga e o próximo plan-
tio deverá ser realizado o mais tarde
possível, em março-abril, em ciclo de
cana de ano e meio, reduzindo, desta
forma, a probabilidade de infestação a
partir dos adultos que normalmente es-
tão presentes em maiores quantidades
no período de janeiro a março. As mudas
a serem utilizadas no plantio deverão
estar isentas da praga, sendo originárias
de áreas não infestadas ou tendo sido
colhidas em sistema de corte basal alto
com até 20cm acima do nível do solo.
Os métodos de controle que inclu-
em a aplicação de inseticidas ou a distri-
buição de iscas tóxicas apresentam as
desvantagens de necessitarem o dis-
pêndio elevado com mão-de-obra e a
necessidade de reaplicações constan-
tes.
Em relação às áreas destinadas ao
plantio de viveiros, recomenda-se o pre-
paro antecipado e a inspeção das mudas
provenientes do viveiro anterior, que
deverão estar totalmente isentas de qual-
quer forma biológica da praga, sendo
Figura 2: Larva de S.levis
16 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
adotado o corte basal alto em situa-
ções de necessidade de uso de deter-
minada muda com a presença da pra-
ga.
Biotecnologia X
Sphenophorus levis
No Brasil, a área cultivada de
cana-de-açúcar sofrerá nos próximos
anos um incremento significativo de-
vido, principalmente, ao interesse de
alguns países, como Japão e China, em
importar álcool para se adequarem ao
Tratado de Kioto, que regula a emis-
são de gases poluentes na atmosfera.
Certamente a importância dessa praga
vai aumentar com o incremento da
área plantada, sendo necessário a bus-
ca por novas táticas de controle menos
agressivas ao meio ambiente.
A bactéria entomopatogência
Bacillus thuringiensis (Bt) é empre-
gada no controle de diversas pragas,
existindo mais de 200 produtos dispo-
níveis no mercado. Uma das descober-
tas que aumentou sua utilização ocor-
reu em 1983, quando foi isolado e
caracterizado o Bt tenebrionis, eficaz
contra coleópteros. Desde então mui-
tos estudos foram desenvolvidos, e
atualmente existem produtos eficazes
para estes insetos. Entre os aspectos
favoráveis destes produtos, destaca-
se: seletividade, preservando o ambi-
ente e os inimigos naturais das pragas
(Glare & O’Callagham, 2000).
As toxinas Cry responsáveis por
grande parte da atividade inseticida
desse patógeno localizam-se nos cris-
tais protéicos. Geralmente cada toxina
Cry é caracterizada por um gene cry
específico, o que facilita a sua manipu-
lação genética. Com os avanços na
engenharia genética foi possível, em
1985, a obtenção da primeira planta
geneticamente modificada resistente
a insetos. Estas plantas têm apresenta-
do algumas limitações quanto a sua
eficácia, principalmente devido à rápi-
da evolução da resistência (Glare &
O’Callagham, 2000) causada pela gran-
de pressão de seleção que exercem
sobre os insetos (Tappeser, 1997).
Porém, se adequadamente manejadas
e usadas racionalmente (Tappeser,
1997; Neppl, 2000), representam uma
importante tática dentro do manejo
integrado.
O impacto de produtos à base de
Bt e plantas-Bt no ambiente é pouco
estudado, embora muitas especula-
ções sejam feitas. As principais preo-
cupações são: expressão de caracte-
rísticas fenotípicas indesejáveis, fluxo
gênico e permanência das toxinas no
solo após a morte da planta (Glare &
O‘Callagham, 2000). Porém, os relatos
sobre esses impactoscitados são raros,
ao passo que os agrotóxicos têm efei-
tos negativos já comprovados tanto
sobre o ambiente como para a saúde
humana. Além disso, esse produtos
podem afetar os inimigos naturais que
atuam no controle biológico natural de
outras pragas, como D. saccharalis.
Deve-se ressaltar que a utilização
de plantas geneticamente modifica-
das evita o trânsito e utilização em
demasia de máquinas e implementos,
que pode compactar e comprometer
a estrutura do solo. Tal premissa está
de acordo com estudos realizados pela
Universidade de São Paulo, que apon-
tam a viabilidade do preparo reduzido
do solo nesta cultura. Em 5 anos, os
dados dos sistemas de preparo indica-
ram uma diminuição de custos da
ordem de 28,9% entre os preparos
convencional e reduzido, e de 46,9%
na comparação entre convencional e
direto (Luz et al., 2003).
É importante enfatizar que essa
praga ocorre em reboleiras, e a utiliza-
ção de plantas expressando toxinas
Cry, somente nestes locais favorece o
manejo da evolução resistência dos
insetos a planta-Bt, pois diminui a
pressão de seleção destas plantas so-
bre as populações das pragas, preser-
vando indivíduos suscetíveis que ao
cruzar com os resistentes retardam a
evolução resistência (Neppl, 2000).
Outro fato favorável é que a cana-de-
açúcar é colhida antes do florescimento,
evitando o risco de fluxo gênico entre
as plantas de espécies diferentes.
De um modo geral, as autorida-
des responsáveis pela liberação do
cultivo de plantas geneticamente
modificadas estão sofrendo pressões
para reduzir ou proibir o seu plantio
em muitos países devido, principal-
mente, à falta de trabalhos indepen-
dentes sobre o impacto do seu uso no
agroecosistema. Glare & O’Callagham
(2000) enfatizam a necessidade de
realização destes estudos para verifi-
car a viabilidade desta tática de contro-
le dentro do contexto do manejo inte-
grado de pragas.
No caso da cana-de-açúcar, a
pesquisa deve iniciar pela seleção em
laboratórios de isolados do patógeno
eficientes contra as pragas (testes de
patogenicidade, virulência) ou por
material já caracterizado contendo to-
xinas Cry ativas para as espécies-alvo
em questão (Cry1J, IH, 3 e 8). Após
esta etapa, os genes cry selecionados
serão clonados e sequenciados para
posterior inserção na planta por técni-
cas de transgenia. Após a obtenção da
planta geneticamente modificada, se-
rão conduzidos testes em campo para
avaliar a eficiência. Todas as partes da
planta ou somente a sua parte inferior
podem expressar a(s) toxina(s)
escolhida(s) e quando o inseto se
alimenta da planta, este ingere a toxi-
na, cessa a sua alimentação em 5-10
min, e morre cerca de 3 dias após a
ingestão.
Com a finalidade de selecionar
isolados de Bt eficientes para o esse
curculionídeo estão sendo realizado
ensaios em laboratório para verificar a
patogenicidade (se Bt causa morte do
inseto ou não) e, posteriormente, viru-
lência (agressividade do agentes
patogênico), uma vez que nada existe
na literatura sobre efeito desse
entomopatógeno sobre o
sphenophorus.
Bioensaio de patogenicidade
O isolamento do Bt a partir de
amostras de solos e o bioensaio foram
realizados no Laboratório de Patologia
e Controle Microbiano de Insetos da
Escola Superior de Agricultura Luiz de
Queiroz (ESALQ/USP) em Piracicaba-
SP.
Neste biensaio foram utilizados
isolados de Bt obtidos a partir de
amostras de solos, conforme método
adaptado da Organização Mundial da
Saúde (WHO, 1985), onde cada amos-
tra de 1 g do substrato foi
homogeneizada em 10 mL de solução
salina (0,006 mM FeSO
4
.7H
2
O; 0,01
mM CaCO
3
.7H
2
O; 0,08 mM
MgSO
4
.7H
2
O; 0,07 mM MnSO
4
.7H
2
O;
0,006 mM ZnSO
4
.7H
2
O; pH 7,0) e
submetida à agitação durante 24 h.
Uma alíquota de 1 ml foi transferida
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 17
para tubo de microcentrífuga tipo
“eppendorf” e, após choque térmico
(80 oC por 12 min) para eliminar as
células vegetativas, foi diluída 10 e
100 vezes em solução salina. Uma
alíquota de 100 ml da última diluição
foi distribuída em placa de Petri con-
tendo ágar nutritivo (0,05% extrato de
levedura; 0,01% de triptona; 0,17 M
NaCl e 0,023% de ágar bacteriológi-
co). O material foi então mantido em
estufa, 30 oC durante 48 h.
As colônias obtidas foram avalia-
das quanto à morfologia (forma, bor-
do, elevação, estrutura, tamanho e
coloração), selecionadas para as carac-
terísticas correspondentes a bacilos e
transferidas para meio contendo peni-
cilina G a 100 mg/L, seletivo para B.
thuringiensis e B. cereus (Jung et al.,
1998). Os isolados inoculados neste
meio foram mantidos 24 h a 30 oC e
180 rpm no agitador. Após este perí-
odo cada amostra foi individualmente
analisada quanto ao crescimento do
microrganismo. Em seguida foram pre-
paradas lâminas e observadas em
microscopia de contraste de fase para
a verificação da presença de corpos de
inclusões parasporais (cristais) que
permitem a diferenciação entre B.
thuringiensis e B. cereus.
Após, os isolados foram cultiva-
dos por 48 h em ágar nutritivo. Após
esse período foram feitas diluições
sucessivas (10 e 10 x) para a determi-
nação do número de esporos/mL para
se obter uma suspensão com 3 x 108
esporos/mL, confor-
me Alves & Moraes
(1998). Em seguida,
100mL dessa suspen-
são foi aplicada na su-
perfície de um placa
(3 x 1,5 cm) conten-
do dieta artificial apro-
priada para o desen-
volvimento do inse-
to, sobre a qual foi
colocada uma larva
(0,03g de peso mé-
dio), após a evapora-
ção do excesso de
água. Os insetos utili-
zados são provenien-
tes de uma criação
laboratorial perten-
cente ao Núcleo
de Pesquisa da
COPERSUÇAR em Piracicaba-SP. Para
cada isolado, denominados como
ESALQ Bt – 5, 20, 95, 244, 245, 246,
277 e 279, foram testados 45 insetos
distribuídos em 3 repetições. O mate-
rial foi acondicionado em B.O.D. a
70±10% RU e 25±2oC e a avaliação da
mortalidade foi feita 7 dias após a
aplicação dos tratamentos. Os dados
foram submetidos a Tukey 5% para
verificar a diferença entre os trata-
mentos (SAS Institute, 1982).
Apesar da maior mortalidade ob-
servada ter sido baixa (26,66%), o
resultado obtido com o isolado ESALQ
Bt 95 mostra que a bactéria Bacillus
thuringiensis é patogênica (tem ativi-
dade tóxica) para S. levis, mostrando
potencial para ser utilizada no contro-
le de praga. Este é o primeiro relato de
atividade desse entomopatógeno para
o sphenophorus. A seleção dos isola-
dos continuará a fim de encontrar um
isolado altamente virulento que possa
ser utilizado em transgenia visando ao
controle dessa praga.
Conclusão
Este trabalho mostrou que a
bactéria entomopatogênica Bacillus
thuringiensis é promissora para o con-
trole de S. levis.
Literatura citada
Alves, S.B.; Moraes, S.B. Quantificação
de inóculo de patógenos de inse-
tos. In: ALVES, S.B. (Ed.). Contro-
le microbiano de insetos. 2.ed.
Piracicaba: FEALQ, 1998. cap. 23,
p.765-778.
Bento, J.M.S.; Vilela, E.F.; Lucia, T.M.C.D.
Considerações sobre a história do
estudo e emprego de feromônios
no Brasil. In: VILELA, E.F.; LUCIA,
T.M.C.D. (Eds.). Feromônios de
insetos. 2. ed. Ribeirão Preto:
Editora Holos, 2001. cap 18, p.147-
160.
Glare, T. R.; O’Callaghan, M. Bacillus
thuringiensis: biology, ecology
and safety. Chichester: John Wiley
& Sons, 2000. 350 p.
Jung, Y.C.; Kim, S.U.; Côte, J.C. et al.
Characterization of a new Bacillus
thuringiensis subsp. Higo strain
isolated from rice bran in Korea.
Journal of Invertebrate
Pathology, v.71, n.1, p.95-96,
1998.
Luz, P.H.C.; Montezuma, M.; Scaléa, M.
Plantio direto e preparo reduzido
ganham terreno. JornalCana,
n.111, p.34-36, 2003.
Neppl, C. C. Managing resistence
to Bacillus thuringiensis
toxins. B.A. Tese. Universidade
de Chicago, 2000. 35 p.
SAS Institute.User’s Guide: Statitics.
SAS Institute. Cary, NC, 18, 1982.
520p.
Teppeser, B. The differences between
conventional Bacillus
thuringiensis strains and transgenic
insect resistance plants. Possible
reasons for rapid resistance
development and susceptibility of
non-target organisms. Open-
endind Group on Safety, 6 p.
1997.
World Health Organization. Informal
consultation on the
development of Bacillus
shaericus as a microbial
larvicide. Geneva/UNDP: World
Bank/WHO. 24 p. Special Program
for Research and Training in Tro-
pical Diseases (TDR).
odalosI *)%(edadilatroM
QLASE tB 59 a66,62
AHNUMETSET b88,8
QLASE tB 542 b88,8
QLASE tB 02 b66,6
QLASE tB 642 b66,6
QLASE tB 5 b66,6
QLASE tB 772 b44,4
QLASE tB 442 b22,2
QLASE tB 972 b0
Tabela 1: Atividade de isolados de Bacillus thuringiensis
para larvas de Sphenophorus levis.
18 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
Similaridade genética em
GRUPOS DE AVESTRUZES
José Ribamar Felipe Marques
Zootecnista., Dr. em Genética
Embrapa Amazônia Oriental
marques@cpatu.embrapa.br
Maria Rosa Costa
Eng. Agro., M.Sc. em Genética
Embrapa Amazônia Oriental
mrco@cpatu.embrapa.br
Silvaney Fonseca Ferreira
Bolsita PIBIC/CNPq/UFPA
Embrapa Amazônia Oriental
Paulo Henrique Sá Maia
M. Veterinário
PG – Ciência Animal UFPA/ EMBRAPA
Raimundo Nonato Camargo Jr.
M. Veterinário
PG – Ciência Animal / UFPA / EMBRAPA
Ilustrações cedidas pelos autores
Pesquisa
Similaridade genética em grupos de avestruzes (Struthio camelus) na Amazônia
Caracterização e uso de
recursos genéticos animais
criação de avestruzes ou
estrutiocultura apresenta
grande desenvolvimento no
País e, na região amazônica,
o número de criadores vem aumen-
tando bastante nos últimos anos, o que
faz deduzir que, em pouco tempo,
essa atividade assumirá papel impor-
tante no âmbito da produção animal.
Algumas pesquisas sobre o comporta-
mento e o manejo desses animais
estão sendo desenvolvidas em alguns
criatórios regionais e, dentro de pouco
tempo, darão importantes respostas
para a criação dessas aves na Amazô-
nia.
Na área da biologia molecular não
há informações, até o momento, de
qualquer estudo, com a espécie, na
região, contudo, na região Sudeste,
alguns autores têm desenvolvido aná-
lises de PCR voltados para sexagem
(Bello & Sánchez, 1999; Malagó Jr. et
al., 2002;) e, fora do país, há informa-
ções de estudos com marcadores
microssatélites na detecção de
polimorfismos na espécie (Kumari &
Kemp, 1998).
Este estudo é pioneiro no bojo de
um projeto mais abrangente que visa
desenvolver tecnologias de manejo
associadas à detecção de índices
zootécnicos para um sólido estabele-
cimento do avestruz na região amazô-
nica, respeitando-se as peculiaridades
de clima, solo e outras variáveis que
interferem na criação animal.
O Avestruz (Struthio camelus)
pertence ao grupo das ratitas, ou seja,
é uma ave corredora, sendo originária
da África do Sul. Apresenta tempera-
mento dócil e grande rusticidade
(Negrini, 2002; Taguchi, 2002; Nithack,
Figura 1 Animais da fazenda MARAVEST
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 19
2001).
Podem ser classificadas em
subespécies, ou seja, S. camelus
camelus, australis, siriacus,
domesticus. No Brasil encontra-se em
maior escala a Black Neck (Pescoço
Preto) denominada, em geral, de African
Black, sendo a mais difundida pelo
temperamento dócil, rusticidade e, con-
seqüentemente, alta produtividade, es-
tando adaptada às diversas regiões,
onde são criadas, comercialmente. Em
menor escala encontra-se a Red Neck
(Pescoço Vermelho) e a Blue Neck
Tabela 1.Identificação dos indivíduos. Belém – PA, 2004.
ºN edadilacoL
1VA F123 AM,zirtarepmI 1
2VA 651 AM,zirtarepmI 1
3VA F04 AM,zirtarepmI 1
4VA F26 AM,zirtarepmI 1
5VA MA157 AM,zirtarepmI 1
6VA F012 AM,zirtarepmI 1
7VA F603 AM,zirtarepmI 1
8VA M902 AM,zirtarepmI 1
9VA M581 AM,zirtarepmI 1
01VA M271 AM,zirtarepmI 1
11VA F413 AM,zirtarepmI 1
21VA 802 AM,zirtarepmI 1
31VA F31ETEUQIP AP,auetaucarT 1
41VA F5ETEUQIP AP,auetaucarT 1
51VA RONEMGELF22 AP,auetaucarT 1
61VA ROIAMGELF22 AP,auetaucarT 1
71VA ednarGgeLM22 AP,auetaucarT 1
81VA geLM22 AP,auetaucarT 1
91VA F5 AP,auetaucarT 1
02VA 42M7 AP,auetaucarT 1
12VA 92M71 AP,auetaucarT 1
22VA F51 AP,auetaucarT 1
32VA M31 AP,auetaucarT 1
(Pescoço Azul) (Kiss, 2002; Nithack,
2001).
A importância da atividade decor-
re em função dos produtos e
subprodutos que oferece, sendo que a
carne, além de apreciada pelo paladar,
possui todos os requisitos atuais de um
alimento altamente saudável:
baixíssimo teor de colesterol, pouca
gordura, alto teor de proteína e alto
teor de ferro, etc. (Taguchi, 2002). A
característica de carne magra se deve
à distribuição da gordura no corpo, que
se concentra em volta do estômago e
abaixo da pele (Negrini, 2002). Os
derivados como couro (pele), as plu-
mas e ovos e, ainda, o aproveitamento
secundário de tendões, córneas e gor-
dura (Nithack, 2001) a tornam imbatí-
vel em valor agregado, sendo alta-
mente rentável. Por outro lado, os
ovos, além da incubação, podem ser
utilizados na alimentação, por possuí-
rem propriedades nutricionais seme-
lhantes ao ovo de galinha. Os ovos
não-fecundados são utilizados em ar-
tesanato na fabricação de peças deco-
rativas que alcançam cotações bastan-
te expressivas no mercado de arte
(Taguchi, 2002). O óleo é utilizado na
indústria de medicamentos e cosméti-
cos, assim como as pestanas na fabri-
cação de pincéis. As córneas por se
assemelhar à córnea humana, estão
em estudo para serem utilizadas em
transplante para seres humanos
(Taguchi, 2002).
Por tudo isso, o mercado potenci-
al para essas aves na região é muito
grande, inclusive para o aproveita-
mento de áreas já abertas, degradadas
e improdutivas, sem abertura de no-
vas fronteiras de pastagens, o que a
torna, ainda, uma importante alternati-
va de produção de proteína nobre
ecologicamente correta, pois o Brasil é
bastante favorecido pelo seu clima e
solo, sendo considerado pela comuni-
dade mundial como um dos países de
maior potencial para o crescimento
dessa atividade.
O presente trabalho tem como
objetivo efetuar uma análise prelimi-
nar de alguns grupos genéticos criados
na Amazônia, avaliando o grau de
similaridade, como ferramenta para o
desenvolvimento de ações de melho-
ramento genético, utilizando mais ra-
cionalmente a variabilidade existente
nos plantéis, visando a maior produti-
vidade animal.
Material e métodos
Germoplasma
O material investigado foi com-
posto de 23 indivíduos, provenientes
das fazendas MARAVEST (12), locali-
zada em Imperatriz – MA (Figura 01)
e PERI-CIGANO (11), em Tracuateua
– PA (Figura 02).
Os animais em ambas as proprie-
dades são pertencentes à raça Black
1
Localidade
20 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
Neck ou African Black, conforme es-
pecificado na Tabela 01.
O sangue foi coletado em tubos
vacutainer de 5ml contendo EDTA
(anticoagulante) e mantido em refri-
geração até o processamento no Labo-
ratório de Genética e Biologia
Molecular - LABGEN da Embrapa Ama-
zônia Oriental. O DNA genômico foi
extraído a partir de 150 µl de sangue
total ao qual foi adicionado 5 ml de
tampão STE, 250 µl de SDS 10% e 100
µl de proteinase K (10mg/ml), dei-
xando-se 40 minutos a 55 0C em
contínua agitação. Em seguida adicio-
nou-se 2ml de NaCL 5M, agitando
cuidadosamente por 15 segundos e
acrescentou-se 5ml de clorofórmio:
álcool isoamílico ( 24:1) agitando por
inversão durante 15 minutos até a
completa homogeneização. Após
centrifugar por 15 minutos a 4 0C e
12.000 rpm. A parte superior foi cuida-
dosamente isoladae submetida a
etanol absoluto, o que ocasionou a
precipitação do DNA que foi, em se-
guida, centrifugado por 10 minutos a
4 0C e 12.000 rpm, lavado com 1000µl
de etanol 70 %, para remover sais e,
posteriormente, seco à temperatura
ambiente, por aproximadamente 12
horas. O DNA foi ressuspendido com
100 µl de TE . A concentração de DNA
foi estimada em gel de agarose 1,0 %,
pela comparação do DNA total com
três concentrações do DNA lambda.
As amostras utilizadas no RAPD, após
a quantificação, partiram de diluições
da amostra total em água estéril, de
modo a conter 5 ng/µl de DNA. As
alíquotas foram armazenadas a –20 0C.
Para a triagem dos “primers” foram
selecionados 6 indivíduos aleatoria-
mente e foram testados 160 “primers”
de 8 kits da Operon Technologies. Os
“primers “que apresentaram padrão
de amplificação de má qualidade, ban-
das fracas ou rastros foram excluídos.
Dentre os primers polimórficos foram
selecionados aqueles que possuíam
pelo menos três bandas.
Os primers randômicos utilizados
no RAPD foram: OPB03, OPB09,
OPQ04, OPQ05, OPQ06, OPQ07,
OPQ09, OPQ20, OPF09, OPF10,
OPAW08, OPO08, OP015 e OPO19.
As reações RAPD foram desen-
volvidas, de acordo com o protocolo
de Williams et al. (1990), modificado,
num volume final de 13 µl, contendo
água destilada autoclavada; 20 mM
Tris-HCl (pH 8,0); 50 mM KCl; 2,0 mM
MgCl2; 200 µM de cada dNTP; BSA
purificada (2,5 mg/ml); 1,3 µM primer
arbitrário; 1U.I. Taq DNA polimerase e
15 ng de DNA genômico, cobertas
com duas gotas de óleo mineral.
As amplificações foram realizadas
em termociclador de DNA Thermolyne
Amplitron II, modelo DB.80225, sen-
do realizados 40 ciclos de 1’ a 94 0C, 1’
a 37 0C e 2’ a 72 0C, seguidos de mais
7’ a 720 C, para a completa extensão
dos produtos amplificados. O método
utilizado para a separação dos produ-
tos amplificados foi a eletroforese ho-
rizontal, em gel de agarose 1,5%, cora-
do com brometo de etídio 1mg/ml.
Utilizou-se 13 µl de cada reação, acres-
cido de 2 µl de uma solução de azul de
bromofenol (40 %), mais sacarose.
Utilizou-se TBE (Trizma base 0,1 M;
Ácido bórico 1M e EDTA 0,5M), como
tampão do gel e de corrida.
Após a eletroforese, os géis foram
visualizados e fotografados em equi-
pamento de foto documentação, por
transiluminação em ultravioleta.
Aplicou-se um ladder de 1Kb no
início e no final do gel para definir o
tamanho aproximado dos fragmentos
gerados nas PCRs.
Inicialmente, construiu-se uma
matriz para os fragmentos polimórficos
amplificados com presença (1) e au-
sência de banda (0). Somente foram
consideradas as bandas que não da-
vam margens a dúvidas. Bandas muito
fracas, de difícil resolução, não foram
incluídas. Para análise dos dados, utili-
zou-se o NTSYS-pc (Numerical
Taxonomy and Multivariate Analysis
System), versão 2.02. A similaridade
entre as amostras foi estimada pelo
coeficiente de Jaccard, que gerou a
matriz de similaridade. A partir dessa
matriz, foi gerado o cluster, pelo mé-
todo UPGMA (“Unweighted Pair-Group
Method Using Arithmetic Average”),
que foi expresso na forma de um
dendograma (Figura 5)
Resultados e discussão
Figura 2 – Detalhe de animais da
fazenda PERI – CIGANO
Figura 3. Eletroforese do RAPD gerado pelo primer OPQ06. A primeira e última
colunas correspondem ao marcador Ladder e as demais aos genótipos analisados.
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 21
Um total de 76 marcadores RAPD,
com tamanhos variando de 300pb a
2200 pb, foi amplificado pelos 14
primers utilizados, onde todos foram
polimórficos. O número de fragmen-
tos polimórficos por primer variou de
11 (OPQ-06) a 01 (OPQ-04, OPB-03 e
09). Observou-se dentre os fragmen-
tos amplificados, a ocorrência de ban-
das específicas aos indivíduos. Na Fi-
gura 3, visualizam-se exemplos destes
marcadores. Estimaram-se os índices
de similaridade para todos os indivídu-
os analisados (Figura 4). A maior
dissimilaridade foi obtida,
comparando-se o indivíduo
Av23 com o Av18 (7 %) de
Tracuateua-PA. Isso indica
que estes indivíduos são
candidatos potenciais,
como fonte de variabilida-
de, visando o melhoramen-
to genético, pois se trata
de genótipos com carac-
terísticas gênicas diversas.
Por outro lado, a maior si-
milaridade genética foi en-
tre o Av7 e o Av4 (83 %)
de Imperatriz-MA, indican-
do que, para a realização
de acasalamentos, os ma-
chos escolhidos como
reprodutores devem ser
de diferentes origens, para
aumentar a variabilidade
dos descendentes.
Na Figura 5, encon-
tra-se o dendograma, ge-
rado pelo método UPGMA,
através do programa
NTSYS-pc, 2.02. Esta aná-
lise de distância genética
gerou o cluster, que mos-
tra a separação dos aces-
sos, em dois grupos princi-
pais. No primeiro grupo
encontra-se isolado o indi-
víduo AV9, indicando ser
ele um potencial
reprodutor, em função de,
provavelmente, possuir
um conjunto gênico dife-
renciado. No segundo gru-
po, que se subdividiu em
dois subgrupos, com coe-
ficiente de similaridade, va-
riando de 7% a 83%, inclu-
em-se 22 indivíduos, oriun-
dos das duas localidades,
demonstrando que num
trabalho de melhoramen-
to genético deve-se lançar
mão para ordenar os
acasalamentos dos indiví-
duos mais dissimilares, ou
seja, quanto menor for a similaridade
dos indivíduos maior será a resposta
fenotípica, isto é, a produtividade de
carne, a fertilidade e quantidade de
ovos, além da apresentação dos ani-
mais como um todo. Observou-se gran-
de divergência em alguns materiais,
oriundos da mesma localidade, indi-
Figura 4. Matriz de distância genética estimada pelo coeficiente de Jaccard para todos os indivíduos
analisados.
1
vA
2
vA
3
vA
4
vA
5
vA
6
vA
7
vA
8
vA
9
vA
1
vA
11
vA
21
vA
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Coefficient
cando, talvez, que houve aquisição
de animais de origens diversas, o que
pode ser importante para imprimir
maior variabilidade ao plantel, sendo
fundamental para o estabelecimento
de linhas de melhoramento genético
mais eficazes.
Conclusões
Os marcadores RAPD mostraram-
se eficientes para detectar
polimorfismo nesta espécie e podem
ser utilizados como uma poderosa fer-
ramenta na obtenção de informações
úteis para o manejo e o direcionamento
de programas de melhoramento ge-
nético.
Este estudo de diversidade gené-
tica permitiu a obtenção de informa-
ções úteis, entretanto, acredita-se que,
incluindo outras populações e outras
técnicas moleculares, pode-se obter
um quadro geral da diversidade na
espécie na região.
Agradecimentos
Os autores agradecem aos pro-
prietários das fazendas MARAVEST,
Drs. Pedro e Lécio Galleti (Imperatriz
– MA) e PERI-CIGANO, Dr. Luís No-
gueira (Tracuateua – PA) que estão
apoiando os trabalhos de pesquisa na
região e cederam o material biológico
para este trabalho.
Referências bibliográficas
BELLO N, SÁNCHEZ A: The
identification of a Sex-specific
DNA marker in the ostrich using a
random amplified polymorphic
DNA (RAPD) assay. Molecular
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MALAGÓ JR, W.; FRANCO, H.
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1990.
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 23
Estudo ecofisiológico sobre
Endomicorrizas
Solange Maria Costa de Amorim
Doutora, Professora Adjunta.
Laboratório de Ecofisiologia da Unidade
Experimental Horto Florestal da
Universidade Estadual de Feira de Santana-UEFS
samorim_maria@superig.com.br
samorim@uefs.br
Ana Claudia Borja Paim
Mestre, Bióloga - Centro Universitário de Cultura e
Arte da Universidade Estadual de Feira de
Santana-UEFS
anaclpaim@ig.com.br
Magnólia Góes Silva
Mestre, Bióloga
sqmagnolia@bol.com.br
Ilustrações cedidas pelos autores
Pesquisa
1. Introdução
Micorrizas são associação
mutualista presente na maior parte de
plantas vasculares e resultando desta
simbiose o incremento da absorção
dos elementos minerais, enquanto o
fungo obtém compostos de carbono
derivados da fotossíntese (Allen, 1992).
Desta forma, a planta tem acesso a
uma maior quantidade de água e de
elementos nutricionais do solo,
incrementa o seu crescimento e de-
senvolvimento, além de otimizar a sua
resistência aos estresses bióticos e
abióticos.
Nas últimas décadas, têm-se mul-
tiplicado as evidências do efeito bené-
fico das associações micorrízicas com
diversas plantas superiores de impor-
tância econômica. Na natureza, po-
dem ser encontrados diferentes tipos
de micorrizas: Arbutóide, Monotóide,
Ericóide, Endomicorriza, Ectomicorriza
e Orquidióide. Em algumas espécies
vegetais é tão acentuada a dependên-
cia à presença desses fungos que, na
ausência total da simbiose, não conse-
guem absorver os nutrientes necessá-
rios para a sua sobrevivência (Allen,
1992).
O presente artigo tratará sobre o
tipo Endomicorrizas, presente na mai-
oria das Angiospermas, nas suas hifas
penetram nas células, produzem
arbúsculos dentro das células coloniza-
das (estruturas responsáveis pela trans-
ferência bidirecional de nutrientes en-
tre os simbiontes, realizados na interfase
planta-fungo), podendo ou não for-
mar vesículas (estruturas globosas e
irregulares cuja função está associada
ao armazenamento de lipídios e açú-
cares).
Os fungos micorrizos arbusculares
são Zigomicetos da família
Endogonaceae que promovem o cres-
cimento das plantas e elevam o seu
potencial para a exploração comercial
em larga escala. Além de possuírem o
efeito comprovado como bio-regula-
dores de crescimento, biofertilidade e
biocontrole em plantas, sendo estes
muito importantes para o manejo e
aclimatação de várias espécies vege-
tais (Silveira, 1992).
A associação entre o desenvolvi-
mento vegetal e a atividade micorrízica
pode ser considerada, também, como
um fator importante na recuperação
dos solos degradados, pois mesmo
quando profundamente alterados, eles
podem manter uma comunidade
microbiana ativa. Os fungos
micorrízicos arbusculares (MA) ou
endomicorrizicos, por exemplo, têm
sido naturalmente encontrados nesses
solos alterados os fungos MA nativosFigura 1. Colonização micorrízica em raízes de Myracrodruon urundeuva Fr. All.
irrigadas diariamente em viveiro com sombrite, filtrando de 70 % da radiação solar.
O efeito do déficit hídrico sobre a colonização endomicorrízica em duas espécies vegetais típicas da região semi-árida do Nordeste
24 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
podem interferir na composi-
ção, na competição e na su-
cessão das comunidades ve-
getais (Bethlenfalvay, G.J.,
1992).
Embora a ocorrência de
micorrizas no reino vegetal seja
um fenômeno bastante co-
mum, o grau de dependência
das diferentes espécies de
plantas, através da associação
de fungos micorrízicos em suas
raízes, é bastante variável Cox
& Sanders (1980). Diferentes
trabalhos mostram a contribui-
ção das micorrizas em áreas de
revegetação que sofreram interferên-
cias antropogênicas e em muitos se
tem enfatizado a relevância desta rela-
ção simbiótica às variações das condi-
ções atmosféricas como temperatura,
chuvas, ventos e umidade (Chu et al.
2001; Taiz, 2000; Siqueira, 2002).
Esta experimentação objetivou
avaliar as relações entre a colonização
endomicorrízica em Myracrodruon
urundeuva Fr. All. (aroeira-do-sertão)
e Spondias tuberosa Arr. Cam. (umbu),
pertencentes à família Anacardeaceae,submetidas a diferentes condições tem-
porais de déficit hídrico.
2. Material e métodos
O estudo foi desenvolvido no
Laboratório de Ecofisiologia da Unida-
de Experimental Horto Flores-
tal da Universidade Estadual
de Feira de Santana – BA. As
plantas experimentais foram
obtidas a partir de cultivo sob
condições de viveiro com
sombrite, filtrando 70% da ra-
diação solar, onde foram sub-
metidas ao estresse hídrico
com dois meses de idade.
O material vegetal consti-
tuiu-se em duas espécies da
família Anacardiacea,
Myracrodruon urundeuva Fr.
All. e Spondias tuberosa, Arr.
Cam. de reconhecido potenci-
al econômico na região semi-
árida do Nordeste, cujas sementes fo-
ram obtidas no Centro de Pesquisa
Agropecuária do Trópico Semi-Árido-
CPATSA da Empresa Brasileira de Pes-
quisa Agropecuária-EMBRAPA.
No período de aplicação do défi-
cit hídrico, foram monitoradas as taxas
de transpiração, mg cm-2s-1 com a
utilização do porômetro de difusão
LICOR 1600C nos horários de 09:00 e
10:00 horas (aroeira) e 09:00, 11:00 e
13:00 horas (umbu) A suspensão do
déficit hídrico foi determinada pela
apresentação de alterações
fisionômicas como a coloração e dis-
posição foliares (Larcher, 2000) e fisi-
ológicas como a redução significativa
(quase nula) das taxas de transpiração
e para a aplicação do tratamento foi
instalada uma barreira de plástico cris-
tal transparente na mesa onde as mu-
das estavam sendo cultivadas (Paim,
2002; Silva, 2004).
Após a suspensão do tratamento
hídrico foi avaliada a colonização
endomicorrízica em amostras de raízes
de Myracrodruon urundeuva (aroeira-
do-sertão) e Spondias tuberosa
(umbu).As raízes foram clareadas com
hidróxido de sódio e água oxigenada
alcalina. Após a lavagem em água
corrente, acidificada com ácido clorí-
drico, e posteriormente, fo-
ram coloridas com azul de
algodão segundo as técnicas
de Phillips & Hayman (1970)
modificada por Grace &
Stribley (1991). Posterior-
mente, a colonização foi ava-
liada e abordada de modo
qualitativo (Carneiro et al.
1998) através de
fotomicrografia das lâminas
em microscópio NIKON. Para
a categorização quanto à co-
lonização, as amostras foram
classificadas em alta, média,
baixa e sem colonização, me-
diante a presença de hifas, arbusculos,
vesículas, células reprodutoras e
esporos.
O solo utilizado para o cultivo de
aroeira e do umbu foi da região de
Feira de Santana com textura franco-
arenosa, segundo a classificação do
Ministério da Agricultura – USA, e com
baixo teor de fósforo (4,8mg/dm3 de
P) segundo análise do Laboratório de
física e nutrição do solo do Centro
Nacional de Pesquisa de Mandioca e
Fruticultura – EMBRAPA.
3. Resultados e discussão
 Através de observações micros-
cópicas, pode-se registrar que a colo-
nização micorrízica ocorreu em todos
os tratamentos de irrigação, de acordo
com as condições experi-
mentais utilizadas, ou seja,
um viveiro (Figuras 1, 2, 3
e 4).
M y r a c r o d r u o n
urundeuva Fr. All. e
Spondias tuberosa Arr. Cam
apresentaram um incre-
mento na formação de
esporos intra-radiculares ao
serem aplicados os trata-
mentos de déficit hídrico
(Figura 3 e 4), embora te-
nha sido diferenciado o tem-
po de tolerância ao estresse
hídrico entre as duas espé-
cies vegetais em estudo
(sete dias em aroeira e nove dias em
umbu).
De acordo com Cavalcante et al.
(2001), a contribuição dos fungos
micorrízicos arbusculares é otimizada
em condição de cultivo sujeito à defi-
Figura 3. Colonização micorrízica em raízes de Spondias tubero-
sa Arr. Cam. irrigadas diariamente em viveiro com sombrite,
filtrando de 70 % da radiação solar.
Figura 2. Colonização micorrízica em raízes de Myracro-
druon urundeuva Fr. All. submetidas a sete dias de déficit
hídrico em viveiro com sombrite, filtrando de 70 % da radiação
solar.
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M
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SS
A
 
SE
CA
 
(g
)
AROEIRA UMBU
PARTE AÉREA 
RAIZ 
ciência hídrica, atribuindo-se o papel
preponderante da relação fungo-plan-
ta para a manutenção do crescimento
do vegetal sob estresse hídrico. Para
ambas espécies vegetais foram deter-
minadas intensidades da colonização
radicular média e alta para os trata-
mentos de irrigação diária e suspensão
de rega respectivamente.
Embora a colonização micorrízica
tenha sido semelhante entre as espé-
cies vegetais, neste estudo, constatou-
se que houve diferenças na produção
de massa seca entre aroeira e umbu
(Figura 5). Em Spondias, na qual hou-
ve um significativo incremento do
crescimento radicular, o efeito do tra-
tamento com déficit hídrico foi
potencializado.
Em aroeira, o déficit hídrico em
condições de cultivo, ocasionou o
comprometimento do desenvolvimen-
to inicial, embora beneficiadas pela
simbiose com fungos micorrízicos
arbusculares (Figura 5).
Estes resultados corroboram com
as considerações de Janos (1988) e
Koide (1991) relacionadas
ao grau de interação entre o
fungo-planta. A colonização
radicular pode sofrer altera-
ções, mas o seu potencial de
resposta à colonização pare-
ce ser uma característica in-
trínseca, de herança genéti-
ca relacionado às caracterís-
ticas morfológicas, fisiológi-
cas ou fonológicas do hos-
pedeiro, os quais controlam
a demanda e suprimento de
P, e, assim como, o grau de
dependência da planta.
Sob condições de déficit hídrico,
as raízes parecem atuar como “sensor
primário” que desencadeia, a partir de
seus carotenóides, a síntese e o
acúmulo endógeno de ácido abscísico
(ABA) que é transportado para dife-
rentes partes da planta. Nas folhas
atuam reduzindo a taxa transpiratória,
a condutância estomática e, conse-
qüentemente, a fotossíntese (Riccardi
et al. 1998; Medina et al., 1999 e
Larcher, 2000). Em aroeira e umbu,
foram observadas respostas temporais
ao déficit hídrico em amplitudes dife-
rentes (Figuras 6, 7 e 8). Neste estudo
com aroeira e o umbu pode-se sugerir
que a eficiência da colonização
micorrízica relacionou-se com o po-
tencial genético de cada uma delas.
O umbuzeiro é endêmico da re-
gião do semi-árido brasileiro, apresen-
ta características morfológicas como
raízes com parênquima armazenador
de água, glicose, amido, mucilagens
entre outros compostos que possibili-
tam a sua sobrevivência mesmo por
um período prolongado de seca, indi-
cando o seu elevado grau de ajusta-
mento ecológico.
Nas regiões onde ocorre a aroeira-
do-sertão é observado que a baixa
disponibilidade hídrica que se consti-
tui em fator limitante para o cresci-
mento inicial de muitas espécies ve-
getais inclusive, como observaram Sil-
va et al. (2001), nos meses mais quen-
tes do ano, a aroeira-do-sertão aumen-
ta o teor de carboidratos nos tecidos
foliares sugerindo que esta é uma
estratégia para garantir a sua sobrevi-
vência no período de seca.
4. Conclusão
Myracrodruon urundeuva
(aroeira-do-sertão) é menos tolerante
do que Spondias tuberosa (umbu) ao
déficit hídrico durante o seu desenvol-
vimento inicial em condições de culti-
vo.
O déficit hídrico incrementa o
crescimento das raízes micorrizadas
de umbu na fase inicial de crescimen-
to, refletindo o seu potencial genético
Figura 5 - Produção de massa seca da parte aérea e radicular em Myracrodruon
urundeuva (aroeira) e Spondias tuberosa (umbu) micorrizadas e submetidas ao déficit
hídrico.
Figura 6 - Medições da taxa de
transpiração (µg cm –1 s-1) com o
porômetro LICOR 1600 em plan-
tas de aroeira-do-sertão e umbu
micorrizadas submetidas ao dé-
ficit hídrico.
Figura 4. Colonização micorrízica em raízes de
Spondias tuberosa Arr. Cam. submetidas ao déficit
hídrico por nove dias em viveiro com sombrite,
filtrando de 70 % da radiação solar.
26Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
 
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controle déficit hídrico 
Figura 7 - Variação da taxa de transpiração (µg cm –1
s -1) em plantas de aroeira-do-sertão micorrizadas sub-
metidas ao déficit hídrico por sete dias.
Figura 8 - Variação da taxa de transpiração (µg cm –1
s -1) em plantas de umbu micorrizadas submetidas ao
déficit hídrico por nove dias.
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SUSPENSÃO DE IRRIGAÇÃO (DIAS)
TR
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SP
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controle déficit hídrico
em sobreviver em ambientes xéricos.
5. Referências bibliográficas
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TR
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ÃO
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A
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Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 27
CONTROLE BACTERIANO DE
EFLUENTES
Mariana Roberta dos Reis
Faculdade de Tecnologia de Sorocaba, FATEC,
Sorocaba; Departamento de Microbiologia e
Imunologia, Instituto de Biologia
Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP
marianarreis@aol.com
Elisabeth Pelosi Teixeira
Dra. Departamento de Saúde
Faculdade de Tecnologia de Sorocaba, FATEC
epelosi@uol.com.br
Wanderley Dias da Silveira
Ph.D.Departamento de Microbiologia e Imunologia,
Instituto de Biologia, Universidade Estadual de
Campinas, UNICAMP, Campinas.
wds@unicamp.br
Ilustrações cedidas pelos autores
Pesquisa
Introdução
aumento populacional, jun-
tamente com o crescimento
desordenado das cidades,
tem levado, paulatinamente, ao des-
gaste qualitativo e ao consumo
irreversível das fontes de abasteci-
mento, incluindo, aqui, as fontes
aqüíferas para consumo, uso domésti-
co e agricultura. O esgoto urbano bru-
to é resultante dos despejos domésti-
cos e industriais, o qual lançado num
manancial contribui para sua degrada-
ção, afetando sua qualidade (JORDÃO
et al., 1995).
Assim, com a finalidade de pou-
par as fontes naturais, a água já utiliza-
da por seres humanos para consumo
próprio, ou outras finalidades, deve
passar por processos de tratamento
que permitam a sua reutilização segu-
ra sem causar processos de morbidade
à saúde e/ou mortalidade.
A implantação de uma estação de
tratamento de efluentes (ETE) tem
por objetivo reduzir a carga
contaminante ou poluente das águas
residuárias, de modo que o efluente
final tratado possa retornar para o
corpo d’água, sem provocar a degra-
dação do meio e não causar riscos à
saúde do homem (BORSOI et al.,
2002; Von SPERLING, 1996).
O presente trabalho relata o uso
de bacteriófagos (fagos líticos), vírus
que lisam bactérias, como método
para a redução de número de unida-
des formadoras de colônias (UFC) de
bactérias potencialmente patogênicas
para os seres humanos e presentes em
estações de tratamento de esgotos
(ETE), com o objetivo de minimizar
possíveis processos de morbi-mortali-
dade causadas por essas mesmas bac-
térias quando da utilização da água
para consumo.
A principal vantagem de utilizar
fagos líticos como controle bacterioló-
gico, e ferramenta complementar em
tratamento de efluentes nas ETEs resi-
de na propriedade que eles possuem
de se replicarem apenas na presença
de seu hospedeiro específico, levan-
do à lise celular bacteriana com produ-
ção de novos fagos, os quais mantêm
seu ciclo de lise enquanto existirem
células bacterianas disponíveis para
sua replicação, o que deverá, teorica-
mente, levar a uma diminuição pro-
gressiva dos possíveis contaminantes
bacterianos presentes as ETEs (DAVIS
et al., 1973). Por outro lado, os mes-
mos fagos podem estar presentes den-
Figura 1: Curva de avaliação de morte celular bacteriana de Staphylococcus aureus
(Sa), determinada através da contagem de UFC. A: Curva controle contendo apenas
Sa. B: Curva Sa contendo fago não mutante. C: Curva Sa’ contendo fago mutante lítico
obrigatório. Os dados são médias de 2 repetições ± desvio padrão da média.
Gráfico: Mariana Roberta dos Reis
Controle biológico bacteriano e tratamento de efluentes através do uso de bacteriófagos
28 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento- Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
tro do genoma de sua célula hospedei-
ra, em estado quiescente ou profágico,
e não levar à lise celular dele. Por esse
motivo, a obtenção e utilização de
fagos mutantes que realizem apenas o
ciclo lítico para posterior utilização nas
ETEs é um objetivo que deve ser
alcançado.
Como dentro dos resíduos das
ETEs existem milhares de espécies
bacterianas diferentes, muitas das quais
potencialmente contendo um ou mais
fagos específicos, este trabalho teve
por objetivo selecionar fagos que pu-
dessem ser utilizados para o objetivo
acima e dentre esses, selecionar um
para a obtenção de mutante que obri-
gatoriamente realizasse apenas o ciclo
lítico.
Metodologia e resultados
Seleção de fagos
Para essa finalidade, suspensões
contendo material bruto de diferentes
ETEs (industriais, hospitalares e
municipais) foram coletados em
condições de assepsia, filtradas em
membranas Millipore de 0,2µm e o
sobrenadante resultante mantido em
condições de refrigeração (4°C). Um
volume de 200µL dessas suspensões
foi, a seguir, adicionadas a culturas
bacterianas líquidas purificadas
(Shigella flexneri, Shigella
sonnei, Klebsiella pneumoniae,
Salmonella typhimurium, Escherichia
coli , Streptococcus pyogenes,
Staphylococcus aureus) e mantidas
em cultivo (37°C) por 12 horas. A
seguir, os meios foram centrifugados e
os sobrenadantes armazenados entre
4°C e 8°C, após filtração. A confirmação
de fagos específicos na cultura de cada
uma das bactérias foi realizada através
do mesmo procedimento observando-
se agora, ou o não crescimento
bacteriano, ou a diminuição da turbidez
do meio de cultura líquido. A obtenção
de fagos purificados específicos foi
realizada através da metodologia
descrita por DAVIS et al., 1973 e a
observação do sobrenadante líquido
através de microscopia eletrônica
(PALMER, 1988). Posteriormente, cada
fago isolado em uma determinada
cultura bacteriana foi testado contra as
demais culturas para confirmar a sua
especificidade.
Obtenção de fago lítico mutante
obrigatório
Para isto, uma suspensão
bacteriana contendo Staphylococcus
aureus, com um bacteriófago em seu
interior, foi submetida ao tratamento
com luz ultravioleta (260nm) (5% de
sobrevivência de UFC/mL) e o
sobrenadante obtido, após filtração,
novamente testado contra essa cultura
bacteriana, usando-se como controle
uma cultura contendo essa bactéria e
a suspensão do fago não-lítico obriga-
tório. A seguir, após nova filtração, o
sobrenadante (300µL) foi adicionado a
200µL da cultura bacteriana receptora
e a mistura adicionada a 4mL de meio
LA semi-sólido e, então, incubada a
37°C por 30min, para haver a interação
do fago com a célula bacteriana. Esta
suspensão final foi, então, adicionada
sobre uma placa contendo 15mL de
meio LA (conforme metodologia des-
crita por SAMBROOK et al., 1989, com
modificações). Após incubar a 37°C
durante a noite uma placa de lise (a
que apresentou halo o mais translúcido
possível) foi retirada do ágar e adicio-
nada a uma cultura bacteriana em fase
exponencial de crescimento. Após
cultivo (37°C) por 12 horas e
centrifugação (12.000rpm), o
sobrenadante foi novamente filtrado e
mantido em estoque a 4°C.
 Utilização do fago lítico mutante
obrigatório no controle de
células bacterianas específicas
Suspensões fágicas, não mutante
e mutante, obtidas como descrito an-
teriormente, foram, separadamente,
adicionadas em culturas contendo
Staphylococcus aureus (1:1000) em
fase exponencial de crescimento
(5x106 UFC/mL) e alíquotas (100µL)
retiradas, diluídas seqüencialmente, na
razão 1:10, e semeadas em placas de
Petri contendo meio LA. Após cresci-
mento (37°C, 12h) as UFC/mL foram
determinadas.
Resultados e discussão
Assim, como há preocupação no
sentido de tornar pura a água captada
em rios, fontes ou poços, antes de
servi-la à população, também há pre-
ocupação quanto ao destino dos esgo-
tos sanitários, sabendo-se que o des-
pejo “in natura”, nos rios, tem conse-
qüências danosas à saúde das popula-
ções, ocorrendo, não raras vezes, uma
relação entre manifestações de doen-
ças de transmissão fecal-oral e a exis-
tência de focos de contaminação. Tal
situação, porém, pode ser minimizada
com o tratamento de esgotos sanitári-
os.
Há várias opções disponíveis para
tratamento de efluentes, que devem
ser avaliadas segundo critérios de via-
bilidade técnica e econômica, além de
adequação às características topográfi-
cas e ambientais da região. Depen-
dendo das necessidades locais, o trata-
mento pode se resumir aos estágios
preliminar, primário e secundário (COS-
TA, 2004).
No entanto, quando o lançamen-
to dos efluentes tratados se der em
corpos d’água importantes para a po-
pulação, seja porque deles se capta a
água para o consumo, seja porque são
espaços de lazer, recomenda-se tam-
bém o tratamento terciário caracteri-
zados pelo uso de hipoclorito de sódio,
ozonização, luz ultravioleta, etc.
(LINSLEY et al., 1992).
A abundância e a importância
ecológica dos vírus nos meios aquáti-
cos têm sido atestadas com o aumento
do número de estudos voltados para
eles. Segundo TEDIASHVILI et al.,
2003, os fagos apresentam um papel
importante no controle da densidade
e diversidade da população bacteriana
no meio. Eles também são considera-
dos indicadores naturais da população
microbiológica do efluente.
Neste trabalho, procuramos obter
fagos que pudessem ser utilizados
como tratamento complementar, aos
já disponíveis, para a diminuição do
número de bactérias potencialmente
patogênicas presentes em ETEs. Para
isso, a primeira etapa foi a obtenção
de bacteriófagos a partir da água de
diferentes ETEs sendo obtidos fagos
com capacidade de lise de todas as
amostras bacterianas estudadas, a mai-
oria dos quais com especificidade para
uma determinada bactéria utilizada
como hospedeiro. A exceção a esse
comportamento foi um bacteriófago,
isolado em Shigella flexneri, que tam-
bém apresentou capacidade de lise de
Shigella sonnei e Escherichia coli.
Existem muitos estudos com efei-
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 29
tos da luz UV em diferentes microrga-
nismos (ANGEHRN, 1984;
MASSCHELEIN, 2002; OPPENHEIMER
et al., 1993). Lâmpadas UV emitem
radiação num comprimento de onda
entre 240-260nm, comprimento de
onda no qual o ácido nucléico absorve
a energia (ANGEHRN, 1984). A luz UV
causa mutação através da formação de
dímeros de pirimidinas nas bases
nitrogenadas existentes ao longo da
cadeia de DNA (MASSCHELEIN, 2002).
Assim, o uso dessa luz pode causar
mutação nos genes responsáveis pela
manutenção adequada do vírus no
estado de profago e liberar vírus que
possuam apenas a capacidade lítica.
Dessa maneira, entre todos os
fagos específicos que foram isolados,
e com a finalidade de simplificar os
resultados obtidos, utilizamos aqueles
originários de Staphylococcus aureus
para a irradiação com luz UV e obten-
ção de fagos líticos obrigatórios.
Verificou-se que, após irradiação
para a determinação da dose letal que
levava à sobrevivência de 5% das
UFC/mL (7,75 x 105 UFC/mL), um
elevado número de placas de lise em
cultura sensível (Staphylococcus
aureus).
No teste realizado “in vivo”, os
fagos mutantes líticos obrigatórios de
Staphylococcus aureus foram utiliza-
dos, sendo obtida uma diminuição do
número de UFC/mL de 55,4% do cres-
cimento bacteriano, em relação ao
controle A utilizado.
Uma diminuição maior do núme-
ro de UFC/mL pode não ter sido obtida
devido à provável existência da pre-
sença de bacteriófagos integrados ao
genoma de uma parcela da população
da bactéria hospedeira, Staphylococcus
aureus, o que torna essas bactérias
imunes à lise fágica (LEWIN, 1987).
Isso, porém, não inviabiliza nossos
resultados, pois diferentes tipos de
fagos líticos obrigatórios, específicos
para a bactériahospedeira, podem ser
selecionados e utilizados com o pro-
pósito de provocar o aumento da lise
bacteriana, minimizando, assim, a pos-
sível presença de fagos em estado
profágico.
Nosso trabalho demonstra que
fagos líticos obrigatórios podem ser
obtidos a partir de fagos não mutantes,
pré-existentes, como já descrito na
literatura (NAKASHIMA et al., 1998) e
que o uso deles em uma cultura celular
“in vivo” pode levar a uma diminuição
no número de unidades formadoras de
colônias e, consequentemente, dimi-
nuição do número de bactérias
patogênicas presentes em uma deter-
minada ETE.
Dessa maneira, sugerimos que o
uso de fagos líticos específicos pode
ser obtido para qualquer tipo
bacteriano, inclusive aqueles
patogênicos presentes no esgoto bru-
to, e que o uso deles pode ser utilizado
de maneira complementar àqueles já
preconizados em estações de trata-
mento de águas residuais. Outrossim,
suspensões contendo diferentes fagos,
para diferentes espécies bacterianas,
poderiam ser utilizados para tal finali-
dade, levando a uma diminuição glo-
bal de prováveis patógenos.
Conclusão
Os resultados aqui obtidos de-
monstram que o isolamento de fagos
específicos pode ser realizado a partir
de fagos presentes em águas residuais
obtidas a partir de estações de trata-
mento de esgotos.
A partir destes isolados de fagos
podem ser obtidos fagos líticos obriga-
tórios, de maneira prática, rápida e de
baixo custo.
Os fagos líticos podem ser utiliza-
dos de maneira complementar aos
métodos já existentes para a diminui-
ção do número de bactérias patogênicas
presentes em uma determinada esta-
ção de tratamento, o que torna esse
tratamento mais eficiente e, portanto,
a água a ser liberada dela com menor
potencial patogênico.
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30 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
Pesquisa
Produção de Esferas
de QUITOSANA
Rejane Celi Goy, MSc
PPG Interunidades em Ciência e Engenharia de
Materiais - Universidade de São Paulo - USP
São Carlos, SP.
rejanegy@terra.com.br
Odilio B. G. Assis, Dr.
Embrapa Instrumentação Agropecuária
São Carlos, SP.
odilio@cnpdia.embrapa.br
Sérgio P. Campana-Filho, Dr.
Instituto de Química de São Carlos - IQSC
Universidade de São Paulo - USP
São Carlos, SP.
scampana@iqsc.usp.br
Ilustrações cedidas pelos autores
Introdução
A quitina é um polissacarídeo
extremamente abundante na nature-
za, perdendo somente para celulose
em disponibilidade. Pode ser encon-
trada em diversos organismos como
em insetos e crustáceos, sendo o prin-
cipal constituinte das cascas de cama-
rão e das carapaças de caranguejo. A
quitosana também é um polissacarídeo
que ocorre naturalmente em alguns
fungos, mas que geralmente é obtido
pela desacetilação da quitina, uma
reação que pode ser executada em
diferentes condições empregando di-
ferentes alcalis. Entretanto, a execu-
ção da reação de desacetilação de
quitina em temperaturas elevadas e
empregando soluções concentradas
de NaOH é o método mais usual para
a obtenção de quitosana (Campana &
Desbrières, 2000).
A quitosana pode ser definida
como um copolímero de 2–amino-2–
desoxi–D–glicopiranose e 2–
acetamido–2–deoxi–D–glicopiranose,
de composição variável em função do
grau residual de acetilação, cujas uni-
dades também estão unidas por liga-
ções β (1→4) (Figura 1). O termo
quitosana é usado para identificar
copolimeros contendo mais de 50% a
60% de unidades desacetiladas, en-
quanto quitina corresponde a produ-
tos muito mais acetilados. Como con-
seqüência de seus diferentes conteú-
dos de unidades acetiladas, quitina e
quitosana possuem diferentes graus
de solubilidade, sendo que quitina é
insolúvel na maioria dos solventes,
enquanto a quitosana é solúvel em
soluções aquosas de ácidos orgânicos
e inorgânicos.
As características e propriedades
de quitosanas comerciais variam de
acordo com os fatores do processo de
manufatura. Tais propriedades inclu-
em grau de pureza, solubilidade, vis-
cosidade, grau de desacetilação, mas-
sa molecular e a capacidade de
interagir com diferentes substâncias. A
habilidade de adsorver metais, por
exemplo, depende do processo de
hidrólise dos grupos acetamido. As-
sim, a desacetilacao homogênea de
quitina resulta em quitosana com mai-
or capacidade de adsorção do que
aquela preparada por processo hete-
rogêneo, ainda que os polímeros te-
nham o mesmo grau de acetilação (Li,
1992).
De fato, uma das mais importan-
tes propriedades da quitosana é a de
agir como quelante (Li, 1992), pois
esta pode se ligar seletivamente a
substâncias como o colesterol, gordu-
ras, proteínas, células tumorais, e tam-
bém a íons metálicos, o que tem
originado sua exploração em diversas
aplicações nos últimos vinte e cinco
anos (Mathur, 1990; Roberts, 1992;
Kurita, 1986). A capacidade da
quitosana em interagir fortemente com
íons metálicos dissolvidos em meios
aquosos é consideravelmente superi-
Figura 1: Representação esquemática da estrutura primária idealizada de
quitosana, sendo n = grau de polimerização.
Meio para interação com metais em fase aquosa
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 31
or à apresentada pela quitina. Contu-
do, sua aplicação em processos de
descontaminação fica limitada a
efluentes de baixa acidez (pH > 6-7),
considerando que a quitosana é solú-
vel em meios de acidez moderada a
forte, o que impede, ou pelo menos
dificulta, sua utilização na forma de
filtros, membranas ou colunas (Roberts,1992; Li, 1992; Kurita, 1986). As alter-
nativas viáveis para estender as possi-
bilidades de emprego de quitosana
como quelante de íons metálicos a
uma faixa mais ampla de pH são: i) a
introdução de substituintes acila porta-
dores de cadeias relativamente longas
(Guibal, 1997); ii) a introdução de
substituintes quelantes , como grupos
aldeídos (Peter, 1995) e iii) o estabe-
lecimento de um certo número de
entrecruzamentos ou ligações
covalentes intercadeias (Kurita, 1986;
Guibal,1997; Koyama, 1986; Goy et
al., 2002).
Algumas aplicações de
quitosana
A produção industrial e o uso de
quitina e seus derivados, principal-
mente a quitosana, encontra-se em
constante crescimento. Os principais
fatores para este interesse podem ser
atribuídos a: i) abundância de matéria-
prima; ii) possibilidade de utilização
de rejeitos fartos e de baixo custo
oriundos da indústria pesqueira e iii)
volume de pesquisas confirmando e
ampliando continuamente o potencial
de aplicação desses materiais. A Tabe-
la 1 exemplifica de forma sucinta algu-
mas áreas nas quais a quitosana tem
sido aplicada, sendo a medicina e
biotecnologia os campos mais investi-
gados.
Esferas de quitosana e
entrecruzamento
Quitosanas no formato de esferas
e microesferas têm sido produzidas e
amplamente empregadas em diver-
sas áreas de biotecnologia, principal-
mente como veículos de transporte e
liberação de drogas ou substâncias no
organismo (Genta, 1998; Josué, 2000).
Trabalho recente (Chiou & Li, 2003)
também relata o seu uso como meio
de interação e remoção de tintas pre-
sentes em efluentes industriais. O for-
mato esférico é preferencialmente
desejado por apresentar a vantagem
de uma melhor caracterização superfi-
cial, permitindo o estabelecimento de
parâmetros geométricos úteis para
reprodutibilidade do processo e para
comparações, além de aspectos como
otimização de empacotamento em
reatores e dispositivos de filtração.
Indústrias têxteis, de papel, cou-
ro, plásticos, etc, invariavelmente ge-
ram quantidades de efluentes que pre-
cisam de tratamento adequado e a
quitosana presta-se a essa aplicação
por sua alta capacidade de adsorção.
Os agentes usualmente utilizados em
escala industrial para a adsorção de
tintas apresentam capacidades de re-
moção que podem variar de 50g/Kg a
até 600kg/Kg. Contudo, a capacidade
de adsorção pode ser elevada para
valores próximos de 1000g/kg-1100g/
kg quando quitosana é empregada
como composto coadjuvante (Chiou,
2003). Essa capacidade deve-se a
protonação dos grupos amino da
quitosana em solução ácida, facilitan-
do assim a interação eletrostática com
as cargas negativas dos corantes e
pigmentos presentes nas tintas. Como
em pH baixo a quitosana pode se
dissolver, o entrecruzamento das suas
cadeias tem sido sugerido para tornar
o polímero mais estável e para facilitar
a sua recuperação. Diversos reagentes
entrecruzantes bifuncionais podem ser
aplicados, contudo, o glutaraldeído é o
mais empregado.
Nesse sentido, Koyama e colabo-
radores, 1986, compararam o compor-
tamento de quitosanas solúveis e
quitosanas homogeneamente
entrecruzadas com glutaraldeído no
que diz respeito à adsorção de íons
cobre numa ampla faixa de pH. Ob-
servaram que o entrecruzamento das
cadeias de quitosana diminuiu a
cristalinidade do polímero, contribuin-
do para aumentar a capacidade de
adsorção de íons cobre. Constataram
também que a razão molar grupos
aldeído (do glutaraldeído) / grupos
amino (da quitosana) empregada na
reação de entrecruzamento exerce
forte influência sobre a capacidade de
adsorção do material resultante. En-
quanto a quitosana original adsorveu
cerca de 74% de íons Cu2+, este valor
elevou-se para 96% quando foi utiliza-
da a quitosana entrecruzada empre-
gando razão aldeído/amino=0,7/1.
Porém, foi observado que a utilização
de excesso de glutaraldeído resultava
em diminuição da capacidade de
adsorção diminuía. O aumento inicial
na capacidade de adsorção foi atribu-
ído ao aumento da hidrofilicidade do
material e a maior acessibilidade aos
grupos quelantes resultante da des-
truição parcial da estrutura cristalina da
quitosana causada pelo seu
entrecruzamento. Por outro lado, a
subseqüente diminuição da capacida-
de de adsorção foi atribuída ao aumen-
to da hidrofobicidade do material e
devido a formação das bases de Schiff.
Assim, pode ser concluído que o grau
de entrecruzamento deve ser
otimizado para garantir a insolubilidade
do polímero sem entretanto diminuir
sua capacidade de interação. Alem
disso, o grau de entrecruzamento deve
se adequar a aplicação, levando-se em
consideração a massa molar da
quitosana e a acidez do meio em que
Figura 2: Gotejamento manual da
solução de quitosana com seringa de
insulina.
Figura 3: Esferas em processo de neutraliza-
ção de pH.
32 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
estará interagindo.
Obtenção de quitosana a
partir da quitina
Neste estudo, quitina comercial
extraída de cascas de caranguejo
(Sigma; lote no 84H7175, C-7170), foi
empregada para a preparação de
quitosana. Para a execução da reação
de desacetilação de quitina, adotou-se
a seqüência estabelecida por Horton
& Lineback, 1965, sendo a quitina
triturada e então suspensa em solução
aquosa de NaOH (40%), sob agitação
mecânica constante a temperatura de
115 ± 2oC. A reação prosseguiu nessas
condições por 6 horas. O meio reacional
foi então filtrado e o precipitado abluído
com água destilada até a neutralidade,
sendo em seguida lavado com metanol.
O precipitado foi transferido para uma
placa de Petri e seco à temperatura
ambiente.
Purificação da quitosana
Embora não seja um procedimen-
to estritamente necessário nas aplica-
ções industriais, a quitosana pode pas-
sar por um processo de purificação
para a remoção de sais remanescentes
da desacetilação (principalmente
acetato de sódio), impurezas e mate-
riais insolúveis (principalmente quitina
insuficientemente desacetilada). As-
sim, a purificação disponibiliza mais
grupos polares, aumentando a capaci-
dade de interação (Assis, et al., 2004).
Como procedimento de purificação
adotou-se a seqüência proposta por
Signini & Campana-Filho, 2001, ou
seja, dissolveu-se 1,0g de quitosana
lentamente em 300mL de ácido acético
(0,5M), mantendo a suspensão resul-
tante sob agitação contínua por apro-
ximadamente 24 horas a temperatura
ambiente. Após este período a solu-
ção foi seqüencialmente filtrada sob
pressão positiva através de uma série
de membranas com tamanhos de po-
ros decrescentes (8,0µm, 5,0µm,
0,8µm e 0,45µm) para remoção de
frações insolúveis e géis. O material
filtrado foi neutralizado com NH
4
OH
concentrado provocando a precipita-
ção da quitosana. O precipitado foi
separado do sobrenadante por filtra-
ção e então lavado exaustivamente
com água destilada, seguido de imersão
em metanol e secagem a temperatura
ambiente.
Preparação das esferas
Três metodologias podem ser
empregadas para a obtenção de esfe-
ras de quitosana com dimensões con-
troladas: i) Por coagulação, na qual a
quitosana é dissolvida em meio ácido
e gotejada sobre um banho alcalino
coagulante para formação das esferas;
o entrecruzamento é executado após
a obtenção e neutralização das esferas;
ii) Por inversão de fases, sendo as
microesferas obtidas in situ pela disso-
lução da quitosana em meio ácido
contendo o agente de
entrecruzamento e dispersão da fase
aquosa em uma fase oleosa de manei-
ra a obter materiais insolúveis e, iii)
Pela técnica de spray-drying, na qual a
quitosana purificada é dissolvida em
meio ácido e a esta é adicionado o
agente entrecruzante. A solução é então
sugada por uma bomba peristáltica e
as microesferas são formadas pela ação
de ar comprimido que “interrompe” o
fluxo e promove a formação das esfe-
ras.
A técnica mais simples é, semdúvida, a de coagulação em meio
alcalino pelo gotejamento do
polissacarídeo dissolvido em ácido e
que foi aqui adotada. Assim, cerca de
1,5g de quitosana purificada foram
dissolvidas em 37,5mL de solução de
ácido acético 5% (m/v). A solução
obtida, extremamente viscosa, foi go-
tejada manualmente com o auxílio de
uma seringa sobre solução de hidróxido
de sódio concentrado (2,5M), o que
provoca a imediata coagulação do gel
Tabela 2: Viscosidades intrínsecas ([η]), constantes de Huggins (k
H
), massas molares
médias viscosimétricas (
vM ) e graus médios de acetilação ( GA ) da quitosana.
seõçacilpA solpmexE
augáedotnematarT
aarapetnalucolfetnegaomoc;oãçaleuqadsévartasocilátemsnoíedoãçomeraN
eoãçacifiralc;sadicibrehesetnaroc,saníetorpomocsaicnâtsbusedoãçanimile
.anasotiuqesabasanarbmemedritrapaoãçartlif
lepapeaploP
azerudaratnemuaededadilanifamocsacisólulecseicífrepusedotnematartoN
oaetnetsiseretnalosilepapedoãçnetboan;ohlirbodoãçaretlames
sedadeirporpsaravelearapocifárgotoflepapmeosuon;otnemicehlevne
.sacitátseitna
aigoloncetoibeanicideM
salulécedetabmocon;loretselocoartnocanasotiuqodnetnocseõçalumrofmE
edsetneledoãçaraperpan;aimecueladotnematartonomoc,sanegírecnac
etnalugaocitnaetnegaomoc;esiláidarapsanarbmemedoãçudorpan;otatnoc
sarefseorcimedoãçacirbafanesetnegiletnisovitarucedoãçudorpan;oeníügnas
.sagordedadalortnocoãçarebilarap
socitémsoC siamedeazepmiledsemercme;upmaxmeamogedsarbosedoãçomeraN
.olebaceelepedsotnematartedsotsopmoc
earutlucirgA
edotnemassecorp
sotnemila
edoãçomeran;sognufedoãçibiniaarapetnemesadeicífrepusanotnematartoN
saicnâtsbuseonetorac-b,sodilósedoãçomeran;socirtícsocusmesetnaroc
sarutrebocmeesohnivedoãçacifiralcan;aruonecedeãçamedsocusedsadicá
.soturfarapsarotetorpsievítsemoc
Tabela 1: Algumas aplicações da quitosana (Sanford, 1988, Laranjeira, 1995; Jameela,
1995; Gupta, 2000; Assis et al., 2003).
Figura 4: Esferas de quitosana: (a) sem entrecruzamento e (b) após entrecruzamento
com glutaraldeído (sem escala).
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 33
em formato esférico, Figura
2. A altura do gotejamento,
as características da seringa e
da viscosidade (concentra-
ção) são parâmetros funda-
mentais que devem ser ob-
servados para a
reprodutibilidade do proces-
so.
As esferas coaguladas fo-
ram mantidas na solução al-
calina por 16 horas, filtradas e
lavadas abundantemente
com água destilada até o
equilíbrio do pH da água de
lavagem (Figura 3). Após esta
etapa as esferas foram dividi-
das em três frações para a
obtenção de dados compara-
tivos: (a) parte das esferas foi
submetida à reação de
entrecruzamento com
glutaraldeído, (b) parte foi
seca a temperatura ambien-
te sem entrecruzamento e
(c) uma fração, não
entrecruzada, congelada em
nitrogênio líquido e liofilizada.
O entrecruzamento con-
sistiu na reação de quitosana
com solução aquosa conten-
do o agente entrecruzante
durante uma noite. A concentração do
glutaraldeído foi fixada em 2,5% e a
razão entre glutaraldeído e quitosana
foi de aproximadamente 15mL/g. Após
o tempo de reação as esferas foram
exaustivamente lavadas com água
destilada, sendo a água de lavagem
testada com reagente de Feder (Morita
& Assumpção,1995) até que o
sobrenadante aparecesse isento do
aldeído.
Características das esferas
As principais características da
quitosana obtida pela desacetilação da
quitina comercial estão apresentadas
na Tabela 2. Os dados caracterizam
um material com alto grau de
desacetilação (em torno de 90%) e
média massa molar.
Os valores das constantes de
Huggins encontrados demonstram que
as soluções são de boa qualidade,
embora esses valores não sejam
indicativos definitivos que não possu-
am agregados. Para uma comprova-
ção final seria necessário a utilização
de demais técnicas complementares
como a cromatografia de permeação
em gel e métodos de espalhamento
de luz, para obter evidências definiti-
vas.
Relativamente às esferas, o
entrecruzamento com glutaraldeído
modifica o aspecto visual do material,
introduzindo alteração da cor, tenden-
do a amarelo, Figura 4.
O caráter hidrofóbico da quitosana
entrecruzada é plenamente compro-
vado por testes de solubilidade, assim
como alterações, não apenas na colo-
ração, mas na morfologia podem ser
melhor observadas por microscopia
eletrônica. A Figura 5 apresenta as
micrografias das esferas nas condições
avaliadas.
Pelas micrografias pode ser ob-
servado que no caso das esferas secas
à temperatura ambiente e sem
entrecruzamento (Figura 5 (a) e (b))
não há a ocorrência de poros em sua
superfície e as esferas possuem diâ-
metro de aproximadamente 800µm.
Após o entrecruzamento
observa-se a formação de
pequenas estruturas granu-
lares uniformemente distri-
buídas na superfície, origi-
nalmente não rugosa. Cons-
tata-se, contudo, que o
entrecruzamento não gera
poros na superfície, preser-
vando praticamente as di-
mensões originais das esfe-
ras antes do reticulamento.
A condição que mais se di-
ferencia é a da liofilização
(Figuras 5 (e) e (f)), em que
a esferas apresentam maior
diâmetro (≅2x103µm ou
2µm) e superfície altamen-
te porosa, caracterizando
uma estrutura do tipo es-
ponja.
A ocorrência de poros
na superfície das esferas não
é uma característica indese-
jável, pelo contrário. De
fato, esta característica pode
se tornar um fator determi-
nante na interação do polis-
sacarídeo com o meio, con-
siderando que quanto maior
a área superficial melhor
será sua interação
 e conseqüentemente a capacidade
de adsorver metais.
Testes de interação com Cu2+
em meio aquoso
Para avaliar a interação dessas
esferas com íons Cu2+ foram realizados
testes simples nos quais 50 mg de
esferas (isoladamente em cada condi-
ção) foram mantidas em solução aquo-
sa de CuCl
2
 (50 mg) sob agitação
constante por três dias, pH≅5,3 e tem-
peratura média de 25oC. Após este
período o sobrenadante foi removido
e analisado quanto ao conteúdo de
íons cobre por espectroscopia de ab-
sorção atômica, sendo os resultados
apresentados na Tabela 3.
Como pode ser constatado pelos
dados acima, a presença de poros nas
esferas parece ser um fator funda-
mental para promover a adsorção dos
íons de cobre. De fato, as esferas
liofilizadas, que possuem superfícies
porosas conforme constatado por
microscopia eletrônica de varredura,
Figura 5: Fotomicrografias das esferas de quitosana obtidas por
MEV: (a) esfera seca a temperatura ambiente; (b) idem a (a),
características da superfície; (c) esfera entrecruzada com glut-
araldeído; (d) idem a (c), aspecto superficial; (e) esfera liofiliza-
da e superfície resultante (f).
34 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
apresentaram capacidade de remoção
de íons cobre muito superior àquelas
exibidas pelas esferas de quitosana,
entrecruzadas ou não. Assim, tal fato é
atribuído a maior acessibilidade dos
íons cobre aos sítios quelantes (grupos
amino) da quitosana. Por outro lado, a
menor capacidade de interação exibi-
da pelas esferas entrecruzadas de
quitosana deve ser atribuída ao esta-
belecimento de ligações entrecruzadas,
as quais se formam por reação dos
grupos amino de quitosana com molé-
culas de glutaraldeído. Assim, o consu-
mo de grupos amino na reação de
entrecruzamento é responsável pela
menor capacidade de quelação das
esferas entrecruzadas, pois uma me-
nor quantidade de sítios quelantes fica
disponível para a interação com os
íons cobre presentes na solução.
Cabe salientar, entretanto, que
esses resultados se referem a uma
condição físico-químico especifica, i.
e., os experimentos de interação fo-
ram realizados em pH=5,3 e, conside-
rando que o grau de intumescimento
dos materiais à base de quitosana é
função do pH, assim como a especiação
dos íonscobre também depende da
acidez do meio, outras condições de-
vem ser investigadas para permitir
uma comparação mais abrangente
entre esses materiais.
Embora as esferas entrecruzadas
adsorveram uma menor quantidade
de íons, cabe salientar que as análises
aqui apresentadas foram conduzidas
em pH da água destilada, no qual
nenhum dos materiais é solúvel. Para
pHs mais ácidos os resultados eviden-
temente serão diferentes, em decor-
rência da insolubilidade do material
entrecruzado.
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Tabela 3: Quantidades de moles de íons Cu2+ remanescentes nas soluções e a
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entrecruzadas e liofilizadas.
artsomA uCedseloM
+2 setnecsenamer
oãçulosan
edoãçomeR
uCsnoí +2 )%(
adazurcertne-oãnarefsE 01x96,6 5- 34
adazurcertnearefsE 01x20,9 5- 32
adazilifoilarefsE 01x30,1 6- 19
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 35
Pesquisa
Quorum sensing
em sistemas agrícolas
Norma Gouvêa Rumjanek
PhD, Química Farmacêutica, Pesquisadora
Embrapa Agrobiologia
norma@cnpab.embrapa.br
Mônica Cristina Cardoso da Fonseca
Dra., Fitotecnica, Analista ambiental, IBAMA
monica.fosenca@ibama.gov.br
Gustavo Ribeiro Xavier
Dr., Ciência do Solo, Pesquisador
Embrapa Agrobiologia
gustavo@cnpab.embrapa.br
Ilustrações cedidas pelos autores
Introdução
Bactérias tradicionalmente defi-
nidas como seres unicelulares de es-
trutura celular procarionte podem atu-
ar de maneira multicelular quando um
determinado nível populacional críti-
co é atingido. A percepção da densida-
de celular resulta de uma comunica-
ção intercelular mediada pela secre-
ção de sinais moleculares sintetizados
pelas células individuais. Estas molé-
culas são detectadas por receptores
específicos o que permite as células
bacterianas “tomarem conhecimento”
do tamanho da população através da
concentração dos sinais, e quando o
nível crítico é atingido elas passam a
agir em grupo como um único organis-
mo multicelular. Este nível crítico ca-
racteriza, como no caso de uma as-
sembléia, um “quorum” onde as ações
passam a ser tomadas em conjunto.
O comportamento coletivo pode
ser vantajoso, como por exemplo, a
migração para ambientes mais
satisfatórios com melhor oferta de nu-
trientes e, a adoção de novos modelos
de crescimento, tais como, esporulação
ou formação de biofilmes, que propi-
ciam proteção contra efeitos deletéri-
os do ambiente. Como os microrganis-
mos apresentam uma diversidade me-
tabólica e são capazes de ocupar todos
os nichos onde a vida é
termodinamicamente possível, as van-
tagens advindas da atuação de bacté-
rias como organismos multicelulares
interessam a diferentes áreas do co-
nhecimento, entre elas, a medicina e a
agronomia, onde a natureza do com-
portamento celular pode resultar na
formação de simbioses e associações
benéficas, ou adversas, causando es-
tados patogênicos através da regulação
de fenótipos específicos.
Os sinais moleculares, também
chamados de auto-indutores ou
feromônios, regulam genes específi-
cos que caracterizam o comportamen-
to multicelular propiciando desta ma-
neira a exploração do ambiente de
maneira muito mais eficiente do que
seria possível a células individuais.
Densidades populacionais muito bai-
xas de estirpes patogênicas, por exem-
plo, teriam uma chance limitada de
superar os sistemas de defesa de um
hospedeiro (animal ou vegetal) e pro-
mover com sucesso um ataque a este
organismo. Neste caso, um retarda-
mento na expressão dos fatores de
virulência pelo agente patogênico até
o momento que fosse atingido um
número suficiente de células pode ser
uma estratégia altamente interessan-
te, uma vez que o sistema de defesa
do organismo só seria ativado quando
a situação estivesse mais favorável ao
agente patogênico. De modo similar,
bactérias benéficas responsáveis pela
fixação de nitrogênio podem empre-
gar este mecanismo para otimizar a
formação de nódulos nas raízes das
plantas. Bactérias capazes de produzir
substâncias antagonistas que atuam
como agentes de biocontrole, matan-
do ou inibindo a proliferação de mi-
crorganismos fitopatogênicos, também
se beneficiam do mecanismo de per-
cepção do “quorum”. Neste caso, as
substâncias antagonistas são produzi-
Comportamento multicelular em procarioto via comunicação intercelular
36 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
das apenas quando uma densidade
populacional crítica da bactéria é atin-
gida reduzindo as chances de apareci-
mento de formas de resistência do
patógeno o que dificultaria o controle
destas populações.
“Quorum sensing”
“Quorum sensing” (QS) é o me-
canismo de comunicação através do
qual bactérias regulam a expressão de
conjuntos de genes especializados em
resposta à densidade celular (Cha et
al., 1998). Hardman et al. (1998) refe-
rem-se a QS como um exemplo de
comportamento multicelular em
procariotos que regula diversos pro-
cessos fisiológicos,incluindo
bioluminescência, biossíntese de anti-
bióticos, transferência de plasmídeos
por meio de conjugação e produção
de fatores de virulência em patógenos
de plantas e animais. A percepção do
“quorum” é capaz, também, de pro-
mover a diferenciação multicelular,
desenvolvimento de corpos de
frutificação e esporulação, assim como
a ativação de processos de metabolis-
mo secundário. A formação de biofilmes
também tem sido considerada uma
resposta ao mecanismo de QS. McLean
e colaboradores (1997) detectaram a
presença de sinais moleculares so-
mente sobre extratos de rochas
submersas onde havia a formação de
biofilmes aquáticos. Nos extratos obti-
dos de rochas sem biofilmes estes
sinalizadores estavam ausentes.
Os auto-indutores são moléculas
pequenas produzidas pelas células
bacterianas. Estas moléculas atraves-
sam as células, algumas vezes por
simples difusão, e se acumulam no
ambiente em quantidade proporcio-
nal ao crescimento celular. Por meio
do mecanismo de QS, a bactéria é
capaz de detectar a concentração de
auto-indutores, e desta maneira per-
ceber o tamanho da população. A
partir de uma determinada concentra-
ção limite dos auto-indutores, estes
sinais servem de co-indutores e pas-
sam a regular a transcrição de genes-
alvo sendo que os produtos de trans-
crição garantem, presumivelmente,
alguma vantagem para a célula
bacteriana nesta condição particular
(Figura 1).
Estudos in vitro têm mostrado
que as bactérias utilizam uma grande
variedade de sinalizadores, inclusive o
estado nutricional e a densidade
populacional, para perceber e respon-
der ao meio biótico (Gray, 1997; Wirth,
2000).
Histórico
Os estudos sobre QS foram inici-
ados no fim dos anos 60. Kenneth H.
Nealson e Jonh Woodland Hastings e
colaboradores (Nealson et al., 1970;
Nealson, 1977) observaram uma ca-
racterística peculiar na bactéria Gram-
negativa, simbiótica, luminescente
Vibrio fischeri (também citada como
Photobacterium fischeri) que coloni-
za órgãos luminosos especializados de
certos peixes e cefalópodos, como a
lula (Euprymna scolopes). Esta coloni-
zação garante uma bioluminescência
ao organismo e desempenha um pa-
pel na atração da presa ou na camufla-
gem. Esses pesquisadores descobri-
ram que a bactéria V. fischeri, que
coloniza a lula, é capaz de proporcio-
nar invisibilidade ao seu hospedeiro. À
noite, quando a lula se alimenta, a
luminescência proveniente dos órgãos
aruturtsE lacidaR alumróF omsinagrorciM
HC 3 LSH-4C
,asonigureasanomoduesP
.pssanomoreA
HC 3 HC( 2)2 LSH-6C muiretcabomorhC muecaloiv
HC 3 )2HC( 4 LSH-8C aicapecairedlohkruB
HC 3 HC( 2)6 LSH-01C imehtnasyrhcainiwrE
HC 3 HC( 2)5 HC(HCHC 2)3 LSH-41C-sic-7 sedioreahpsretcabodohR
HC 3 HC( 2)2 LSH-6C-oxo-3 ,irehcsifmuiretcabotohP
.psainisreY
HC 3 HC( 2)4 LSH-8C-oxo-3 muiretcaborgA sneicafemut
HC 3 HC( 2)6 LSH-01C-oxo-3 muraliugaoirbiV
HC 3 HC( 2)8 LSH-21C-oxo-3 asonigureasanomoduesP
HC 3 LSH-4C-ordih-3
,iyevrahoirbiV
sudbahroneX
sulihpotamen
HC 3 HC( 2)5 HC(HCHC 2)3 --sic-7-ixordih-3 LSH-41C murasonimugelmuibozihR
Tabela 1: Estruturas de auto-indutores da classe dos ALHs encontrados em diversas espécies de bactérias.
R N
H
O
O
OH
R N
H
O
O
OH
O
R N H
O
O
OH
OH
Fonte: www.quorum-sensing.de/ qsintro.html em 10/12/2002 (modificado).
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 37
luminosos é dirigida para o fundo do
mar e regulada de forma a simular a
intensidade da luz da lua e/ou estrelas,
impedindo desta forma a projeção de
qualquer sombra o que poderia atrair
predadores (Visick & McFall-Ngai,
2000) (Figura 2). A bactéria marinha
existe naturalmente tanto no estado
planktônico de vida livre quanto como
simbionte (Ruby & Nealson, 1976,
Ruby & McFall-Ngai, 1992), porém, a
luminescência só é observada quando
a bactéria coloniza os órgãos dos ani-
mais hospedeiros mencionados, não
ocorrendo emissão de luz quando em
vida livre. Do ponto de vista evolutivo
parece ser coerente que a bactéria
mantenha um controle rigoroso da
bioluminescência, uma vez que o
mecanismo através do qual a luz é
produzida é altamente consumidor de
energia.
Por outro lado, estudos realizados
sob condições de cultivo em meio
líquido mostraram que a produção de
luz só é ativada na presença de um
grande número de células presente
(Greenberg, 1997). Inicialmente, su-
geriu-se que no meio líquido deveria
estar presente um inibidor da
luminescência que de alguma forma
seria removido quando a população
alcançasse um tamanho crítico
(Kempner & Hanson, 1968). A expli-
cação surgiu quando o cultivo foi rea-
lizado num meio pré-exposto à bacté-
ria, o que resultou no aparecimento da
luminescência mesmo sob baixa den-
sidade celular. Posteriormente, de-
monstrou-se que a luminescência era
iniciada não pela remoção de um
inibidor, mas pelo acúmulo de uma
molécula ativadora ou auto-indutora
(Nealson et al., 1970; Eberhard, 1972).
Esta molécula produzida e secretada
pela bactéria ativava a luminescência
quando uma concentração suficiente-
mente alta era atingida. Desta forma, a
bactéria é capaz de perceber a densi-
dade celular através da detecção da
concentração do auto-indutor.
Auto-indutores em bactérias
Gram-negativas
A molécula produzida por V.
fischeri foi isolada, caracterizada e
identificada como N-(3-oxohexanoil)-
lactona homoserina (3-oxo-C6-LHS)
pela primeira vez em 1981 por
Eberhard e colaboradores (Eberhard et
al., 1981). As análises dos genes en-
volvidos no QS em V. fischeri foram
iniciadas por Engebrecht et al. (1983)
que demonstraram que a bactéria re-
gula a expressão de genes codificados
para bioluminescência em resposta à
densidade da população, levando a
um modelo básico de QS nesta bacté-
ria que é atualmente um paradigma
para outros sistemas de QS similares.
A pesquisa sobre a regulação da
bioluminescência em V. fischeri levou
a descoberta dos sistemas bacterianos
de QS via N-acil lactonas homoserinas
(ALHs). A partir desta descoberta, a
identificação do mecanismo de QS em
diferentes grupos bacterianos passou
a ser antecedida da identificação dos
sinais químicos moleculares respecti-
vos (Kaiser & Losick, 1993; Costerton
et al., 1995;; Kaprelyants & Kell, 1996).
Estes sinais extracelulares são conhe-
cidos genericamente como feromônios
(Stephens, 1986; Kell et al., 1995;
Moré et al., 1996; Hardman et al.,
1998; Harris et al., 1998; Mäe et al.,
2001), auto-indutores (Nealson, 1977;
Meighen, 1991; Fuqua et al., 1996) ou
auto-reguladores (Khokhlov, 1991).
Figura 1: Mecanismo de “quorum sensing” regulado pela secreção de auto-indutores sintetizados pela célula bacteriana (A) que
a partir de uma concentração crítica (B) passam a atuar como co-indutores e promovem a transcrição de genes-alvo (C).
Aumento da densidade celular
Aumento da concentração de auto-indutores
Auto-indutor co-indutor DNA
A B C
38 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
Os ALHs formam uma classe de
moléculas sinalizadoras de QS geral-
mente encontrada em bactérias Gram-
negativas que apresentam uma estru-
tura comum de aminoácidos modifica-
dos (lactonas homoserinas) com radi-
cais substituintes de cadeias acil (Ta-
bela 1).
No caso do V. fischeri, quando a
população de bactérias atinge um de-
terminado nível crítico, as moléculas
do auto-indutor passam a interagir com
proteínas chamadas LuxR, converten-
do-as os fatores de transcrição ativos. É
ativada então a transcrição do operon
lux, cujo primeiro gene é o luxI. A
partir daí, a proteína LuxI, codificada
por este gene, cataliza a síntese de
novas moléculas sinalizadoras ALHs
(Dunlap & Greenberg, 1988; Fuqua et
al., 1994; Fuqua et al., 1996). Sendo
assim, a ativação por auto-indução
resulta na produção de quantidades
crescentes dosativadores funcionais
(co-indutores) e, concomitantemente,
a amplificação da transcrição do
operon-alvo (Figura 3).
Este tipo de circuito regulatório
mediado por ALHs e proteínas perten-
centes às famílias LuxR e LuxI é co-
mum a uma grande quantidade de
bactérias Gram-negativas e, é capaz
de atuar, também, como regulador da
expressão de genes envolvidos em
interações microrganismo-microrganis-
mo e hospedeiro-microrganismo, se-
jam estas benéficas ou prejudiciais
(Fuqua et al., 1996 e Swift et al.,
1996).
No início dos anos 90, foram des-
cobertas outras bactérias Gram-nega-
tivas que possuíam sistemas de QS
regulando genes com diferentes fun-
ções (Throup et al., 1995; Eberl et al.,
1996; McClean et al., 1997; Puskas et
al., 1997; Swift et al., 1997). Muitos
destes sistemas empregam ALHs, o
que levou ao desenvolvimento de
bio-sensores capazes de detectar es-
tas moléculas sinalizadoras em outras
bactérias, como Enterobacter, Hafnia,
Rahnella e Serratia (Swift et al., 1993;
Winson, 1998). Desde então, este e,
também, outros métodos têm sido
usados para identificar um grande nú-
mero de espécies que apresentam
sistemas de QS. A Tabela 2 lista bacté-
rias que possuem sistemas de QS ba-
seados em moléculas ALHs e o fenótipo
correspondente derivado da ativação
do sistema.
Auto-indutores em bactérias
Gram-positivas
As bactérias Gram-positivas se
comunicam por meio de diferentes
sinalizadores de QS. Muitas delas em-
pregam peptídeos modificados pós-
tradução obtidos a partir de precurso-
res maiores. Ao contrário dos ALHs,
estes peptídeos são geralmente
secretados por transportadores depen-
dentes de ATP. Alguns interagem com
sensores de quinases ligados à mem-
brana que transportam o sinal através
da membrana, outros são transporta-
dos diretamente para dentro da célula
por permeases de oligopeptídeos,
onde então interagem com recepto-
res intracelulares. Estes sistemas estão
envolvidos na regulação de processos
tão diversos como virulência em
Staphylococcus aureus, competência
para aquisição de DNA em Bacillus
subtilis e Streptococcus pneumoniae,
esporulação em B. subtilis, transfe-
rência de plasmídeo por conjugação
em Enterococcus faecalis, e produção
de bacteriocina em bactérias de ácido
lático (Kleerebezem et al., 1997;
Lazazzera & Grossman, 1998; Kuipers
et al., 1998; Mayville et al., 1999;
Novick & Muir, 1999).
Uma segunda molécula
sinalizadora de QS utilizada por bacté-
rias Gram-positivas é a butirolactona,
usada por várias espécies de
Streptomyces para controlar a produ-
ção e resistência à antibiótico (Bibb,
1996) e síntese de micélio aéreo
(Nodwell & Losick, 1998).
Comunicação entre
diferentes espécies
microbianas
A maioria das bactérias que habi-
tam água, solo, plantas e animais é
Figura 2: Invisibilidade ou ausência de sombra conferida à presa (lula) através da
ativação do mecanismo de “quorum sensing” que produz bioluminescência em
Vibrio fischeri.
Fonte: www.quorum-sensing.de/ qsintro.html em 10/12/2002 (modificado).
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 39
airétcaB sagolómohsaníetorP I/RxuLa HLAlapicnirP etnerrocedopitóneF aicnêrefeR
alihpordyhsanomoreA IyhA,RyhA LSH-4C oãçamrof,ralulecartxeesaetorP
emlifoibed
;c9991;b9991;7991,.latetfiwS
9991,.latehcnyL
adicinomlassanomoreA IasA,RasA LSH-4C ralulecartxeesaetorP 7991,.latetfiwS
sneicafemutmuiretcaborgA IarT,RarT LSH-8C-oxo-3 oãçagujnoC 9991,.laterepiP;4991,.lateauquF
aicapecairedlohkruB IpeC,RpeC LSH-8C orofóredis,esaetorP 9991,.lateazneweL
muecaloivmuiretcabomorhC IivC,RivC LSH-6C ,aníecaloiv,socitóibitnA
otenaic,samizneoxe
,.lateninrehC;7991,.latenaelCcM
8991
snaremolggaretcaboretnE IgaE,RgaE LSH-6C-oxo-3 odicehnocseD 3991,.latetfiwS
psbusarovotoracainiwrE
arovotorac )IraC(IpxERpxE,RraC LSH-6C-oxo-3
,menepabracocitóibitnA
samizneoxe
,.latetfiwS;2991,.latenotniaB
3991,.latenenohriP;3991
imehtnasyrhcainiwrE )IhcE,RhcE(IpxE,RpxE LSH-6C-oxo-3 sesanitceP 8991,.lateressaN
ilocaihcirehcsE AidS odicehnocseD ralulecoãsiviD 6991,.latevokintiS
aeaporuesamosortiN odicehnocseD LSH-6C-oxo-3 galesafadaicnêgremE 7991,.laterolehctaB
suetorpmuiretcabmusebO IrpO,RrpO LSH-6C-oxo-3 odicehnocseD 9991,.latetfiwS
iitrawetsaeotnaP IasE,RasE LSH-6C-oxo-3 oedíracassilopoxE 5991,dnarraF&namdoBnovkceB
asonigureasanomoduesP IsaL,RsaL LSH-21C-oxo-3
edoãçamrof,pcX,samizneoxE
otnemaçapse,RlhR,emlifoib
.alulécaaluléc
;7991,.lateévreH-nopahC
;1991,ikswelgI&ollebmaG
terensselG;3991,.laterodassaP
9991,.la
asonigureasanomoduesP )ImsV,RmsV(IlhR,RlhR LSH-4C
,SopR,otenaic,samizneoxE
,oedípilonmar,aninaicoyp,sanitcel
4opit.ilip
tenosniW;6991;5991,.lateifitaL
;7991,.latenosraeP;5991,.la
9991,.laterensselG
sneicafoeruasanomoduesP IzhP,RzhP LSH-6C anizanefocitóibitnA ,.latedooW;4991,.lateIIInosreiP 7991
snecseroulfsanomoduesP IzhP,RzhP odicehnocseD anizanefocitóibitnA 7991,.latewahS
.vpeagniryssanomoduesP
icabat IysP,RysP odicehnocseD odicehnocseD 9991,.latetfiwS
muraecanalosainotslaR IloS,RloS LSH-8C odicehnocseD 7991,.latereivalF
iltemuibozihR IiaR,RiaR odicehnocseD soludónedoremúnodoãçirtseR ,.latereyemesoR;6991,.lateyarG 8991
murasonimugelmuibozihR RihR --41C-sic-7-ixordih-3 LSH
,anicoiretcab,oãçaludoN
esafanaicnêviverbos
airánoicatse
;9991,.latesaledoR;7991,yarG
9991,smailliW&enrohT
sedioreahpsretcabodohR IreC,RreC LSH-41C-sic-7 edadinumocanepacsE 7991,.latesaksuP
sneicafeuqilaitarreS IrwS,RrwS LSH-4C esaetorp,otnemasnedA ,.latevoksviG;6991,.latelrebE 8991,.latemudniL;7991
muralliugnaoirbiV InaV,RnaV LSH-01C-oxo-3 odicehnocseD 7991,.latenotliM
irehcsifoirbiV IxuL,RxuL LSH-6C-oxo-3 aicnêcsenimuloiB
sulihpotamensudbahroneX odicehnocseD uoLSH-4C-ixordih-3
atsinogamu anairetcabesapil,aicnêluriV 7991,.lateyhpnuD
acitilocoretneainisreY IneY,RneY LSH-6C odicehnocseD 5991,.latepuorhT
sitsepainisreY IepY,RepY odicehnocseD odicehnocseD b;a9991,.latetfiwS
sisolucrebutoduespainisreY IspY,RspY LSH-6C-oxo-3 oãçaremolga,edadiliboM 9991,.latenosniktA
sisolucrebutoduespainisreY IbtY,RbtY LSH-8C odicehnocseD 9991,.latenosniktA
irekcurainisreY IkuY,RkuY odicehnocseD odicehnocseD 9991,.latenosniktA
Tabela 2: Espécies bacterianas que possuem sistemas de QS análogos ao de Vibrio fischeri.
40 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
parte de comunidades complexas com-
postas por membros diversos, o que
sugere a possibilidade de comunica-
ção entre eles. A presença de algum
tipo de comunicação pode propiciar
que cada célula tome conhecimento
do tamanho e composição destas co-
munidades e, dessa maneira, se com-
portar de modo que lhe seja mais
vantajosa nesta situação.
Uma bactéria é capaz de avaliar a
comunidade de microrganismos que a
circunda de várias formas. Moléculas
sinalizadoras produzidas por espécies
diferentes não necessariamente são
únicas, o que propicia à bactéria a
possibilidade de detectar a presença
de outras estirpes que imitam o seu
“dialeto”. Além disso, enquanto algu-
mas moléculas sinalizadoras só são
reconhecidas por pouquíssimas espé-
cies, outras são reconhecidas por vári-
as espécies diferentes. Estas espécies
que reconhecem uma maior varieda-
de de moléculas sinalizadoras, tendem
a apresentar, no entanto, uma respos-
ta mais efetiva frente à molécula sinte-
tizada pelos seus próprios genes.
A habilidade de comunicação en-
tre diferentes espécies bacterianas
apresenta ampla distribuição. Desde
1979, que Greenberg e colaboradores
mostraram que 19 de 28 bactérias
marinhas produziram fatores que in-
duziram V. harveyi a gerar luz
(Greenberg et al., 1979). Em V. fischeri,
moléculas sinalizadoras exógenas po-
dem se ligar à LuxR e impedí-las de
funcionar normalmente, mesmo em
presença de suas moléculas
sinalizadoras. Em princípio, os micror-
ganismospoderiam manipular-se mu-
tuamente através de interferências nos
sistemas de QS uns dos outros.
Certamente existem dificuldades
para se determinar as condições de
atuação do mecanismo de QS em
condições naturais, porém em condi-
ções de laboratório, os resultados mos-
tram que as bactérias podem ser con-
fundidas reconhecendo auto-indutores
produzidos por outras espécies. Pierson
III & Pierson (1996) realizaram estu-
dos com comunidades bacterianas que
colonizam raízes de plantas de trigo
com o objetivo de compreender se
bactérias de uma espécie em condi-
ções naturais podem se comunicar
com organismos não relacionados.
Neste estudo, uma estirpe de
Pseudomonas aureofaciens produto-
ra de antibiótico foi geneticamente
modificada de tal modo que a síntese
de moléculas sinalizadoras não era
mais observada, porém, o mutante
manteve a capacidade de responder a
sinais produzidos por outras bactérias.
Além disso, foi inserido nessa estirpe
um gene reporter que produz uma
proteína facilmente detectável capaz
de indicar a produção usual de antibi-
ótico. Quando uma estirpe produtora
de moléculas sinalizadoras foi adicio-
nada às raízes infectadas com a estirpe
transformada incapaz de sintetizar o
sinal, a produção da proteína marcadora
aumentou, sugerindo que populações
distintas de bactérias podem, de fato,
se comunicar em situação real. Em
outro estudo foram testadas cerca de
40 bactérias de raízes de trigo e, apro-
ximadamente, um terço delas foi ca-
paz de produzir um sinal reconhecível
por Pseudomonas aureofaciens
(Pierson et al., 1998).
Steidle et al. (2001) produziram
estirpes capazes de monitorar ALHs
de forma a poderem visualizar a co-
municação entre populações
bacterianas definidas na rizosfera de
plantas de tomate crescidas
axênicamente. Foi demonstrado que a
comunidade bacteriana nativa que
coloniza raízes de tomate cultivado
em solo não-esterilizado produz molé-
culas sinalizadoras de QS do tipo ALH
que são reconhecidas por diferentes
espécies bacterianas. Estes resultados
indicam que as ALHs têm um papel
importante na comunicação entre
espécies atuando como um sinal uni-
versal. No entanto, esta resposta pare-
ce ser limitada uma vez que a diversi-
dade na cadeia acil (comprimento da
cadeia, grau de oxidação e saturação)
é capaz de conferir uma certa
especificidade na comunicação. Parte
da comunicação cruzada pode repre-
sentar uma maneira pela qual as bac-
térias adquirirem informação acerca da
população total, permitindo uma res-
posta a competidores ou associados
potenciais. Pierson III & Pierson (1996)
também sugerem que o controle da
expressão dos genes de outros orga-
nismos seria uma estratégia eficiente
de competição.
Além deste tipo de comunicação
cruzada via ALHs, foram descritos auto-
indutores do tipo AI-2 em Vibrio
harveyi, uma bactéria marinha
bioluminescente na qual os genes de
luminescência são regulados por QS.
Ao contrário de V. fischeri, V. harveyi
possui dois sistemas de QS, um deles
empregando um tipo de ALH como
sinalizador, 3-hidroxi-C4-LHS e, um
segundo sistema baseado no acúmulo
de uma molécula desconhecida deno-
minada AI-2. Cada tipo de auto-indutor
é detectado por proteínas sensoras
Figura 3 : “Quorum sensing” em Vibrio fischeri: Durante a transcrição do operon lux,
a proteína LuxI é sintetizada, que por sua vez cataliza a síntese do auto-indutor ALH.
O ALH quando atinge um nível crítico passa a atuar como co-indutor, interagindo
com a proteína LuxR e ativando, num mecanismo de retro-alimentação positivo, a
região promotora (box) do gene lux .
luxR
LuxR
luxl
Luxl
AHLs
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 41
específicas, porém estas proteínas
quando ativadas enviam informações
para uma proteína integradora que é
compartilhada entre os dois sistemas e
que controla a emissão da luz. A habi-
lidade de detectar não só o tamanho
da população, mas, também, a pre-
sença de outras espécies permitem
que V. harveyi responda de maneira
diferenciada quer a espécie seja a
única presente ou faça parte de uma
comunidade multi-específica (Bassler
et al., 1993).
O AI-2 tem sido encontrado num
grande número de espécies bacterianas
e por isto é considerado como um sinal
de comunicação universal entre dife-
rentes espécies. A sua estrutura crista-
lina foi desvendada e as evidências
indicam que para torná-lo ativo é ne-
cessária a presença de boro, um ele-
mento amplamente distribuído na
biosfera e, apesar de ser importante
para o desenvolvimento de inúmeros
organismos, a sua função até então era
muito pouco conhecida (Chen et al
2002).
Os dois sistemas de QS provavel-
mente atendem a diferentes objeti-
vos, enquanto o sistema que percebe
os indivíduos da mesma espécie numa
população mista proporciona uma ava-
liação do tamanho da população, a
presença de um segundo tipo de sinal
capaz de detectar a presença de ou-
tras espécies pode informar sobre a
percentagem da espécie em relação
aos outros microrganismos. Estas infor-
mações provavelmente permitem uma
modulação fina do comportamento de
uma determinada espécie frente às
flutuações populacionais do seu
habitat.
Por outro lado, o estudo dos auto-
indutores do tipo AI-2 em diversas
estirpes patogênicas de Escherichia
coli, Salmonella typhimurium e Vibrio
cholerae mostrou que os sistemas são
regulados de maneira complexa e que
condições ambientais podem influen-
ciar a comunicação mediada pelos
auto-indutores. Apesar disso, os genes
responsáveis pela síntese de AI-2 são
altamente homólogos estando pre-
sentes em várias espécies bacterianas,
e, portanto, provavelmente codificam
proteínas que deverão definir uma
nova família de proteínas. Tem sido
sugerido que o mecanismo de QS é
determinante na transição do estado
não patogênico para o patogênico
quando ocorre a colonização do hos-
pedeiro (Mok et al., 2003; Miller et al.,
2004; Xavier & Bassler, no prelo).
A estratégia de controle de mi-
crorganismos através da interferência
nos sistemas de QS não é restrita
apenas a outros microrganismos. Estu-
dos têm mostrado que, pelo menos,
uma espécie de alga marinha australi-
ana (Delisea pulchra) é capaz de per-
turbar a comunicação entre os micror-
ganismos. Estas algas, que são particu-
larmente bem sucedidas defendendo-
se contra colonização bacteriana, pro-
duzem substâncias inibidoras naturais
do QS bacteriano, furanonas
halogenadas (Givskov et al., 1996).
Este tipo de descoberta revela uma
possível fresta no sistema de defesa
bacteriano. Manefield et al. (2001)
observaram inibição da produção de
celulase, protease e carbapenem (an-
tibiótico) em Erwinia carotovora em
decorrência da adição de furanonas
halogenadas produzidas por algas.
A interferência de plantas em
sistemas de QS bacterianos, também,
já foi relatada. Byers et al. (2002)
mostraram que in vitro as moléculas
ALHs produzidas por Erwinia
carotovora por exemplo, tornam-se
instáveis em uma faixa de pH entre 7
e 8, sugerindo que a ativação da bom-
ba de prótons observada em plantas
em resposta ao ataque bacteriano,
seria uma resposta defensiva do vege-
tal, com o intuito de alcalinizar o sítio
de infecção (pH superior a 8,2) e,
desta forma, inativar as moléculas
sinalizadoras. Foi observada inibição
de ALHs por exudatos produzidos por
Figura 4: Importância do mecanismo de “quorum sensing” nas interações entre organismos em ambientes agrícolas complexos.
Promotor de
crescimento
Fixação
biológica
de N2
Controle
Biológico
42 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
plântulas de ervilha desse vegetal,
embora os compostos responsáveis
não tenham sido completamente iden-
tificados (Teplitski et al., 2000). Extra-
tos de uva e morango, também, pos-
suem capacidade de inibir ALHs de
bactérias fitopatogênicase epifíticas
habitantes da rizosfera (Fray, 2002).
Em alguns casos, é possível que os
sinalizadores de densidade
populacional possam ser modulados
ou superados por fatores como tensão
de oxigênio, esgotamento de nutrien-
tes, limitação de ferro ou repressão de
catabólito. Estes fatores podem ser
indiretamente alterados pelas subs-
tâncias produzidas por plantas.
Evolução dos genes
envolvidos com o
 mecanismo de QS
A presença de auto-indutores as-
sociados ao mecanismo de QS é co-
mum a diversos grupos filogenéticos,
encontrando-se nos genomas
bacterianos já seqüenciados uma alta
similaridade com os genes que carac-
terizam a resposta de QS. Dois grupos
principais de proteínas podem ser
considerados: (1) LuxI/R presente em
bactérias Gram-negativas, a LuxI é
catalisadora da síntese de auto-
indutores do tipo AHLs que são detec-
tados por proteínas do tipo LuxR e,
por sua vez ativam a transcrição dos
genes-alvo, e (2) LuxS que sintetiza o
AI-2, um diester furanosil borato des-
coberto inicialmente em Vibrio harveyi
(Federle & Bassler, 2003).
As árvores filogenéticas obtidas a
partir dos genes que codificam o LuxS
e daqueles que codificam as duas
famílias de LuxI/R mostram um alto
grau de concordância com a árvore de
RNA ribossomal que caracteriza a rela-
ção entre os diferentes taxa. Estes
resultados sugerem que os sistemas
QS estão presentes de maneira contí-
nua durante a evolução de grupos, tais
como as divisões de Proteobacteria e
de Firmicutes (Lerat & Moran, 2004).
A análise filogenética dos genes
indutores ou receptores de LuxI/R
compreendem duas famílias de prote-
ína sem homologia entre elas, uma
delas restrita a γ-Proteobacteria e a
outra, que apresenta distribuição mais
ampla. Os genes que codificam as
proteínas LuxI/R parecem ter evoluí-
dos juntos existindo poucas evidênci-
as de troca de material por transferên-
cia lateral, exceto em algumas linha-
gens de γ-Proteobacteria. A transfe-
rência lateral, no entanto, parece ser
mais comum nos genes que codificam
o LuxS em Firmicutes.
QS em microrganismos de
importância agrícola
A presença dos sistemas de QS
são comuns como mecanismo de
regulação de genes entre bactérias
Gram-negativas que se associam a
plantas. De acordo com Cha et al.
(1998) a maioria das bactérias
associativas a plantas produzem AHLs,
especialmente quase todos os isola-
dos de Agrobacterium, Rhizobium e
Pantoea, além de cerca de metade
daqueles de Erwinia e Pseudomonas.
Membros do gênero Rhizobium mos-
traram a maior diversidade de
sinalizadores, alguns produzindo ape-
nas um tipo de molécula, enquanto
outros produziram até 7 sinalizadores
detectáveis. Por outro lado, poucos
isolados de Xanthomonas foram ca-
pazes de produzir sinais detectáveis.
Num levantamento realizado por
Steidle et al. (2001) com mais de 300
estirpes isoladas da rizosfera de toma-
te, 12% apresentaram sinal positivo
para AHL, ao passo que Pierson et al.
(1998) observaram 8% a partir de um
estudo com 700 estirpes associadas a
raízes de trigo. Em um outro estudo
foi observada uma maior proporção
de bactérias com essa característica,
de 137 estirpes de diferentes espécies
de Pseudomonas patogênicas do solo
e associadas às plantas, cerca de 40%
apresentaram capacidade de produ-
ção de AHL (Elasri et al., 2001). O mais
interessante, segundo os autores, foi a
observação de que bactérias
associativas produziram AHL com
maior freqüência do que as estirpes
patogênicas do solo, sugerindo que a
proximidade da bactéria com a planta
hospedeira aumenta a probabilidade
de produzir AHL. Esses resultados
abrem novas perspectivas para a com-
preensão da comunicação entre bac-
térias que estão sob influência do sis-
tema radicular, e que participam de
diferentes mecanismos de regulação
de populações de microrganismos do
solo.
A maioria das bactérias que em-
pregam sistemas de QS associam-se
com animais ou plantas e se benefici-
am deste processo, porém, nem sem-
pre o organismo hospedeiro é benefi-
ciado, como em V. fischeri, citado
anteriormente. Pseudomonas
aeruginosa, por exemplo, uma bacté-
ria oportunista patogênica a plantas e
animais, utiliza sistemas de QS via
ALHs. Neste modelo, QS é utilizado
para a maturação de biofilmes e para
determinar a expressão da virulência,
sendo que circuitos múltiplos de QS
capazes de controlar a expressão de
dezenas de genes específicos relacio-
nados com a virulência já foram descri-
tos (Parsek & Greenberg, 2000). Nes-
ta espécie, um terceiro auto-indutor,
designado PQS (Pseudomonas
Quinolone Signal) também foi identi-
ficado (Pesci et al., 1999).
Pseudomonas aueruginosa
apresenta a capacidade de produzir
pioverdinas, que são sideróforos e,
como tais, tem a capacidade de quelar
Fe. Embora esse elemento seja abun-
dante em solos aerados (1 - 6%), sua
disponibilidade depende do pH e da
solubilidade dos óxidos de Fe. À medi-
da que o pH do solo aumenta, a
disponibilidade de Fe diminui e os
sideróforos se tornam mais efetivos
(Zago et al., 2000). Dessa forma, esses
compostos tem importância em rela-
ção a disponibilidade desse elemento
para os seres vivos.
Stintzi et al. (1998) foram os pio-
neiros ao observar o efeito de QS
sobre sideróforos, estudando o gene
lasR, que regula, em parte, a densida-
de celular dessa bactéria. Através da
utilização de mutantes lasR nulos e
defeituosos, esses autores observaram
uma redução de até 2 vezes na produ-
ção do sideróforo.
Além da produção dos sideróforos,
a produção de antibiótico também é
regulada por sistemas QS. A expressão
do operon de biossíntese do antibióti-
co fenazina produzido em
Pseudomonas aureofaciens, um agen-
te de biocontrole do fungo
Gaeumannomyces graminis var. tritici
que causa a doença “take-all” em trigo,
é controlada por uma ALH (HLH – N-
hexanoil lactona homoserina) que atua
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 43
como molécula sinalizadora na rizosfera
de trigo (Wood et al., 1997). Além de
atuar como agente de biocontrole, a
fenazina também aumenta a sobrevi-
vência da bactéria propiciando uma
vantagem competitiva frente aos ou-
tros microrganismos presentes na
rizosfera de trigo.
A caracterização de sistemas QS
tem utilizado tradicionalmente estir-
pes do gênero Pseudomonas como
modelo, reconhecidamente por re-
presentar um grupo com capacidade
patogênica e com uma variedade de
rotas metabólicas. No entanto, outras
bactérias associativas tem sido estuda-
das, como no caso de Agrobacterium
tumefaciens através da transferência
conjugativa de plasmídeos. O
plasmídeo Ti dessa bactéria
fitopatogênica capaz de causar tumo-
res em plantas, é controlado por um
sistema hierárquico onde as opinas,
substratos produzidos pelos tumores,
induzem um sistema de QS que envol-
ve o ativador de transcrição TraR. Esse
ativador requer um fator de conjuga-
ção como co-indutor para ativar a
expressão do gene tra, que é um
homólogo de luxR. Assim, os dois
sistemas reguladores estão relaciona-
dos e as duas proteínas ativadoras
apresentam similaridades, sistema
cofactor lux e autoindutores que subs-
tituirão o fator de conjugação na ativa-
ção dos genes tra no plasmídeo Ti
(Piper et al., 1993; Fuqua & Winans,
1994; Moré et al., 1996).
Em Erwinia carotovora ssp.
carotovora, uma outra bactéria
fitopatogênica, responsável pela
indução de doenças como podridão
mole em plantas, a produção de
enzimas extracelulares (isoenzimas
de pectato liase, celulase,
poligalacturonase e protease) que de-
gradam componentes da parede celu-
lar vegetal é regulada por QS. Prova-
velmente a produção destas enzimas
por um número pequeno de células
não teria efeito no tecido das plantas
que responderia ativando os seus me-
canismos de defesa (Pirhonen et al.,
1993). Liu et al. (1998) relatam que
esta bactéria produz sinalizadores tipo
ALH que controlamvia QS a produção
das enzimas extracelulares menciona-
das e do indutor de reações de
hipersensibilidade (HarpinEcc). Em
outra espécie também fitopatogênica,
E. chrysanthemi, foi verificada a pro-
dução de 3 tipos de ALHs o que sugere
a existência de um sistema regulatório
hierárquico complexo de QS (Nasser
et al., 1998).
Em adição aos AHLs, outras molé-
culas sinalizadoras vêm sendo desco-
bertas como responsáveis pelo QS.
Por exemplo, Ralstonia solanacearum,
também uma bactéria fitopatogênica,
produz uma substância (ácido metil-
ester-3-hidroxi-palmítico) que em con-
junto com os AHLs regulam a virulên-
cia (Flavier et al., 1997). Já para
Xanthomonas campestris tem sido
observada a produção de um fator
extracelular difuso (DSF) que não tem
sido caracterizado como um AHL pro-
priamente dito, mas, que induz um
princípio semelhante ao QS (Barber et
al., 1997).
Além dos efeitos negativos ob-
servados nos organismos hospedeiros,
mais recentemente tem sido observa-
do efeito de sistemas de QS nas
interações de protocooperação, que
envolvem benefícios mútuos entre os
organismos. Uma das simbioses mais
estudadas é a que se estabelece entre
leguminosas e bactérias do grupo
rizóbio capazes de reduzir o nitrogê-
nio atmosférico (N
2
), processo biológi-
co reconhecido como Fixação Biológi-
ca de Nitrogênio (FBN), capaz de
reduzir a necessidade de adubação
nitrogenada nas culturas como resulta-
do da inoculação com bactérias efici-
entes e competitivas. Esse processo é
dependente de uma rede de sinais
moleculares entre o hospedeiro e o
microssimbionte, cujos mecanismos de
QS têm sido mencionados como pa-
pel chave (Loh & Stacey, 2003;
Marketon et al., 2003).
Diferentes parâmetros relaciona-
do com a FBN, tais como eficiência da
nodulação, desempenho simbiótico e
produção de exopolissacarídeos são
controlados por mecanismos de QS.
Nesse grupo de microrganismos, a
espécie Rhizobium leguminosarum
bv. viciae é a melhor caracterizada
(vide revisão de Wisniewski-Dye &
Downie, 2002), com vários sistemas já
identificados: rai, rhi, cin e tra (Cubo et
al., 1992; Wisniewski-Dye et al., 2002;
Wilkinson et al., 2003). No entanto,
ainda há pouca informação sobre o
papel desses sistemas no ciclo de vida
desses microrganismos (González &
Marketon, 2003).
Estudos têm sido realizados para
outras espécies do grupo rizóbio, como
para Rhizobium etli (Mendoza et al.,
2004), Sinorhizobium meliloti (Chen
et al., 2003; Hoang et al., 2004) e
Mesorhizobium huakuii (Zhu et al.,
2003).
No caso de Bradyrhizobium
japonicum, também pertencente ao
grupo rizóbio, estruturas definidas
como CDF designadas como
bradioxetinas foram identificadas (Loh
et al., 2002; Loh e Stacey, 2003). Estas
moléculas apresentam estrutura simi-
lar a certos antibióticos e sideróforos e
encontram-se ativas, também, em
outros membros de α-proteobacteria,
sugerindo que esses compostos po-
dem desempenhar um papel não so-
mente na simbiose com rizóbio, mas
em outras interações de bactérias com
plantas e animais (González e
Marketon, 2003).
Chin-A-Woeng et al. (1998),
Delany et al. (2000) e Lithgow et al.
(2000) realizaram a análise detalhada
do controle baseado em QS em três
espécies de bactérias, uma espécie
usada como biofertilizante, Rhizobium
leguminosarum e duas empregadas
como agentes de biocontrole de do-
enças de plantas, Pseudomonas
chlororaphis, PCL1391, e P.
fluorescens, F117. Foram encontra-
dos sistemas de QS nas 3 espécies,
sendo que, em R. leguminosarum,
quatro sistemas de QS interligados
foram observados. As análises de efei-
tos de mutações nos sistemas de con-
trole gênico via QS de R.
leguminosarum revelaram que carac-
terísticas como nodulação da
leguminosa, sobrevivência da bacté-
ria, transferência horizontal de genes e
habilidade de inibir crescimento de
outros rizóbios foram influenciadas por
QS. Em ambas as espécies de
Pseudomonas, observou-se que a pro-
dução do antibiótico antifúngico é con-
trolada por QS. Em P. chlororaphis, o
sistema de QS controla a produção de
fenazina-1-carboxamida, uma substân-
cia capaz de inibir o crescimento do
fungo Fusarium oxysporum f. sp.
radicis-lycopersici (Chin-A-Woeng et
al., 2001).
44 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
Já em P. fluorescens, o sistema
de QS demonstrou afetar a regulação
do metabólito antifúngico 2,4 diacetil
floroglucinol. Comparações entre os
metabólitos de QS produzidos pelas 3
espécies demonstraram que estas bac-
térias possuem potencial para regula-
rem-se mutuamente através da comu-
nicação cruzada na rizosfera. Por outro
lado, elas também têm potencial para
ativar a expressão gênica em
fitopatógenos como sub-espécies de
Agrobacterium e Erwinia. Bachofen
& Schenk (1998) relataram que siste-
mas de QS são comumente encontra-
dos em diversas bactérias de solo.
Algumas destas bactérias, inclusive,
possuem potencial para utilizar as
moléculas sinalizadoras de QS como
substrato de crescimento. Os sistemas
de bioensaios estabelecidos por Chin-
A-Woeng et al. (1998) mostraram-se
sensíveis e satisfatórios como forma
de medição da comunicação entre
bactérias da rizosfera. As análises de
sistemas regulatórios baseados em QS
em ambientes de solo artificial revela-
ram que sinalizadores de QS produzi-
dos por R. leguminosarum podem
afetar positivamente a transferência
de genes entre bactérias do solo de
diferentes gêneros, permitindo a co-
municação cruzada dependente de
QS entre diferentes espécies de bac-
téria in vivo.
Esses relatos têm demonstrado
que características essenciais para o
sucesso de interações benéficas entre
bactérias do solo e raízes de plantas
podem ser responsivas a sistemas de
QS. No sentido de impulsionar as pes-
quisas nessa área, o Consórcio Euro-
peu sobre “Comunicação na rizosfera”
financiado pelo programa EU
BIOTECH da Comunidade Européia,
vem investigando até que ponto
rizobactérias promotoras de crescimen-
to de plantas (RPCP) usam QS basea-
do em ALH de modo a regular carac-
terísticas fisiológicas importantes e qual
o grau de comunicação cruzada de
RPCPs com fitopatógenos. As vias dos
sinalizadores identificadas até o mo-
mento envolvem um número de genes
regulatórios incrivelmente reduzido.
Esta simplicidade poderá vir a facilitar
sua exploração no desenvolvimento
de melhores estratégias agrícolas e de
seleção de estirpes de bactérias para
uso como biofertilizantes e biocontrole.
Aplicação biotecnológica
de QS
A descoberta da diversidade de
microrganismos que usam QS cria um
alvo atrativo para a sua aplicação
biotecnológica na agricultura. O estu-
do dos sistemas de QS, além de forne-
cer detalhes fundamentais a cerca dos
mecanismos de parasitismo e simbiose,
pode permitir meios inovadores para
o controle de infecções em plantas e
animais. De La Cruz (2001) defende
que uma das metas de trabalho a longo
prazo é a inibição dos sistemas de QS
em patógenos de animais e plantas de
forma a facilitar o controle destas po-
pulações. Para tanto, a autora relata
evidências bioquímicas e moleculares
que sugerem que Bacillus cereus,
UW85 tem capacidade de inibir o
sistema de QS em Chromobacterium
violaceum, CV026, através da
inativação enzimática da molécula auto-
indutora.
Do mesmo modo, Dong et al.
(2000) descobriram um gene em
Bacillus sp., 240B1, que codifica uma
enzima inativadora de ALHs. A ex-
pressão desse gene em uma estirpe
de Erwinia carotovora transformada
levou à redução significativa da libera-
ção de ALHs, diminuição das ativida-
des de enzima pectinolítica extracelular
e atenuação da patogenicidade em
batata, beringela, repolho, aipo, ce-
noura, couve-flor e tabaco.
Alternativamente, a produção de
moléculas sinalizadoras pela própria
planta aumenta o potencial de uso
biotecnológico visando o controle de
doenças e a maximização dasinterações benéficas de modo a otimizar
a produtividade agrícola. Nesse con-
texto, tem sido estudada a obtenção
de plantas geneticamente modifica-
das com a habilidade de produzir
moléculas bacterianas sinalizadoras de
QS, com o objetivo de desenvolver
formas inovadoras para controle de
doenças e manipulação de interações
planta-microrganismo (Fray et al.,
1999; Mäe et al., 2001). Já foram
desenvolvidas plantas transgênicas de
tabaco produtoras de altos níveis de
ALHs ou que podem degradar ALHs
produzidas por bactérias (Fray, 2002).
Ainda neste sentido, Dong et al. (2001)
relataram que plantas expressando a
enzima ALH lactonase isolada de
Bacillus sp. inutilizaram as moléculas
sinalizadoras de QS de Erwinia
carotovora e mostraram resistência
significativamente aumentada ao
fitopatógeno. Os autores consideram
promissor o uso de sinalizadores de QS
como alvos moleculares para controle
de doenças, ampliando as atuais for-
mas de prevenção de infecções
bacterianas.
Além de material geneticamente
modificado, o manejo agrícola utiliza-
do pode alterar a intensidade de res-
posta dos sistemas de QS. No manejo
convencional, onde a monocultura e a
aplicação de agroquímicos são reco-
mendadas, não raro observam-se alte-
rações nas populações microbianas
que tendem a se tornar menos diver-
sas e mais reduzidas. Nesta situação a
possibilidade de uma população de
fitopatógeno se tornar prevalente atra-
vés da utilização de sinais de auto-
indutores deve ser facilitada uma vez
que a ocorrência de competidores é
reduzida.
Por outro lado, a retomada de um
equilíbrio dinâmico preconizado com
as novas formas de manejo agrícola,
através de implementação de práticas
alternativas ao modelo convencional
(manejo orgânico e suas variáveis),
onde a ênfase é na introdução de
policultivos e de práticas rotacionais e
de consorciação, na integração de plan-
tas e animais e na racionalização do
uso de insumos orgânicos, favorece a
diversificação dos organismos e, como
conseqüência, a competição, o con-
trole e a regulação dos fitopatógenos.
Nesses ambientes, os organismos be-
néficos e prejudiciais convivem mutu-
amente não se observando incidênci-
as severas de doenças responsáveis
por sintomas que acarretam em danos
econômicos. É possível que a presen-
ça de uma diversidade alta de organis-
mos dificulte o estabelecimento das
populações de patógenos, de tal modo
que o nível crítico que permite a
expressão da virulência dificilmente é
alcançado.
Paralelamente, a utilização de uma
agricultura menos impactante, através
da adoção de sistemas complexos, a
evolução do conhecimento científico
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 45
tem apontado, também, para a neces-
sidade de se obter uma visão holística
do processo biológico baseada nas
interações entre os indivíduos e destes
com o meio ambiente. Ao contrário,
resultados obtidos de estudos
reducionistas apresentam limitações
principalmente quando se visa a ob-
tenção de produtos biológicos eficien-
tes, que para serem introduzidos com
sucesso devem ser capazes de com-
petir com a biota do solo e aquela
associada ao tecido vegetal e sobrevi-
ver sob diferentes condições edafo-
climáticas.
Estudos que visam aprofundar os
conhecimentos de QS nestes ambien-
tes serão uma contribuição para o
entendimento da regulação de popu-
lações microbianas em comunidades
complexas, tais como os consórcios
microbianos que têm recebido aten-
ção especial recentemente. Além dis-
so, a compreensão não só da comuni-
cação célula a célula que ocorre entre
membros de mesma espécie, mas
também da comunicação cruzada com
bactérias de outros gêneros e outros
organismos, podem propiciar a
otimização de características positivas
de RPCPs. Desse modo, os conheci-
mentos dos sistemas de QS abrem
grandes perspectivas para aplicação
no ambiente agrícola visando a maior
eficiência de inoculantes e de agentes
de controle biológico (Figura 4).
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Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 51
Pesquisa
CULTIVO DE ANTERAS
 x
CULTIVO DE MICRÓSPOROS ISOLADOS
Lia Rosane Rodrigues
PhD, Doutora em Ciências pelo Programa de Pós-
Graduação em Genética e Biologia Molecular,
Instituto de Biociências (IB), Universidade Federal
do Rio Grande do Sul (UFRGS)
liarr@ufrgs.br
Jorge E.A. Mariath
PhD, Professor Titular do Departamento de
Botânica, IB, UFRGS
jorge.mariath@ufrgs.br
Maria Helena Bodanese-Zanettini
PhD Professora Titular do Departamento de
Genética, IB, UFRGS
maria.zanettini@ufrgs.br
Ilustrações cedidas pelos autores
regeneração direta de
esporófitos a partir de
micrósporos ou de pólen
foi inicialmente registrada
no cultivo de anteras de Datura
innoxia por Guha e Maheshwari
(1964, 1966), quando alguns grãos de
pólen apresentaram um desvio de sua
rota de desenvolvimento e originaram
plantas haplóides.
A partir daquele primeiro regis-
tro, cultivos experimentais foram con-
duzidos para obtenção de indivíduos
haplóides de inúmeras espécies vege-
tais por esta via morfogênica. Nas
condições de cultivo propostas, algu-
mas espécies responsivas tornaram-se
modelo para o estudo dos fatores que
alteram e redirecionam o desenvolvi-
mento gametofítico, dos padrões inici-
ais das divisões celulares que envol-
vem a transição direta gametófito-
esporófito e das condições de cultivo
que aceleram a regeneração de plan-
tas.
A formação direta de plantas a
partir do micrósporo ou do pólen re-
quer a ocorrência de divisões celulares
atípicas e a síntese das paredes das
novas células. À medida que o número
destas células aumenta, ocorre a rup-
tura da parede de exina e a liberação
de uma estrutura multicelular com
variados graus de organização entre o
padrão de desenvolvimento zigótico
e calogênico (Maheshwari et al., 1982;
Wang et al., 2000). Em condições de
cultivo favoráveis, estes conjuntos
celulares originam estruturas
embriogênicas, que se desenvolvem
até regenerar plantas.
O cultivo de anteras in vitro con-
solidou-se como sistema morfogênico
a tal ponto que, em inúmeros traba-
lhos, foi apresentado como sinônimo
de embriogênese do micrósporo e do
pólen. Mais recentemente, o cultivo
de micrósporos isolados tem substitu-
ído o cultivo de anteras em inúmeros
laboratórios e a proporção de traba-
lhos publicados a respeito deste siste-
ma tem aumentado. Ambos os siste-
mas servem à pesquisa básica, como
modelo para estudo dos diferentes
aspectos (molecular, fisiológico,
Figura 1: Secção transversal de parte de
uma antera imatura de soja, dentro de
um botão floral de comprimento 3,5 mm.
Os gametófitos estão cercados pelos
estratos parietais, constituídos pelo tapete,
pelo endotécio, pela(s) camada(s)
média(s) e pela epiderme
Dez razões para uma nova abordagem da embriogênese do micrósporo
52 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
histológico etc.) da embriogênese e
da embriologia lato sensu. Além disso,
plantas haplóides e duplo-haplóides
têm amplo emprego como ferramen-
ta biotecnológica em trabalhos que
visam à manipulação de variabilidade
genética para o melhoramento das
plantas cultivadas, permitindo o
mapeamento de genes de interesse
agronômico e a descoberta de muta-
ções. Entretanto, com base em nossa
experiência na transição do cultivo de
anteras para o cultivo de micrósporos
isolados de soja (Glycine max L. Merrill),
podemos propor, no mínimo, dez ra-
zões para a adoção do cultivo de
micrósporos isolados:
1a. No cultivo de micrósporos
isolados, não há interferên-
cia dos tecidos esporofíticos.
No cultivo de anteras, os
micrósporos são estabelecidos in vitro
envolvidos pelos estratos parietais,
constituídos pelotapete, pelo
endotécio, pela(s) camada(s) média(s)
e pela epiderme (Figura 1). Também
está presente o tecido conectivo que,
no botão floral, une a antera ao filete e,
conseqüentemente, ao receptáculo
floral (Mariath et al., 2003). Em geral,
as condições de cultivo não favore-
cem a proliferação destes tecidos.
Também tem se assumido que os
tecidos da planta que já ingressou em
fase reprodutiva, como são os estratos
parietais e o conectivo, apresentam
pouco ou nenhum potencial
morfogênico. Porém, no cultivo de
anteras de algumas espécies vegetais,
estes tecidos apresentaram capacida-
de de proliferação. Uma destas espé-
cies é a soja (Rodrigues et al., 2004;
Rodrigues et al., in press).
A presença de células haplóides
nos calos embriogênicos derivados do
conectivo pode aumentar a confusão
entre eventos morfogênicos no culti-
vo de anteras (Altamura et al., 1992;
Woodward e Puonti-Kaerlas, 2001;
Rodrigues, 2004). Pouco se sabe a
respeito da origem destas células
haplóides, mas, em calos
embriogênicos de raízes de
Arabidopsis thaliana, foram atribuí-
das à redução do tipo meiótica e
associadas a desdiferenciação celular
(Yihua et al., 2001).
Mesmo não se proliferando in
vitro, os tecidos esporofíticos também
podem ter um efeito inibitório ou
seletivo sobre a embriogênese dos
micrósporos (Hoffmann et al., 1982;
Van Geyt et al., 1985).
2a. Em micrósporos isolados,
os tratamentos são aplicados
diretamente sobre as células-
alvo do cultivo.
No cultivo de anteras, a presença
dos tecidos esporofíticos pode retar-
dar ou neutralizar o efeito das condi-
ções de cultivo indutoras da
embriogênese do micrósporo ou mas-
carar a resposta morfogênica, impe-
dindo conclusões efetivas a respeito
dos tratamentos.
3a. O cultivo de micrósporos
isolados permite a separação
dos constituintes da suspen-
são
Em geral, diferentes estádios da
microsporogênese e da
microgametogênese estão transcor-
rendo dentro de uma mesma antera, o
que impede que células em estádios
específicos do desenvolvimento se-
jam estabelecidas in vitro.
No cultivo de micrósporos isola-
dos, por meio de centrifugação com
gradientes (de sacarose, percoll e
manitol) e de filtração através de ma-
lhas de náilon de 15 a 500 µm, os
constituintes de um mesmo cultivo
podem ser separados em populações
homogêneas. Estes recursos permi-
tem separar populações de
micrósporos e gametófitos para compa-
ração entre os estádios (Kyo e Harada,
1986); separar os micrósporos
responsivos, de maior tamanho, da
maioria não-responsiva; e reunir volu-
me suficiente de material em cada
estádio de desenvolvimento para a
execução de estudos citológicos e
moleculares (Maraschin et al., 2003).
4a. A competição entre estru-
turas embriogênicas por es-
paço e nutrientes é evitada no
cultivo de micrósporos isola-
dos
Quando a proporção de
micrósporos responsivos no cultivo de
anteras é grande, o desenvolvimento
dos grãos de pólen multicelulares e
das estruturas embriogênicas a partir
de um mesmo sítio, o lóculo da antera,
pode gerar competição por espaço e
nutrientes, causar alterações morfo-
anatômicas ou impedir a continuidade
do desenvolvimento de algumas es-
truturas, o que caracterizaria um tipo
de seleção in vitro. No cultivo de
micrósporos, é possível transferir sele-
tivamente as estruturas embriogênicas
para uma condição em que possam
completar a histodiferenciação, princi-
palmente quando o desenvolvimento
não é sincronizado entre elas. A com-
petição pelo efeito posicional não
apenas é evitada, como o acréscimo
de meio líquido pode compensar uma
superprodução de estruturas
embriogênicas.
5a. A proporção de
micrósporos responsivos é
sempre superior no cultivo
de micrósporos isolados
Figura 2: Gametófitos de soja isolados
em meio de cultivo líquido. Os núcleos
generativo e vegetativo apresentam reação
fluorocromática ao 4´-6-diamidino-2-fe-
nilindol (DAPI)
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 53
Nos trabalhos em que os dois
sistemas foram comparados, o cultivo
de micrósporos isolados foi sempre
mais eficiente, mesmo em diferentes
meios nutritivos (Ma et al., 2004) e a
produção de esporófitos androgênicos
foi cinco a dez vezes superior (Siebel
e Pauls, 1989; Hoekstra et al., 1992).
6a. O cultivo de micrósporos
isolados permite recursos adi-
cionais de manipulação gené-
tica
Protoplastos de micrósporos po-
dem ser obtidos pelo emprego de
combinações de enzimas (Sun et al.,
1999). Sendo similar a outros cultivos
de células em meio líquido, o cultivo
de protoplastos de micrósporos pode
permitir o desenvolvimento de técni-
cas para manipulação e geração de
variabilidade genética, como a indução
de mutações (Barro et al., 2001), a
fusão de protoplastos e a transforma-
ção genética (Stöger et al., 1995).
7a. O estabelecimento de
micrósporos isolados in vitro
é um sistema mais rápido e
prático para algumas espéci-
es vegetais.
Para o cultivo de anteras in vitro,
é necessária a remoção individual das
anteras do interior de botões florais
imaturos. Para o estabelecimento de
micrósporos isolados, é possível exe-
cutar um procedimento massal, que
inicia com a maceração dos botões
florais desinfestados. Conforme as ca-
racterísticas morfológicas dos botões
florais imaturos e as condições
ambientais em que estes botões são
obtidos, o estabelecimento de
micrósporos isolados é mais simples
(Duijs et al., 1992). Entretanto, isso
não é regra. O estabelecimento de
micrósporos isolados de soja, cujos
pequenos botões florais apresentam
muitos tricomas, é bem mais trabalho-
so do que o estabelecimento de anteras
(Rodrigues, 2004).
8a. O acompanhamento
dos cultivos de micrósporos
isolados pode ser feito com
todas as técnicas já emprega-
das para o cultivo de anteras e
ainda dispensa esmagamen-
tos
O acompanhamento dos cultivos
que visam à embriogênese do
micrósporo, tanto no cultivo de anteras
quanto no cultivo de micrósporos iso-
lados, pode empregar microscopia em
campo claro, fluorescência (Figura 2),
seções histológicas e uma série de
estudos moleculares.
No cultivo de anteras, os estratos
parietais e o conectivo permanecem
nos esmagamentos e interferem na
microscopia. Quando estes tecidos
apresentam potencial morfogênico,
podem originar estruturas
embriogênicas similares às derivadas
dos micrósporos, tanto na observação
do explante ao estereomicroscópio
quanto em esmagamentos para análi-
se ao microscópio. Isso ocorre porque,
em geral, não há diferença nos pa-
drões iniciais de desenvolvimento entre
os dois tipos de embrião. Além disso,
o embrião somático inicial apresenta
depósitos parietais de calose e de
pectinas que podem ser confundidos
com a parede do pólen na observação
em microscopia de campo claro.
9a. O cultivo de micrósporos
isolados permite o acompa-
nhamento ao microscópio da
resposta individualizada de
cada célula
No cultivo de anteras, a resposta
dos micrósporos envolvidos por teci-
dos esporofíticos, não pode ser acom-
panhada sem a destruição dos estratos
parietais (Figura 3). O cultivo de
micrósporos isolados, entretanto, quan-
do conduzido em meio gelificado ou
em meio de dupla fase (uma fase
líquida sobre outra gelificada), viabiliza
o acompanhamento das divisões de
cada célula ao microscópio invertido.
Este tipo de acompanhamento não-
destrutivo poderá oferecer informa-
ções irrefutáveis acerca do suposto
potencial embriogênico do pólen
atípico do tipo P ou S.
Nas décadas de 1970 e 1980, a
Figura 3: Lóculo de uma antera de soja após 18 dias de cultivo. As condições in vitro,
principalmente a indução sob a luz e a presença de 2,4-D no meio, desencadearam
aumento de volume, desdiferenciação e proliferação de células dos estratos parietais,
simultaneamente à degradação da maioria dos micrósporos e gametófitos (compare
com a Figura 1). Apenasum grão de pólen permanece vivo, apresentando divisão
celular simétrica característica do desvio da rota gametofítica. Porém, a resposta
vigorosa dos tecidos esporofíticos dificulta ou impede a embriogênese a partir deste
gametófito
54 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
pesquisa em dimorfismo do pólen foi
associada ao estudo da androgênese e
alguns autores propuseram que
micrósporos do tipo P ou S, possivel-
mente resultantes de alterações
meióticas, teriam maior predisposição
para tomar a rota de desenvolvimento
esporofítico quando estabelecidos in
vitro (Horner e Street, 1978; Heberle-
Bors, 1985). Porém, inúmeros traba-
lhos demonstraram embriogênese a
partir de micrósporos e de grãos de
pólen típicos. Uma maneira de escla-
recer o papel destes micrósporos
atípicos pode ser o acompanhamento
individual ao microscópio invertido.
10a. Estudos básicos também
requerem a efetiva separação
das gerações gametofítica e
esporofítica
As mesmas suspensões de
micrósporos e grãos de pólen que
podem ser submetidas ao cultivo vi-
sando à embriogênese também po-
dem servir para estudos básicos da
fisiologia da microsporogênese e da
microgametogênese e da expressão
gênica na geração gametofítica.
Apesar de o cultivo de
micrósporos isolados ser pouco difun-
dido no Brasil, é um sistema promissor
para abordagem da androgênese nas
numerosas espécies vegetais para as
quais ainda não foram desenvolvidos
protocolos. Nossa experiência com-
prova que ajustes simples permitem
implantar este sistema em um labora-
tório equipado para outros tipos de
cultivo, por isso, esperamos que esse
trabalho motive os pesquisadores bra-
sileiros a adotá-lo.
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Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 55
Pesquisa
Goma Curdlana:
Propriedades e aplicações
Mário Antônio Alves da Cunha
Químico Industrial, Ms. em Ciência de Alimentos,
Doutorando em Biotecnologia Industrial. Faculdade
de Engenharia Química de Lorena
mariocunha@debiq.faenquil.br
Júlio César dos Santos
Engenheiro Industrial Químico, Doutorando em
Biotecnologia Industrial. Faculdade de Engenharia
Química de Lorena
jsant100@ig.com.br
Raúl Jorge H. C. Gómez
Professor Titular. Departamento de Tecnologia de
Alimentos e Medicamentos. Universidade Estadual de
Londrina
rcastrog@yahoo.com
Silvio Silvério da Silva
Professor-pesquisador. Departamento de
Biotecnologia. Faculdade de Engenharia Química de
Lorena
silvio@debiq.faenquil.br
1. Introdução
As gomas podem ser definidas
como moléculas de elevada massa
molecular, com características
hidrofílicas ou hidrofóbicas, que usual-
mente têm propriedades coloidais e a
capacidade de produzir géis ao com-
binarem-se com o solvente apropria-
do. É comum o termo goma ser aplica-
do a polissacarídeos, ou seus deriva-
dos, obtidos de plantas ou por proces-
so microbiológico, que ao se dispersar
em água fria ou quente produzem
soluções ou misturas viscosas.
A indústria de alimentos é uma
das principais usuárias das gomas, onde
elas desempenham funções de
espessante, gelificante, emulsificante,
floculante, estabilizante e como for-
madoras de filmes para revestir inú-
meros alimentos. Dependendo de sua
natureza, podem apresentar proprie-
dades adesivas e ainda potencial
farmacológico, principalmente quan-
do modificadas quimicamente.
Atualmente existe uma grande
tendência na utilização de biopolímeros
em áreas tradicionalmente dominadas
por polímeros sintéticos, em função
da importância do uso de materiais
oriundos de fontes renováveis. Neste
contexto, as gomas obtidas por pro-
cessos microbiológicos vêm se desta-
cando no mercado mundial. Entre elas,
a goma curdlana, um polímero de D-
glicose com ligações glicosídicas β
(1→3), que é o terceiro polissacarídeo
produzido industrialmente por fermen-
tação, depoisdas gomas xantana e
gelana.
A goma curdlana possui a propri-
edade única de formar dois tipos de
géis por aquecimento. Um gel termo-
reversível que é formado quando sus-
pensões deste biopolímero são
aquecidas em temperaturas entre 50ºC
e 60ºC e resfriadas a temperaturas
inferiores a 40ºC e outro gel, termo-
irreversível , que é formado quando as
suspensões são aquecidas a 80 ºC ou
mais. Este biopolímero tem enorme
potencial como aditivo alimentar, po-
dendo ser utilizado em inúmeros pro-
dutos além de propriedades
farmacológicas quando modificada
quimicamente, possuindo atividade
antivirótica, anticoagulante e
antitrombótica.
2. Hidrocolóides / Gomas
De maneira geral, os termos
hidrocolóide, colóide hidrofílico ou
goma têm sido usados como sinôni-
mos. Também é observado o termo
mucilagem, embora este seja mais
empregado para materiais que for-
mam com a água massas viscosas,
como é o caso das pectinas (CUNHA,
2002). Segundo Zohuriaam &
Shokrolahi (2004), o termo goma mais
FIGURA 1. Estrutura química da curdlana (FUNAMI et al., 1999b)
CH
2
OH
O
O
O
O
O
HO
OH
CH
2
OH
CH
2
OH
OH OH
HO HO
OH
H * OH
n
Um polímero bacteriano com propriedades peculiares
56 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
especificamente denota um grupo de
polissacarídeos de uso industrial ou
seus derivados que hidratados em água
quente ou fria, em baixas concentra-
ções, formam dispersões ou soluções
viscosas.
Os hidrocolóides são substâncias
altamente hidrofílicas solúveis ou que
se dispersam em água, aumentando a
viscosidade do sistema. Do ponto de
vista químico são polissacarídeos (goma
arábica, goma guar, goma carragenana,
carboximetilcelulose, amido, pectinas)
ou proteínas como a gelatina (IBAÑES &
FERRERO, 2003). O termo “hidrocolóide”
engloba todos os polissacarídeos que
são obtidos de plantas, algas marinhas
e de fonte microbiana, bem como as
gomas obtidas de exsudados de plan-
tas e biopolímeros modificados produ-
zidos pelo tratamento químico ou
enzimático do amido e da celulose.
Além da gelatina que é a única prote-
ína que tem sido aceita nesse grupo
por seu caráter altamente hidrofílico e
polidisperso (DICKINSON, 2003).
As gomas são classificadas como
naturais e modificadas. O grupo das
naturais inclui os extratos de algas
marinhas (alginatos), exsudados de
plantas (goma arábica e tragacanta),
gomas obtidas de sementes ou raízes
(amido de batata) e as gomas obtidas
por fermentação (goma xantana).
Dentro do grupo das modificadas têm-
se principalmente as gomas derivadas
do amido e da celulose (Zohuriaam &
Shokrolahi (2004).
Devido à elevada capacidade de
retenção de água, os hidrocolóides
conferem estabilidade aos produtos
que sofrem ciclos de congelamento-
descongelamento e demonstram boas
propriedades como mimetizadores de
gordura (GUARDA et al. 2004).
O uso de hidrocolóides (gomas)
na indústria de alimentos baseia-se
principalmente no aproveitamento de
suas propriedades funcionais, que es-
tão relacionadas à capacidade de es-
pessar, de manter partículas em sus-
pensão e de reter água (SANDERSON,
1981). São usados em concentrações
baixas, que variam de 0,5% a 5%, e
usualmente não contribuem para o
aroma, paladar ou valor nutritivo do
produto. Exercem, no entanto, papel
importante no controle da textura e na
estabilidade de muitos alimentos in-
dustrializados, prevenindo ou retar-
dando uma série de fenômenos físicos
como a sedimentação de partículas
sólidas suspensas no meio; a cristaliza-
ção da água ou do açúcar; a agregação
ou desagregação de partículas disper-
sas e a sinérese de sistemas gelificados
(FREITAS et al., 1996).
3. Goma curdlana:
características e propriedades
A goma curdlana (FIGURA 1) é um
polissacarídeo microbiano extracelular
composto exclusivamente de resídu-
os de D-glicose ligados por ligações
glicosídicas b (1→3) (FIGURA 2) e pro-
duzida através de fermentação por
cepas não-tóxicas e não-patogênicas
de Alcaligenes faecalis var. mixogenes
(hoje, identificada como
Agrobacterium biovar 1) e
Agrobacterium radiobacter (CUNHA,
2002; LEE & PARK, 2001; NAKAO, 1997;
SAUDAGAR & SINGHAL, 2004).
Este biopolímero foi descoberto
em 1966 por Tokuya Harada, então
professor da Universidade de Osaka,
Japão e recebeu a denominação de
curdlana por sua habilidade de coagu-
lação (“curdle”), quando aquecida em
solução (PSZCZOLA, 1997). Possui a ca-
pacidade de ligação com a água e de
gelificação por aquecimento, proprie-
dades de interesse da indústria de
alimentos. Além de fazer parte da
família das β-glucanas que são bem
conhecidas da comunidade científica
por seus benefícios a saúde (JEZEQUEL,
1998).
As β-glucanas são consideradas
como fibras, não sendo digeridas devi-
do à ausência no organismo humano
de enzimas capazes de hidrolisar as
ligações β-glicosídicas. As fibras inso-
lúveis não sendo metabolizadas pelo
trato digestivo, não contribuem com
valor calórico, podendo ser utilizadas
em produtos com teor calórico reduzi-
do (LIVESEY, 1990); podem auxiliar na
prevenção do câncer intestinal e na
redução dos níveis de LDL como de
colesterol total (JESEQUEL, 1998).
Em estado natural é pobremente
cristalina e é encontrada como um
grânulo (FIGURA 3) semelhante ao ami-
do. O grânulo é insolúvel em água
destilada, porém dissolve-se facilmen-
te em solução alcalina diluída, devido
à ionização de pontes de hidrogênio
intermolecular e intramolecular
(CHEESEMAN & BROWN JR., 1995). Apre-
senta massa molecular de aproxima-
damente 74000 e é produzida indus-
trialmente por uma empresa Japone-
sa, através de processo fermentativo
com a Alcaligenes faecalis variedade
myxogenes (FUNAMI et al., 1999a).
3.1 Obtenção do gel de curdlana
Em suspensão aquosa, a curdlana
é capaz de formar gel por aquecimen-
to e de acordo com a temperatura de
aquecimento, há formação de dois
tipos de géis. O gel denominado “low-
set”, que é formado quando a suspen-
são aquosa de curdlana é aquecida a
50ºC - 60ºC e então resfriada a tempe-
raturas inferiores a 40ºC. É um gel
termoreversível similar ao agar-agar e
à gelatina. E o gel “high-set”, que é
formado quando a suspensão aquosa
de cudlana é aquecida à temperatura
de 80ºC ou superior, sendo um gel
termo-irreversível, bastante estável a
uma ampla faixa de temperatura de
FIGURA 2. Células de Agrobacte-
rium radiobacter var. k 84 com
grande secreção gomosa (goma
curdlana).
FIGURA 3. Microscopia de luz polariza-
da do grânulo de curdlana (CHEESEMAN &
BROWN JR., 1995).
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 57
congelamento (FUNAMI et al., 1998) e
frente a tratamentos com altas tempe-
raturas, permanecendo insípido,
inodoro e incolor (NAKAO et al, 1991).
A goma curdlana também forma
gel termo-irreversível em sistemas ali-
mentares, mesmo quando processa-
dos em temperaturas inferiores a 80ºC
devido ao aumento de componentes
funcionais. Além disso, quando a con-
centração de curdlana é aumentada no
sistema a temperatura necessária para
a gelificação termo-irreversível é re-
duzida, pois há uma alteração no pon-
to de transição do gel “low-set” para o
“high-set” (FUNAMI et al., 1999b) em
função do aumento das interações
hidrofóbicas entre micelas de curdlana
(FUNAMI et al., 1998).
Funami et al., (1999c) estudaram
algumas propriedades viscoelásticas
de géis de curdlana preparados com
várias concentrações do polímero e
em várias temperaturas e observaram
que a temperatura (temperatura de
transição) em que o gel torna-se
irreversível depende da concentração
do polímero e sugerem que com o
aumento da temperatura de aqueci-
mento, interações entre moléculas de
curdlana, formando uma rede
tridimensional, tornam o gel mais forte
e mais elástico.
O mecanismo molecular de for-mação dos géis “high set” e “low-set”,
é diferente. No gel “high-set” as liga-
ções cruzadas entre miscelas de
curdlana, formadas por moléculas com
cadeias em hélice tríplice ou hélice
múltipla, são mantidas com interações
hidrofóbicas; enquanto no gel “low-
set” as miscelas, que são formadas por
moléculas com cadeias em hélice sim-
ples, são mantidas por pontes de hi-
drogênio (FUNAMI et al., 1999c).
Nas figuras 4 e 5 estão represen-
tados os possíveis modos de formação
das pontes de hidrogênio
intramolecular, no gel “low-set”, e das
interações hidrofóbicas entre molécu-
las de cudlana, no gel “high-set”, des-
critos por Tako & Hanashiro, (1997).
A microscopia eletrônica de trans-
missão de baixa resolução mostra que
o gel de curdlana formado a tempera-
turas mais baixas é composto de
microfibras entrelaçadas (FIGURA 6), en-
quanto que o gel formado a tempera-
turas mais elevadas é composto por
FIGURA 4. Esquema do possível modo de estruturação das pontes de hidrogênio
intramolecular.
FIGURA 5. Esquema do possível modo de estruturação das interações hidrofóbicas
SOTNEMILA OÃÇNUF
sadassecorpsenraC augáedoãçneter,arutxetedoãçacifidoM
sodazilifoilsotnemilA oãçatardiheredrailixua,arutxetedoãçacifidoM
sohloM otnemidneredrailixua,edadisocsivedotnemuA
sodizoc-érpsotnemilA arutxetedoãçacifidoM
oãrracaM arutxetedoãçacifidoM
saiéleG etnacifilegetnegA
sodassecorpsotnemilA edsotiefesoaodnitsiser(etnacifilegetnegA
otnemalegnoceotnemiceuqa
sievítsemocsemliF emlifedoãçamroF
sairolacsaxiabmocsotnemilA )levíregidni(acitéteidarbiF
sêugrubmahesotnuserp,saçiügniL aneaugáedoãçneteranrailixua,etnazirutxeT
zeicam
sojieuQ arudrogadrodazitemiM
setrugoI eserénisebinieedadisocsivaarohleM
sadalegsasemerboS eserénisebinI
setevroS augáadoãçazilatsircaativE
TABELA 1. Aplicações da goma Curdlana em Alimentos
58 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
microfibras associadas (FIGURA7)
(CHEESEMAN & BROWN Jr., 1995).
Há também formação de gel de
curdlana quando em solução alcalina
em presença de cátions bivalentes
como Ca++ e Mg ++ ou quando neutra-
lizada por solução ácida sem aqueci-
mento (NAKAO, 1997; SPICER; GOLDENTHAL
& IKEDA, 1999).
A estrutura linear da goma curdlana
a torna mais resistente ao aquecimen-
to e a outras forças externas incluindo
o pH (KANKE et al., 1995). Podendo
formar gel sob uma ampla faixa de pH
(pH 2 a pH 10), sendo isto uma
vantagem em relação a outros agentes
gelificantes. Outra propriedade única
do gel de curdlana é sua alta estabilida-
de a processos de congelamento-des-
congelamento (NAKAO, 1997).
3.2 Produção e bio-síntese da
goma curdlana
A goma curdlana é bio-sintetizada
por Alcaligenes faecalis var. myxogenes
e Agrobacterium radiobacter sob con-
dições de limitação de nitrogênio e sua
produção tem atraído considerável
interesse devido a suas propriedades
únicas de gelificação (KIM et al., 2000).
Industrialmente é produzida por pro-
cesso fermentativo pela
Agrobacterium radiobacer biovar 1
(FUNAMI et al., 1999a).
Seu processo de produção (FIGU-
RA 8) a partir da A. radiobacter biovar
1 é patenteado e envolve fermenta-
ção aeróbica de um meio de cultivo
contendo glicose, uma fonte de nitro-
gênio e quantidades traços de mine-
rais. O polímero formado no meio é
dissolvido com álcali, separado da
biomassa e então purificado (JEZEQUEL,
1998).
O produto final do processo con-
tém 90% de β (1→3) D-glucana e 10%
de umidade.
Lee (2003) esquematizou a via
metabólica para a síntese da curdlana
a partir da glicose (FIGURA 9).
Este esquema metabólico mostra
a biosíntese da goma curdlana, a partir
do substrato glicose ocorrendo em três
etapas. Primeiramente ocorre a absor-
ção do substrato pela célula, seguida
da formação intracelular do
polissacarídeo e finalmente excreção
deste para fora da célula.
De acordo com Lee (2003) o
substrato entra na célula por transpor-
te ativo e translocação de grupo. O
substrato é então direcionado ao longo
da cadeia catabólica ou é direcionado
à síntese do polissacarídeo. No proces-
so de formação do polímero UDP-
glicose, um precursor-chave é sinteti-
zado pela ação da enzima UDP-glicose
pirofosforilase sobre a glicose-1-P. Sub-
seqüentemente a construção da molé-
cula de curdlana ocorre junto com a
transferência de monossacarídeo
(glicose) da UDP-glicose para um
lipídeo carreador, ocorrendo então a
formação do polissacarídeo e excreção
para fora da célula.
KAI el at., (1993) reportaram um
estudo da biosíntese de curdlana por
Agrobacterium sp (ATCC 31749) usan-
do como substrato glicose com carbo-
no marcado. Neste trabalho os autores
sugerem que seu processo de bio-
síntese pode ocorrer por várias rotas:
por síntese direta a partir da glicose;
por recombinação de trioses a glicose;
a partir da frutose-6-fosfato formada
no ciclo das pentoses e neogênese de
glicose a partir de fragmentos produ-
zidos em outras vias catabólicas, com
subseqüente polimerização. Sendo,
portanto, um biopolímero produzido
intracelularmente e excretado poste-
riormente para o meio.
Apesar das várias rotas possíveis
de bio-síntese, estes autores relatam
que mais de 60% da goma são sinteti-
zados por polimerização direta da
glicose e que a degradação da glicose
ocorre principalmente via ciclo das
pentoses e via Entner-Doudoroff mais
do que a via Enbden Meyhorf-Parmas.
3.3 Aplicações da goma
curdlana
A) Alimentos
 A goma curdlana foi aprovada
como aditivo alimentar e
comercializada inicialmente no mer-
cado asiático, mais especificamente
no Japão, em Taiwan e na Korea em
1989 e em 16 de dezembro de 1996
foi aprovada pelo Food and Drug
Administration (FDA) para uso como
aditivo alimentar nos Estados Unidos.
 Este biopolímero foi introduzida
no mercado japonês para melhorar a
textura e a capacidade de retenção de
água de alimentos processados e para
o desenvolvimento de novos alimen-
tos (FUNAMI et al., 1999b). Hoje é am-
plamente usada no Japão como ingre-
diente essencial em vários tipos de
alimentos processados, especialmen-
te em produtos à base de carne onde
é usada para a modificação de textura
e melhoria na capacidade de retenção
de água (FUNAMI, YADA & NAKAO, 1998),
além de alimentos como tofu, geléia
de feijão e pastas de peixe (SUTHERLAND,
1998).
FIGURA 6. Microfibras não associadas no gel de curdlana preparado
a 65ºC (CHEESEMAN & BROWN Jr., 1995)
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 59
FIGURA 7. Microfibras associadas no gel de curdlana
preparado a 95ºC (CHEESEMAN & BROWN Jr. 1995).
Como aditivo alimentar é
usada em quantidades relativa-
mente pequenas (0,1% a 1,0%),
sendo utilizada para modificar
ou estabilizar propriedades físi-
cas do produto e normalmente
envolve pouca ou nenhuma
técnica especial de
processamento, podendo ser
adicionada juntamente com
outros ingredientes alimenta-
res na forma de pó (NAKAO,
1997). Pode ser usada como
um modificador de textura, me-
lhorando a retenção de água
em lingüiças e presuntos; em
queijos, como substituinte de
gordura e em iogurtes para pre-
venção de sinérese. Quando
utilizada em concentrações de 0,2% a
1% em bife de hambúrguer promove
elevada suculência, maciez e textura
após cozimento (PSZCZOLA, 1997).
Usada isoladamente ou em con-
junto com outros hidrocolóides tem
notável potencial como sistema
mimetizador de gordura (FUNAMI; YADA
& NAKAO, 1998), podendo desta forma
contribuir para a redução do teor de
gordura do alimento, o que é muitas
vezes desejado.
A Tabela 1 apresenta de forma
resumida possíveis aplicações da goma
curdlana na área de alimentos.
B) Imobilização de enzimas
De acordo com Saudagar &
SINGHAL, (2004) a molécula de curdlana
apresenta potencial como matriz para
imobilização enzimática, uma vez que
contémgrande número de grupos
hidroxil e a reação destes grupos com
epicloridrina resulta em grupos epóxi
ativados que podem ligar-se
covalentemente com grupos sulfidril,
hidroxil e amino de enzimas, conse-
qüentemente imobilizando-as.
C) Área biomédica
As áreas médica e farma-
cêutica são campos bastante
promissores e novos com rela-
ção ao uso de polissacarídeos
microbianos com atividade bio-
lógica (CHENGHUA et al., 2000;
SUTHERLAND, 2001). Desta forma,
estas são áreas de imenso po-
tencial para uso da goma
curdlana, sendo observados na
literatura diversos trabalhos que
relatam este potencial.
Jagodzinski et al (1994) e
TOSHIO et al., (1998) constata-
ram o efeito inibitório da molé-
cula de curdlana sulfatada (sul-
fato de curdlana) sobre a infec-
ção com o vírus da
imunodeficiência adquirida tipo
1 (HIV-1) “in vitro”.
Igarashi et al. (1998) verificaram
ação inibitória da molécula de curdlana
sulfatada, em testes “in vitro” e “in
vivo” sobre o desenvolvimento de
Babesia bigemina, um protozoário pa-
rasita causador da babebiose bovina,
doença conhecida como “tristeza pa-
rasitária bovina” que é responsável
por grandes prejuízos principalmente
em países tropicais e subtropicais.
Alban et al. (1995) observaram
em ensaios biológicos com coelhos e
ratos a ação anticoagulante e
antitrombótica da curdlana sulfatada
(CurS). Em um trabalho mais recente
de ALBAN & FRANZ (2000) a ação
anticoagulante do sulfato de curdlana
foi caracterizada, ficando demonstra-
do que a estrutura da CurS inibe o
processo de coagulação em vários
sítios, inibindo a formação da trombina.
A possibilidade de usar géis de
curdlana como um novo material para
liberação controlada de drogas tam-
bém é observado na literatura. Kim et
al., (2000) relatam que o gel de
curdlana foi hábil para o aprisionamen-
to e liberação controlada de Soro
Albumina Boniva (BSA) por um perío-
do de até 100 horas.
Flieber et al., (2003), reportam
que o campo mais novo de aplicação
da curdlana é a produção de plásticos
biodegradáveis para aplicações médi-
cas.
D) Outros campos de
aplicação
Outros campos de aplicação queFigura 8. Esquema simplificado do processo de produção da goma curdlana.
F. NitrogênioGlicose
Minerais
(traços)
FERMENTAÇÃO
A.Radiobacter Biovar 1
Dissolução em Álcali
Purificação
Secagem
CURDLANA
60 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
são relatados na literatura incluem o
uso como aditivo de concreto, sendo
utilizada para aumentar a fluidez dele
(LEE & PARK, 2001) e o seu uso combi-
nado com carvão ativado em processo
de remoção de metais pesados (Cu++,
Mn++, PB++ e Cd++) de soluções aquosas
(MOON & LEE, 2004).
4. Considerações finais
A goma curdlana é um polímero
bacteriano com propriedades peculia-
res que o tornam um material de
grande interesse para a indústria. É
uma goma que vem aos poucos con-
quistando mercado, inicialmente o asi-
ático e mais recentemente o norte-
americano e tem amplo potencial de
uso na indústria de alimentos, farma-
cêutica entre outras.
A área farmacêutica é um dos
campos mais inovadores e propícios
para o desenvolvimento de novos
produtos de elevado valor agregado
com este biopolímero, tanto no de-
senvolvimento de medicamentos
antiviróticos, antiparasitários,
anticoagulantes e antitrombóticos,
como na elaboração de materiais efi-
cazes para a liberação controlada de
drogas, bastante almejados pela indús-
tria.
Além de poder ser utilizada como
suporte inerte para imobilização de
enzimas, no preparo de plásticos
biodegradáveis para fins biomédicos e
em processos de adsorção de metais
pesados.
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62 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
Introdução
“A biodiversidade está na moda”.
Não é um exagero, mas sim um resu-
mo real do que tem caracterizado o
cenário internacional. Há uma cres-
cente valorização dos produtos da na-
tureza, considerados confiáveis e se-
guros. Desta forma, as grandes com-
panhias, visando atender a um merca-
do consumidor cada vez mais exigen-
te, têm procurado novas moléculas
detentoras de atividade biológica no
chamado “ouro verde”, ou seja, exa-
minando os elementos que constitu-
em a biodiversidade (Ferreira et al,
1998; Calixto, 2000; Megale, 2002).
Contudo, ao longo deste proces-
so de busca por novos princípios ati-
vos, é evidente a enorme disparidade
existente entre os países desenvolvi-
dos e os denominados países em de-
senvolvimento. Os primeiros possu-
em uma enorme quantidade de recur-
sos para serem investidos em pesqui-
sa e desenvolvimento, mas não possu-
em uma biodiversidade tão rica quan-
to os segundos. Estes, por sua vez,
apresentam um vasto número de re-
presentantes da flora e da fauna, a
Pesquisa
PATENTES
Extratos de plantas e derivados
Adriana Campos Moreira
Aluna de Doutorado do Curso de Pós-Graduação em
Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos
Escola de Química da Universidade Federal do Rio de
Janeiro e Especialista em Patentes da Coordenação de
Gestão Tecnológica da Fundação Oswaldo Cruz/
GESTEC
adriana@fiocruz.br
Adelaide Maria de Souza Antunes
D.Sc., professora do Departamento de Química
Orgânica da Escola de Química da Universidade
Federal do Rio de Janeiro
adelaide@eq.ufrj.br
Nei Pereira Júnior
PhD, professor do Departamento de Engenharia
Bioquímica da Escola de Química da Universidade
Federal do Rio de Janeiro
nei@eq.ufrj.br
exemplo do Brasil – o país detentor da
biodiversidade mais rica do mundo,
porém não têm a mesma disponibili-
dade financeira para a realização de
investimentos na área em questão e
tampouco contam com um sistema
efetivo para controlar o acesso aos
seus recursos genéticos. Países como
o Brasil, portanto, são alvos de atenção
internacional. Porém, são poucos os
casos onde a soberania dos países
sobre os seus recursos genéticos, a
qual foi determinada pela Convenção
da Dibersidade Biológica, é respeitada
e eles recebem algum benefício resul-
tante da exploração comercial dos
seus recursos genéticos (Dutfield, 2000;
Santilli, 2003; UNEP, 2004). Pelo con-
trário, o resultado de tal disparidade é
a biopirataria.
A realidade evidencia que ele-
mentos pertencentes à biodiversidade
dos países em desenvolvimento são,
na sua grande maioria, levados para o
exterior de forma clandestina e
pesquisados. Estas pesquisas têm ge-
rado depósitos de pedidos de patente
por parte de grandes companhias in-
ternacionais. Tal afirmativa pode ser
exemplificada pelos resultados de uma
Resumo
Inicialmente, o presente artigo destaca a crescente valorização da
biodiversidade, ressaltando também o grande interesse que a flora e a fauna
brasileiras despertam à nível internacional. Em seguida, o artigo em questão
salienta que os principais detentores de documentos de patente associados a
plantas tipicamente nacionais são estrangeiros. Desta forma, o referido artigo
enfatiza a falta de estímulo ao conhecimento dos pesquisadores e empresários
brasileiros sobre o tema “patentes”. Conseqüentemente, o presente trabalho
aponta as dúvidas mais freqüentes acerca do tema em questão e, assim, esclarece
as mesmas. Então, este artigo desmistifica os principais equívocos acerca do
assunto e, finalmente, apresenta informações relevantes, as quais devem constar
de um pedido de patente na área de produtos naturais, especificamente no
âmbito das pesquisas com extratos de plantas e seus derivados.
Verdades e Mentiras sobre a patenteabilidade no Brasil
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 63
análise feita pelo presente grupo, onde,
após examinar centenas de documen-
tos de patente provenientes de diver-
sos países, e os quais estão relaciona-
dos a plantas tipicamente brasileiras,
verificou que apenas 5.8% destes são
de titulares nacionais (dados não mos-
trados).
Seria uma grande injustiça justifi-
car esta notória ausência de pesquisa-
dores/universidades/ Instituições de
pesquisa ou empresários brasileiros
como detentores de documentos de
patentes pelo simples fato de não
serem realizadas pesquisas associadas
às plantas e seus derivados em nível
nacional. Afinal, o Brasil conta com um
quadro de recursos humanos altamen-
te qualificado para a realização de
pesquisas na área em questão, sendo
amplamente divulgados os resultados
promissores que eles têm alcançado
no decorrer de tais pesquisas.
Todavia, é fundamental ressaltar
que a falta de uma política nacional de
inovação, a qual valorize a patente
como indicador de produtividade,
pode ser um dos fatores responsáveis
por tal cenário brasileiro. Os pesquisa-dores são avaliados pela publicação de
artigos científicos, participação em con-
gressos etc., mas não são orientados,
ou melhor, não têm estímulo para
aprender acerca do tema “patentes” e,
desta forma, proteger os seus resulta-
dos antes de revelá-los. Logo, o país
assiste a representantes da sua flora
sendo protegidos por estrangeiros atra-
vés do sistema de patentes e, em
situações não raras, paga preços ele-
vados por produtos feitos à base de
plantas tipicamente nacionais.
Assim, o presente trabalho abor-
da a patenteabilidade dos produtos
naturais no Brasil, enfatizando a possi-
bilidade de proteção de resultados de
pesquisas com extratos de plantas e
derivados no território nacional, sali-
entando a importância deste tipo de
proteção, além de esclarecer as dúvi-
das mais comuns por parte de pesqui-
sadores ou empresários nacionais acer-
ca deste tema, além de fornecer as
principais informações que devem
constar de um pedido de patente na
área em questão.
Metodologia
A metodologia empregada na
determinação do escopo de proteção
dos produtos naturais no Brasil, espe-
cificamente os extratos de plantas e
seus derivados, foi a análise da Lei de
Propriedade Industrial Brasileira - Lei
9279/96 (Brasil, 1996). A detecção
das principais dúvidas associadas ao
tema “patentes” foi decorrente do
contato com pesquisadores e empre-
sários brasileiros durante a experiên-
cia profissional na Fundação Oswaldo
Cruz, além da observação de informa-
ções preliminares na literatura perti-
nente à área em questão (Assumpção,
2001;Chamas, 2001). Finalmente, os
detalhes acerca de bases de dados de
patentes foram resultantes da obser-
vação das páginas eletrônicas do Insti-
tuto Nacional da Propriedade Industri-
al do Brasil (INPI), do United States
Patent Office e do European Patent
Office.
Resultados e discussão
 Inicialmente, é fundamental sali-
entar a importância da proteção de
resultados de pesquisas, independen-
temente da área de enfoque delas.
Sejam estas vinculadas às plantas, ou
não, comumente são resultantes de
anos de pesquisa, durante os quais
foram investidos recursos para o pros-
seguimento e a finalização dos expe-
rimentos. E tais investimentos, em
muitos casos, podem alcançar valores
altíssimos. Desta forma, como seria
interessante obter alguma compensa-
ção pela obtenção dos resultados em
questão. E se esta compensação não
fosse apenas o reconhecimento pelo
mundo científico, mas também algu-
ma espécie de retorno financeiro de-
corrente da exploração econômica
deles? Tal retorno financeiro poderia
ser empregado no desenvolvimento
de novas pesquisas e assim sucessiva-
mente.
Porém, para se obter a compen-
sação supracitada através da
comercialização do objeto resultante
de uma dada pesquisa, não é aconse-
lhável que ela possa ser reproduzida
livremente. Ela precisa estar protegida
de forma a que o seu detentor, ou um
terceiro autorizado por ele, possa re-
produzi-la de uma forma privilegiada.
E o sistema de patentes confere tal
privilégio, na medida em que o Estado
confere ao titular de uma patente o
monopólio temporal sobre o objeto
dela. Caso o titular de tal patente assim
deseje, poderá conceder licença para
um terceiro usufruir do monopólio em
questão. No entanto, este terceiro pre-
cisará pagar ao titular uma determina-
da quantia a ser previamente acorda-
da.
Contudo, respeitosamente, é pos-
sível destacar que o cenário nacional
pode ser caracterizado, quanto ao ní-
vel de conhecimento sobre o tema em
questão, pela existência de três gru-
pos distintos de pesquisadores ou em-
presários:
Em relação ao primeiro grupo,
nestes encontram-se pesquisadores ou
empresários nacionais que já utiliza-
ram, pelo menos uma única vez, o
sistema de patentes para a proteção
de resultados de suas pesquisas. En-
tão, no decorrer do processo de solici-
tação da referida proteção, tiveram a
orientação de profissionais
especializados no assunto acerca das
características do sistema em questão.
Assim, tornaram-se conscientes a res-
peito da importância de estarem aten-
tos à proteção da informação antes de
revelá-la a terceiros e, em muitos ca-
sos, caracterizam-se como difusores
deste conhecimento adquirido. Porém,
a realidade brasileira evidencia que
este grupo abrange a minoria dos
pesquisadores ou empresários do país
(Chamas, 2001).
Os segundos correspondem aos
pesquisadores brasileiros, os quais, em
virtude do próprio sistema nacional
para a avaliação das suas produtivida-
des, nunca foram alertados quanto à
necessidade de proteção dos resulta-
dos das suas pesquisas. Logo, estão
completamente atentos à continuida-
de das suas pesquisas e ao desenvol-
vimento de novos projetos de traba-
lho, cujos resultados são revelados
mediante os meios de divulgação mais
empregados no ambiente acadêmico,
a exemplo da publicação de artigos
científicos e da participação em con-
gressos. Estes pesquisadores obtêm o
merecido mérito científico pelos seus
resultados, mas deixam de usufruir dos
benefícios decorrentes da exploração
econômica de objetos de documentos
de patentes dos quais sejam invento-
64 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
res.
No terceiro grupo estão pesqui-
sadores ou empresários nacionais que
já tiveram contato, de alguma forma,
com informações sobre o sistema de
patentes. Porém, estão repletos de
dúvidas a respeito do presente tema.
E, somados a estas dúvidas, possuem,
por algum motivo, determinadas in-
formações que não correspondem à
realidade do sistema em questão ou,
em outras palavras, não são verdadei-
ras e podem ser caracterizadas como
“falsos mitos” vinculados à área de
patentes. Tanto as dúvidas quanto os
“falsos mitos” precisam ser esclareci-
dos.
Dentre as dúvidas mais freqüen-
tes, as quais foram identificadas quan-
do do desenvolvimento do artigo em
questão, é possível mencionar e, en-
tão, esclarecer:
1) A patente é internacional, ou seja,
uma vez requerida em um dado país,
vale para todo o mundo?
A resposta é não. A Patente é
territorial, valendo apenas nos territó-
rios em que a solicitação da proteção
foi realizada. Logo, caso se requeira
este privilégio somente no Brasil, qual-
quer indivíduo no mundo poderá re-
produzir a pesquisa e comercializar o
produto dela, exceto no território bra-
sileiro.
2) É necessário depositar pedidos de
patente em todos os países aonde se
deseja obter proteção em um mesmo
momento?
Não. De acordo com um dos
tratados mais antigos relacionados às
patentes, conhecido como Conven-
ção da União de Paris/CUP (WIPO,
2002), há um prazo de 12 meses,
contados do primeiro depósito de
pedido de patente, para que sejam
efetuados os depósitos dos pedidos
de patente denominados correspon-
dentes. O primeiro depósito geral-
mente é feito no país de origem do
inventor, por exemplo o Brasil, mas
não se trata de uma regra.
3) E se neste período alguém tomar
conhecimento do conteúdo da pes-
quisa e depositar pedidos de patente
referentes a ela no exterior?
Caso estes depósitos sejam feitos
dentro do prazo de 12 meses
supracitado, não é necessário ter qual-
quer preocupação; pois, de acordo
com a CUP (WIPO, 2002), o seu pedi-
do, caso contenha matéria patenteável,
é aquele que será concedido. O outro
pedido será negado.
4) Como decidir sobre os países em
que há necessidade de requerer pro-
teção?
Geralmente, a escolha dos terri-
tórios onde a proteção será solicitada é
feita mediante a análise de três fato-
res, em conjunto ou isoladamente. O
primeiro, é referente à existência de
mercado consumidor para a matéria
objeto do documento de patente. O
segundo, é a possibilidade da indústria
local reproduzir a referida matéria. No
que diz respeito ao terceiro fator, este
está associado à existência de poten-
ciais parceiros para executar tal repro-
dução do objetoda patente.
5) E se um determinado indivíduo
desejar reproduzir uma pesquisa ob-
jeto de patente, mas apenas para fins
de pesquisa? É possível?
Esta é uma das grandes dúvidas
detectadas. A resposta é, sim. Afinal, a
patente não pode impedir o progres-
so tecnológico e, portanto, o conheci-
mento das informações contidas nela
pode resultar em novas pesquisas,
cujos resultados, no futuro e desde
que atendam aos requisitos de
patenteabilidade, também poderão ser
privilegiáveis. Porém, caso este indiví-
duo mude de idéia e deseje explorar
o objeto da patente com fins comerci-
ais, terá que solicitar a autorização do
titular desta patente.
6) Qualquer resultado de pesquisa é
patenteável? O que torna os resulta-
dos de uma pesquisa patenteáveis?
É fundamental a compreensão de
que não é qualquer resultado de pes-
quisa que pode obter privilégio pelo
sistema de patentes. Apenas aqueles
que atendem, simultaneamente, a três
requisitos de patenteabilidade pode-
rão ser protegidos. O primeiro requisi-
to é a NOVIDADE, ou seja, os resulta-
dos da pesquisa devem ser novos, não
tendo sido revelados sob nenhuma
forma (oral, escrita, etc.) antes do
depósito do pedido de patente. O
segundo requisito corresponde à APLI-
CAÇÃO INDUSTRIAL, ou melhor, os
resultados precisam ter utilização em
qualquer tipo de indústria, a exemplo
da farmacêutica e da alimentícia. O
último requisito é o mais subjetivo e
corresponde à ATIVIDADE INVENTI-
VA, não podendo ser óbvio para um
técnico no assunto caso ele fosse cha-
mado para solucionar o mesmo pro-
blema inicial que motivou o pesquisa-
dor a desenvolver o trabalho e obter os
resultados finais. Em outras palavras,
não pode ser uma mera combinação
de meios conhecidos por outros de
mesma função.
7) É possível proteger uma idéia?
Não. É preciso que a idéia esteja
concretizada, ou melhor, que tenha
sido demonstrada a sua aplicação. Por
exemplo, não basta mencionar que o
extrato de uma determinada planta
possui atividade antiinflamatória; é
necessário demonstrar o referido efei-
to.
8) Qual o momento de depositar um
pedido de patente?
Esta dúvida também é muito im-
portante. Não é necessário esperar o
alcance da escala industrial dos resul-
tados da pesquisa para, então, reque-
rer a proteção deles. De forma algu-
ma. O momento exato para requerer
a proteção é tão logo se comprove a
aplicação desejada, a exemplo da ati-
vidade antiinflamatória supracitada. Ge-
ralmente, esta comprovação ocorre
ainda na escala de laboratório. Assim,
neste caso, este é o momento adequa-
do. E todo este cuidado deve ser
realizado de forma a evitar que tercei-
ros, a exemplo de grupos de pesquisa
que estejam trabalhando em projetos
similares, depositem pedidos de pa-
tentes prioritariamente.
9) O titular precisa esperar a
concessão da patente para poder
comercializar o seu objeto de forma
privilegiada?
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 65
Não. Afinal, quando se deposita
um pedido de patente já se adquire a
expectativa de direito sobre o objeto
do pedido. Logo, a partir do depósito,
quem quer que deseje explorar o seu
conteúdo comercialmente terá que
solicitar a autorização daquele que
depositou o pedido.
10) E se o pedido de patente não for
concedido?
Será necessário devolver o di-
nheiro àquele a quem o depositante
autorizou a exploração econômica?
Não. Apenas, a partir da data da nega-
tiva ao pedido de patente, este não
precisará mais pagar pela sua utiliza-
ção no território do país que negou tal
proteção.
11) Quem concede patentes no
Brasil?
Trata-se do Instituto Nacional da
Propriedade Intelectual/INPI, o qual
possui um quadro de funcionários
especializados em diferentes áreas do
conhecimento humano. Dentre estes
funcionários, encontram-se os exami-
nadores de pedidos de patente, os
quais analisam a patenteabilidade das
informações contidas nos pedidos de
patente depositados e, assim, conce-
dem ou não a proteção por patentes.
O INPI está localizado no Rio de Janei-
ro.
12) Mas, e se o interessado não morar
no Rio de Janeiro? Como poderá re-
querer tal proteção?
O INPI possui delegacias em ou-
tros estados, as quais estão prontas
para receber os referidos pedidos. O
Instituto também fornece a alternativa
dos pedidos serem encaminhados via
correio.
13) Qual é o tempo de vigência de
uma patente? E depois da expiração
deste prazo, o que ocorre?
A patente possui a vigência de 20
anos, contados da data do depósito do
pedido de patente. Após este prazo, a
matéria objeto da patente é considera-
da de domínio público, podendo ser
livremente utilizada por qualquer indi-
víduo interessado nela.
14) A quem pertencem as invenções?
A Lei de Propriedade Industrial
Brasileira – Lei 9279/96 (Brasil, 1996)
– determina que, quando a obtenção
dos resultados de uma pesquisa esti-
ver associada a um contrato de traba-
lho cuja execução ocorra no país, a
invenção pertence ao empregador.
Aqueles que participaram da pesquisa
podem ser denominados inventores.
Em outro caso, quando a pesquisa
resultar de atividades não relacionadas
ao contrato de trabalho e o pesquisa-
dor não utilizar qualquer tipo de recur-
so do empregador, a invenção perten-
cerá exclusivamente ao empregado.
Por último, quando a obtenção dos
resultados da pesquisa estiver associa-
da à contribuição pessoal do emprega-
do e de recursos do empregador, en-
tão a invenção pertencerá a ambos.
15) Os inventores recebem algum
tipo de prêmio pelo desenvolvimento
de resultados objeto de documentos
de patente?
No caso da obtenção dos resulta-
dos estar associada ao contrato de
trabalho, ainda de acordo com a Lei de
Propriedade Industrial Brasileira – Lei
9279/96 (Brasil, 1996) – as entidades
da administração pública deverão, a
título de incentivo, prever premiação
aos inventores sobre os valores
auferidos com o pedido de patente ou
com a patente concedida.
16) Depois do depósito do pedido de
patente ou da patente concedida,
ainda é necessário mais algum tipo
de providência?
Sim. É importante que o reque-
rente não se esqueça de pagar as taxas
de manutenção do pedido, ou seja, as
anuidades deles. O mesmo deverá ser
feito após a concessão da patente. Ao
longo do período de vigência do pedi-
do de patente ou da patente concedi-
da, caso sejam feitas quaisquer tipos
de exigências pelos órgãos oficiais
que concedem patentes, elas também
deverão ser cumpridas dentro de pra-
zos estipulados por eles, sob pena de
perda do pedido de patente ou da
patente concedida.
17) Qual a diferença entre ‘autor’ e
‘inventor’?
Na área de patentes, o significado
de ‘inventor’ é diferente daquele ca-
racterístico para o ‘autor’ de um traba-
lho científico. ‘Inventor’ é aquele que
contribuiu intelectualmente para o
desenvolvimento da pesquisa e a con-
seqüente obtenção dos resultados. Não
é aconselhável incluir como ‘invento-
res’ aqueles que desempenharam ape-
nas atividades mecânicas ao longo da
pesquisa, não tendo exercido qual-
quer papel intelectual no decorrer
dela. Porém, há a necessidade de que
tal decisão seja tomada de forma sen-
sata, a fim de se evitar que injustiças
sejam cometidas.
Em relação às idéias equivocadas
a respeito do tema “patentes”, a inves-
tigação que originou o presente artigo
determinou que as mais comuns são
aquelas descritas a seguir:
1) ‘“Patentear” resultados de pesqui-
sa custa caro!’
É preciso ter cuidado ao realizar
tal afirmativa. No Brasil, a taxa de
depósito de um pedido de patente
custa, no máximo, R$140,00. E de
acordo com a Resolução 104/03 do
INPI, esta retribuição é reduzida em
cerca de 60% quando os requisitantes
forem pessoas naturais, ou
microempresas, ou instituições de en-
sino e pesquisa, ou sociedades/associ-
ações com intuito não-econômico ou
órgãos públicos (INPI, 2004).
No que dizrespeito às anuidades
de um pedido de patente ou de uma
patente concedida, os seus valores
variam de R$ 195,00 até R$ 1.950,00.
Porém, é importante ressaltar que,
assim como mencionado para a taxa
de depósito, também existe a mesma
possibilidade de redução de 60% so-
bre os valores destas anuidades (INPI,
2004).
Contudo, é importante mencio-
nar que, no exterior, os custos não são
da mesma ordem de grandeza daque-
les em nível nacional. Para se efetuar
o depósito de um pedido de patente
em qualquer país, é necessário utilizar
os serviços de escritórios de proprie-
66 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
dade intelectual existentes neles. E
cada um destes escritórios cobra, além
das taxas oficiais associadas aos pedi-
dos de patente ou às patentes conce-
didas, honorários referentes às suas
atividades profissionais. E tais cobran-
ças são feitas na moeda local. Logo,
apenas tendo como base o dólar ame-
ricano, é possível verificar como as
ordens de grandeza são diferentes em
relação aos custos com os pedidos de
patente ou patentes concedidas no
Brasil.
Todavia, é importantíssimo res-
saltar que algumas universidades e
instituições de pesquisa brasileiras já
contam com setores especializados
em patentes dentro das suas instala-
ções, os quais têm todo o apoio
institucional para, caso julguem perti-
nente, arcar com os custos
supracitados. Sem dúvida alguma, tais
setores são fundamentais aos pesqui-
sadores como um todo e para as pró-
prias universidades ou instituições.
Alguns deles já encontram-se mais
estabelecidos do que outros, na medi-
da em que possuem mais experiência
neste tipo de atividade, seja perante a
própria universidade/Instituição, seja
perante o ambiente externo a elas.
Neste caso podem ser incluídas, por
exemplo, a Coordenação de Gestão
Tecnológica da Fundação Oswaldo
Cruz e a Área de Propriedade Intelec-
tual do CENPES/Petrobrás, as quais
vêm, ao longo dos anos, difundindo as
suas experiências àqueles interessa-
dos no assunto. Outros setores
especializados em assuntos relaciona-
dos à propriedade intelectual, tal como
a patente, apesar de não instituídos há
muito tempo, estão se consolidando a
cada dia (REPICT, 2003).
Os empresários locais, por sua
vez, têm a oportunidade de contar
com os serviços de escritórios priva-
dos especializados no presente tema.
O Brasil conta com escritórios alta-
mente qualificados para o desempe-
nho de atividades relacionadas às pa-
tentes, dentre outras.
Porém, seja no âmbito das univer-
sidades e instituições de pesquisas
seja no setor privado, a utilização des-
te tipo de serviço especializado ainda
é muito tímida. Normalmente, esta
procura é espontânea, ou seja, por
parte de apenas alguns integrantes de
Intituições ou poucos empresários
nacionais. O número de pedidos de
patente depositados ou de patentes
concedidas, por exemplo, não é con-
dizente com o tamanho e a importân-
cia das universidades e instituições de
pesquisa brasileiras nos cenários naci-
onal e internacional.
2) ‘Por ser pesquisador e trabalhar
em benefício da sociedade, não é
correto ter preocupação em “patente-
ar”! Afinal, tal atitude seria uma es-
pécie de lucro sobre a sociedade!’
Também é fundamental ter cau-
tela ao afirmar que, por trabalhar em
uma instituição pública, não é possível
pensar em ‘patentes’. Justamente pelo
fato de a instituição ser pública, e cujo
principal objetivo é realizar pesquisas
no intuito de trazer benefícios à socie-
dade, torna-se importantíssimo uma
reavaliação de tal conceito. Afinal, caso
uma instituição pública seja detentora
de um pedido de patente ou de uma
patente concedida, ela poderá produ-
zir o objeto de tal documento patente
sem qualquer tipo de concorrência.
Então, poderá fornecê-lo gratuitamen-
te à sociedade e não ser influenciada
pelos preços estabelecidos pelo mer-
cado. Por outro lado, se tal instituição
não puder produzir este objeto, ela
ainda tem o direito de licenciar a
produção a um interessado capaz de
realizá-la e, com os benefícios oriun-
dos de tal exploração econômica, po-
derá investir no desenvolvimento de
novos projetos de pesquisa que visem
atender aos anseios da população na-
cional.
3) ‘A Patente impede a publicação de
artigos científicos!’
Esta noção é completamente
equivocada. De forma alguma a pa-
tente impede a publicação de artigos
científicos. Na realidade, é importante
apenas atrasar a divulgação dos resul-
tados da pesquisa até que o respectivo
pedido de patente seja depositado.
Por exemplo, caso um pedido de
patente seja depositado junto ao INPI
hoje às 8:00 hs da manhã, às 8:01hs já
é possível realizar tal divulgação.
Porém, é importante enfatizar que,
em uma situação ideal, seria aconse-
lhável revelar os resultados contidos
em um pedido de patente após um
prazo de 18 meses contados do depó-
sito prioritário. Esta recomendação é
baseada no fato do pedido ficar sob
sigilo, por exemplo, no Instituto Naci-
onal da Propriedade Industrial do Bra-
sil/INPI, durante o período em ques-
tão. Neste prazo, caso um terceiro
procure obter informações sobre o seu
pedido de patente, não terá êxito. As
informações apenas poderão ser ad-
quiridas após o término de tal período.
Assim, nesta situação ideal, o pesqui-
sador estararia em posição vantajosa
em relação a terceiros que atuam em
projetos de trabalho similares ao rela-
cionado a sua pesquisa.
Contudo, é notória a forma de
averigüação da produtividade dos pes-
quisadores nacionais. Logo, nos casos
em que os pesquisadores utilizam o
benefício da proteção dos seus resul-
tados mediante o sistema de patentes,
o máximo que os profissionais da área
de patentes conseguem é um atraso
da revelação da invenção até que o
depósito do pedido de patente seja
realizado. Comumente, após esta data,
tais pesquisadores enviam os seus ar-
tigos para publicação, ou revelam os
seus resultados em congressos etc.
4)‘Caso resultados de pesquisa sejam
revelados antes do depósito de um
pedido de patente, já não há chance
de se obter qualquer proteção
para eles’
Cabe ressaltar que, caso todos os
resultados de uma pesquisa sejam re-
velados anteriormente ao depósito de
um pedido de patente, ainda há
chance de se requerer proteção para
eles em alguns países, e mediante o
sistema de patentes. A justificativa
para esta afirmação é dada pelo fato
de determinados países, a exemplo
do Brasil, dos Estados Unidos e Japão,
estabelecerem uma espécie de prazo
de carência, conhecido como “perío-
do de graça”, para o depósito de
pedidos de patentes posteriores à di-
vulgação de seus conteúdos. Assim,
caso o pedido de patente seja deposi-
tado dentro de tal período, não será
considerado qualquer prejuízo ao aten-
dimento do requisito da NOVIDADE.
No Brasil e nos Estados Unidos, por
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 67
exemplo, tal prazo é de 12 meses
contados a partir da data da revelação
em questão. No Japão, por sua vez,
este período é de 6 meses a contar de
tal divulgação (Brasil, 1996; Japan,
1999; United States, 2001). Porém, a
maioria dos países não apresenta este
tipo de salvaguarda. Logo, para este
tipo de divulgação prévia, os territóri-
os onde a proteção poderá ser
requerida fica bastante restrito.
Ainda é necessário enfatizar que,
quando da revelação parcial das infor-
mações resultantes de uma pesquisa,
é fundamental analisar cada palavra
utilizada ao longo de tal revelação.
Desta forma, será possível identificar
se houve comprometimento total ou
parcial quanto à NOVIDADE dos resul-
tados da pesquisa. Caso haja um com-
prometimento total, apenas será pos-
sível requerer a proteção nos países
que permitem a utilização do período
de graça. Por outro lado, caso o con-
teúdo revelado não comprometa to-
talmente a NOVIDADEda invenção, o
pedido poderá ser depositado em
qualquer território desejado. Todavia,
nestes casos, naqueles países sem o
chamado “período de graça”, apenas
os elementos da invenção não revela-
dos anteriormente poderão ser
privilegiáveis. Nos territórios que apre-
sentam tal prazo de carência, a inven-
ção poderá ser protegida por comple-
to.
Também é imprescindível co-
mentar que, para os casos onde não
há como evitar a divulgação dos resul-
tados de uma pesquisa em data ante-
rior ao depósito de um pedido de
patente, é aconselhável verificar a
possibilidade de revelar as informa-
ções principais sob a forma mais geral
possível. Por exemplo, em vez de
mencionar a espécie de uma planta
cujo extrato possui atividade
farmacológica, é prudente relatá-la
apenas pelo nome do seu gênero, ou
da sua família, ou até mesmo de um
modo codificado, a exemplo de ‘plan-
ta X’. Todo este cuidado, realmente,
visa “esconder as informações ou não
abrir o jogo” e, assim, procurar se
defender quanto a futuros
questionamentos em relação ao não
atendimento dos requisitos de
patenteabilidade por parte dos resul-
tados da pesquisa.
5)‘A patente impede a defesa de tese!’
Assim como no item anterior, esta
informação não deve ser generalizada.
Caso não haja a possibilidade de se
depositar um pedido de patente antes
da defesa de uma tese relacionada ao
conteúdo do referido pedido, há uma
alternativa que vem sendo aceita por
diversas universidades e instituições
de pesquisa brasileiras: realizar uma
“defesa de tese fechada”. Ou seja,
apenas os membros da banca e os
orientadores poderão assistir a dita
defesa, mediante a prévia assinatura
de um documento intitulado “termo
de confidencialidade”. Através da assi-
natura deste termo, estes se compro-
metem a não divulgar o conteúdo da
pesquisa até que o pedido de patente
seja depositado, ou até que termine o
processo de análise da patenteabilidade
dos resultados desta pesquisa e, então,
se conclua que eles não são
patenteáveis e, portanto, podem ser
divulgados. Todavia, há locais que não
aceitam este tipo de defesa, afirman-
do que ela deve ser pública e, portan-
to, podendo ser assistida por qualquer
pessoa interessada no tema. Logo,
esta alternativa somente pode ser em-
pregada quando da sua permissão por
universidades e instituições de pes-
quisa.
6) ‘O examinador de pedido de paten-
te verificará se os meus resultados são
tóxicos!’
É fundamental esclarecer que
um examinador de pedido de paten-
te, quando da análise da pertinência da
proteção dos resultados de uma pes-
quisa pelo sistema de patentes, ape-
nas pode considerar os três requisitos
de patenteabilidade comentados an-
teriormente. Então, por exemplo, no
caso de uma pesquisa que envolva
uma composição para combater a asma,
eles não podem julgar se ela é tóxica
ou não. Este papel é conferido ao
órgão oficial de registro de medica-
mentos de cada país.
7) ‘Os meus resultados são novos!’
Não é aconselhável afirmar a
NOVIDADE de resultados de pesqui-
sa, apenas tendo como base uma revi-
são bibliográfica feita na literatura ci-
entífica. Porém, tal afirmativa é bas-
tante freqüente no meio acadêmico
nacional.
Ainda como uma conseqüência
da falta de estímulo ao aprendizado
sobre o sistema de patentes, os pes-
quisadores brasileiros não possuem
uma noção sobre a importância da
literatura patentária como uma fonte
de informação técnico-científica. Não
seria exagero afirmar que o mesmo
quadro pode ser aplicado aos empre-
sários nacionais.
Neste sentido, é fundamental sa-
lientar que a literatura patentária é
constituída por documentos de paten-
te provenientes de diversos países do
mundo, sejam estes pedidos de pa-
tente ou patentes concedidas. Um
levantamento realizado por especia-
listas na área de patentes verificou
que este tipo de literatura contém
documentos inéditos, os quais não
foram revelados sob nenhuma outra
forma de divulgação e, no caso de
terem sido revelados, tal revelação
somente aconteceu após o depósito
do respectivo pedido de patente
(Macedo et al, 2001). Desta forma, é
possível enfatizar que a literatura de
patentes é caracterizada por conter
informações inéditas e atuais, as quais
estão relacionadas às diferentes áreas
do conhecimento humano.
Então, antes de iniciar qualquer
projeto de pesquisa, assim como ao
longo de todo o seu desenvolvimento
e, finalmente, quando da análise da
patenteabilidade dos resultados dele,
é imprescindível observar não apenas
a literatura científica, como também a
literatura patentária. Desta forma, é
possível evitar a chamada “reivenção
da roda”, ou seja, a obtenção de resul-
tados outrora obtidos por terceiros,
não desperdiçando tempo e recursos
em algo já desenvolvido anteriormen-
te. E, além disso, a constante análise
das informações contidas na literatura
patentária permite direcionar a pes-
quisa no sentido da obtenção de resul-
tados passíveis de proteção pelo siste-
ma de patentes.
Mas, como verificar se determina-
dos resultados de pesquisa atendem
aos requisitos de patenteabilidade? Os
profissionais vinculados à área de pa-
tentes costumam empregar o seguin-
68 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
te raciocínio ao longo da execução das
suas atividades: uma pesquisa é de-
senvolvida com o objetivo de solucio-
nar um determinado problema. Este
problema, o qual pode ser novo ou
antigo, é o que funciona como uma
motivação para o delineamento de
uma linha de investigação e a conse-
qüente obtenção da solução almejada.
Logo, a forma empregada para soluci-
onar o problema original constitui uma
obra do intelecto humano e, desta
forma, precisa ser analisada quanto ao
atendimento aos requisitos de
patenteabilidade.
Assim, é importante verificar se
esta forma já era previamente conhe-
cida, por exemplo, pelo fato de tercei-
ros já a terem empregado para soluci-
onar o mesmo problema. Caso tal
forma seja completamente inédita, os
resultados são patenteáveis. Mas, se
forem encontradas formas similares,
estas deverão ser analisadas quanto a
possíveis diferenças em relação àque-
la do pesquisador. Contudo, não sendo
possível identificar qualquer diferença
que comprove o ato inventivo associ-
ado à pesquisa ora em foco, há um
sério comprometimento da
patenteabilidade dos seus resutlados
e, portanto, não é aconselhável reali-
zar o depósito do pedido de patente.
Porém, caso seja possível identificar
vantagens do trabalho do pesquisador
perante aqueles decorrentes das lite-
raturas científicas e patentárias, estas
deverão ser apontadas no pedido de
patente de maneira a defender a
patenteabilidade dos seus resultados.
A literatura de patentes pode ser
consultada mediante uma busca ma-
nual, ou através de uma busca
informatizada. A “busca manual” é de-
finida como aquela realizada no que
pode ser denominado “bibliotecas de
patentes”. Os documentos são arqui-
vados de acordo com uma classifica-
ção internacional de patentes, a qual
foi criada para facilitar a recuperação
das informações e, assim, evitar que os
usuários tenham que observar todos
os documentos de patente publicados
até a atualidade, quando, na verdade,
têm o interesse apenas por um deter-
minado ramo do conhecimento
tecnológico (WIPO, 2003). O Instituto
Nacional da Propriedade Industrial do
Brasil/INPI, assim como diversas re-
partições oficiais de propriedade inte-
lectual ao redor do mundo, possuem
um acervo contendo documentos de
patente originários de vários países.
Assim, o interessado pode compare-
cer a tais bibliotecas e, então, pesquisar
os referidos documentos manualmen-
te.
Porém, há um outro tipo de bus-
ca, a “busca informatizada”, cuja reali-
zação é feita via off-line (CD-ROMs)
ou via on-line (páginas eletrônicas).
Os dois tipos de possibilidade de “bus-
ca informatizada” propiciam uma aná-
lisede documentos de patente prove-
nientes de diversas regiões do mundo,
dependendo do acervo disponível.
Contudo, a busca on-line contém do-
cumentos mais atuais do que a busca
off-line. A “busca informatizada” per-
mite a realização de procura por pala-
vras-chave, por nomes de inventores
e/ou instituições que possuem docu-
mentos de patente, por ano de depó-
sito do pedido de patente, dentre
outras várias opções de procura.
Ainda é importante citar que al-
gumas páginas eletrônicas são priva-
das, logo cobram pela realização da
busca. Outras, porém, são gratuitas.
Dentre estas, é possível destacar as
presentes nas páginas eletrônicas do
INPI (www.inpi.gov.br) e das Reparti-
ções Oficiais de Propriedade Intelec-
tual dos Estados Unidos (United
States Patent and Trademark Office/
USPTO) e da Europa (European Patent
Office/EPO), respectivamente
‘www.uspto.gov’ e ‘http://
www.european-patent-office.org/
espacenet/info/access.htm’. Esta últi-
ma proporciona a busca em documen-
tos de patente dos mais variados paí-
ses, além de possibilitar a impressão
dos referidos documentos na sua ínte-
gra. A página americana apenas possi-
bilita a procura em documentos de
patente americanos, mas também
permite a impressão deles. A página
brasileira, por sua vez, permite a busca
em documentos de patente brasilei-
ros. O INPI está realizando esforços no
intuito de possibilitar a impressão inte-
gral dos documentos de patentes em
questão.
5) É “produto da natureza”, então
não é patenteável!
Esta afirmativa também não é
verdadeira. Afinal, cada país possui a
sua lei associada às patentes e, depen-
dendo do país onde se deseja obter a
proteção dos resultados de trabalhos
com extratos de plantas e seus deriva-
dos, será possível, ou não, a proteção
para todos os elementos integrantes
de tais pesquisas.
Nestas situações, o ponto primor-
dial é a observação daquilo que uma
dada legislação interpreta como uma
descoberta ou como uma invenção.
Esta interpretação evidencia quais re-
sultados podem ser protegidos em
seus territórios, tendo em vista que, ao
contrário de uma INVENÇÃO, uma
DESCOBERTA não pode ser patente-
ada.
Neste sentido, é pertinente sali-
entar que o conceito de invenção está
relacionado a uma nova solução para
um problema técnico de produção.
Este problema pode ser antigo ou
novo, a exemplo de, respectivamen-
te, como criar ou aperfeiçoar um pro-
cesso de extração de princípios ativos
de uma determinada planta ou um
novo produto para atender a uma
necessidade antes inexistente. Entre-
tanto, a solução, para ser invenção,
precisa ser obrigatoriamente nova, ou
seja, ninguém havia criado anterior-
mente a idéia ou, pelo menos, nin-
guém a havia divulgado ou dado aces-
so de sua informação ao público. En-
tão, pode-se afirmar que invenção é
diferente de descoberta. Os conheci-
mentos resultantes das descobertas
podem ser livremente utilizados por
todos, uma vez que consistem apenas
em informações previamente exis-
tentes na natureza e que apenas estão
sendo reveladas de forma a acrescen-
tar a gama de informações em poder
do homem. Logo, estas não podem ser
protegidas através das patentes, uma
vez que a proteção patentária se des-
tina, de forma única e exclusiva, às
criações essencialmente relacionadas
à fabricação de mercadorias tangíveis
(incluindo processos de produção),
por definição, as invenções.
Assim, especificamente na área
de pesquisas com extratos de plantas
e seus derivados, cada resultado deve
ser analisado individualmente, a fim
de verificar se eles constituem matéri-
as patenteáveis. Caso estes não sejam
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 69
passíveis de proteção, não há sentido
em avaliar se apresentam NOVIDA-
DE, ATIVIDADE INVENTIVA ou APLI-
CAÇÃO INDUSTRIAL.
Focalizando a atenção no Brasil, a
observação da Legislação de Proprie-
dade Industrial Brasileira - Lei 9279/96
(Brasil, 1996), especificamente os ar-
tigos 8, 10 e 18, permite verificar os
resultados de pesquisas com extratos
de plantas e derivados que são passí-
veis de proteção no território nacional.
Uma vez que, conforme a Lei
9279/96, “o todo ou parte de seres
vivos naturais e materiais biológicos
encontrados na natureza, ou ainda
que dela isolados”, não é considerado
uma invenção, é possível concluir que
um extrato de uma determinada plan-
ta, ou qualquer substância extraída
dele, não pode ser protegido pelo
sistema de patentes no território naci-
onal. No país, tais resultados não são
considerados resultantes do intelecto
humano, mas sim a descoberta de
informações já existentes na natureza
e que, agora, foram simplesmente
detectadas.
Porém, é importante esclarecer
que composições que contenham tais
extratos ou moléculas isoladas deles,
caso apresentem alguma finalidade, a
exemplo de uma determinada ativida-
de biológica, são passíveis de prote-
ção por patentes no Brasil. Apesar de
conterem “produtos da natureza”, elas
não são classificadas como tal.
Outros resultados de pesquisas
na área em questão, os quais podem
ser privilegiáveis no país pelo sistema
de patente, são aqueles correspon-
dentes aos processos de obtenção de
extratos ou de substâncias provenien-
tes dos mesmos. Estes processos, caso
sejam novos, possuidores de atividade
inventiva e de uma aplicação industri-
al, também são patenteáveis em nível
nacional.
Desta forma, é falsa a idéia de que
qualquer resultado de pesquisa associ-
ado a produtos da natureza não pode
ser protegido no Brasil. Porém, a rea-
lidade nacional, conforme ressaltada
na introdução do presente artigo, evi-
dencia que nem o pouco de proteção
concedida no país é utilizado pelos
pesquisadores ou empresários nacio-
nais. Mais uma vez, cabe ressaltar que
o importante é analisar individualmen-
te cada resultado da pesquisa. Neste
sentido, não é correto generalizar!
Outro ponto considerado bastan-
te pertinente à compreensão do tema
“patentes” é a clara noção das diferen-
ças existentes entre um documento
de patente e um artigo científico.
Afinal, não basta ter o conhecimento
dos conceitos relevantes ao assunto
em questão, a exemplo do que é ou
não passível de proteção no Brasil. É
fundamental ter a compreensão acer-
ca das características de um documen-
to de patente, ou melhor, sobre a
espécie de informações necessárias à
elaboração dele.
Um artigo científico, geralmente,
é organizado de uma maneira muito
familiar aos pesquisadores e aos em-
presários. Comumente contém uma
introdução, a descrição dos materiais e
métodos utilizados no desenvolvimen-
to da pesquisa e, em seguida, há a
apresentação dos resultados obtidos,
assim como a discussão e a conclusão
deles. Uma lista de referências empre-
gadas ao longo da elaboração do artigo
também é fornecida. Adicionalmente,
não é exagero afirmar que cerca de
70% das informações contidas em um
artigo científico correspondem a ape-
nas uma das diversas divisões de um
documento de patente: os ‘exem-
plos’.
O documento de patente é com-
posto pelo ‘Relatório Descritivo’,
‘Reivindicações’, ‘Figuras’ (se houver)
e ‘resumo’ (Macedo et al, 2001). No
que diz respeito ao ‘Relatório Descri-
tivo’, este é subdividido em:
a) Título da Invenção;
b) Fundamentos da Invenção;
c) Sumário da Invenção;
d) Breve Descrição das Figuras
(se houver);
e) Descrição Detalhada da Inven-
ção, e
f) Exemplos.
Especificamente em relação às
pesquisas com extratos de plantas e
seus derivados, é interessante desta-
car as informações indispensáveis em
cada um dos itens mencionados ante-
riormente.
Assim, nestes casos, o ‘Título da
Invenção’, como o próprio termo diz,
representa a denominação conferida à
pesquisa, não devendo conter nomes
de fantasia, tal como “melhor”, “mara-
vilhoso”, etc. No que diz respeito aos
‘Fundamentos da Invenção’, ele deve
retratar o cenárioda área tecnológica
referente às plantas, a qual está mais
vinculada à matéria objeto da inven-
ção. Logo, esta subdivisão deve salien-
tar, por exemplo, os principais proble-
mas característicos no campo da iden-
tificação e obtenção de princípios ati-
vos provenientes de plantas, o que
tem sido feito para solucioná-los, quais
as desvantagens associadas e, princi-
palmente, aquilo que ainda necessita
ser realizado. O ‘Sumário da Invenção’
apresenta, de forma sucinta, os resul-
tados do pesquisador como a solução
para a eliminação de dificuldades ain-
da existentes no ramo tecnológico em
questão, caracterizando-os como aqui-
lo que necessitava ser (e foi) desen-
volvido. Neste sentido, fornece uma
breve noção sobre as concretizações
da invenção. Através da ‘Breve Descri-
ção das Figuras’, o elaborador nomeia
cada figura integrante do pedido, es-
clarecendo, por exemplo, as suas le-
gendas.
Porém, o relato profundo da in-
venção pode ser encontrado no tópi-
co denominado ‘Descrição Detalhada
da Invenção’. Geralmente, este é um
dos campos que os pesquisadores mais
debatem com os elaboradores do pe-
dido (caso não sejam a mesma pes-
soa), tendo em vista a generalização
aqui realizada. Neste sentido, há uma
frase que traduz todo este debate: “aos
inventores cabe realizar a invenção e,
aos elaboradores de pedidos de pa-
tente, cabe ‘inventar’ a invenção”. Des-
crever detalhadamente a invenção não
significa relatar apenas o que foi reali-
zado pelos pesquisadores em seus
laboratórios, mas sim pensar e, então,
prever todas as variações, ou melhor,
todas as formas possíveis para se rea-
lizar tal invenção. Por exemplo, na
descrição da obtenção de extratos ou
substâncias provenientes de plantas,
devem ser previstos todos os proces-
sos possíveis, com alternativas para os
solventes a serem utilizados, sejam
estes orgânicos ou aquosos, assim como
para as condições da sua realização
(faixas de temperatura viáveis à exe-
cução do processo, etc.). Logicamente,
é primordial manter coerência ao se
descrever todas as alternativas para a
dada invenção.
70 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
A descrição minuciosa e exata da
pesquisa em questão é feita nos exem-
plos. Novamente, fazendo uma analo-
gia com os artigos científicos, nesta
subdivisão do pedido de patente são
revelados os materiais e métodos em-
pregados, assim como os resultados
obtidos e a discussão deles. Logo, em
tal subdivisão deve ser descrita a pes-
quisa conforme realizada no laborató-
rio, informando, por exemplo, o pro-
cesso de extração exato, o solvente
utilizado, a temperatura da operação
etc. Adicionalmente, devem ser des-
critos os testes que comprovam uma
atividade farmacológica alegada, tal
como uma atividade analgésica.
No pedido, também devem ser
apresentadas (caso existam) as figuras
relacionadas à invenção, as quais já
foram nomeadas anteriormente, ou
seja, no campo Breve Descrição das
Figuras. As referidas figuras são nome-
adas neste campo e apresentadas após
os exemplos. Exemplos destas figuras
podem ser representados pelos gráfi-
cos de testes in vitro e/ou in vivo
sobre a atividade dos extratos da in-
venção ou de substâncias isoladas de-
les. Adicionalmente, deve ser inserido
um resumo da invenção, o qual facili-
tará, posteriormente, a leitura rápida a
respeito da invenção em questão e,
portanto, será interessante quando ter-
ceiros realizarem a busca na literatura
patentária. As informações contidas no
resumo são semelhantes àquelas des-
critas para o ‘Sumário da Invenção’.
Ainda é fundamental comentar
sobre as ‘Reivindicações’ de um docu-
mento de patente. Tal subdivisão
corresponde às especificidades da in-
venção para as quais a proteção é
requerida, ou melhor, os aspectos par-
ticulares que os inventores conside-
ram como novidade em relação ao
estado da técnica existente até aquele
momento. Uma vez concedida a pa-
tente, estas irão delimitar e estabele-
cer os direitos do titular da referida
patente sobre a matéria objeto da
proteção. Desta forma, é primordial
ter extrema atenção quando da elabo-
ração do quadro reivindicatório.
As ‘Reivindicações’ podem ser
classificadas em:
a) Reivindicações Independen-
tes, e
b) Reivindicações Dependentes.
As Reivindicações Independen-
tes definem todos os elementos es-
senciais da invenção dentro dos limi-
tes em que esta funciona. Uma reivin-
dicação independente não pode ser
tão ampla a ponto de abranger o
estado da técnica, nem tão restrita de
forma a conferir oportunidade para
que terceiros produzam o objeto da
patente, porém sem violá-la. Logo, a
maneira de solicitar a proteção medi-
ante tais reivindicações dependerá da
comparação entre os resultados do
pesquisador e aqueles decorrentes das
buscas nas literaturas científica e
patentária. Podem existir tantas rei-
vindicações independentes quantas fo-
rem necessárias para proteger a in-
venção. No que diz respeito às Reivin-
dicações Dependentes, estas têm por
objetivo proteger detalhes específi-
cos da invenção, os quais já devem
estar mais amplamente abrangidos nas
relativas reivindicações independen-
tes.
Um exemplo de Reivindicação
Independente a ser apresentada ao
INPI é descrito a seguir:
1) Composição com atividade
farmacológica, em especial atividade
antiinflamatória, caracterizada por
compreender um extrato selecionado
do grupo consistindo do extrato bru-
to aquoso da planta (colocar a es-
pécie da planta), do extrato bruto
orgânico da planta (colocar a es-
pécie da planta), de frações do
extrato bruto aquoso da planta (co-
locar a espécie da planta), de
frações do extrato bruto orgânico da
planta (colocar a espécie da plan-
ta) e um veículo farmaceuticamente
aceitável.
Quanto à Reivindicação Indepen-
dente, a mesma pode ser exemplificada
da seguinte forma:
2) Composição de acordo com a rei-
vindicação 1 caracterizado pelo fato
da fração ser uma das frações do
extrato metanólico da raiz da planta
(colocar a espécie da planta).
De uma forma geral, é possível
afirmar que o conteúdo básico de uma
determinada reivindicação pode ser
mantido inalterado quando dos depó-
sitos de pedidos de patente em dife-
rentes países. Logicamente, será ne-
cessário realizar algumas adequações
conforme cada regulamentação local.
Por exemplo, no Brasil, é necessário
escrever a expressão ‘caracterizado(a)
por’, ou ‘caracterizado(a) pelo fato’,
antes de mencionar o que diferencia
um resultado daqueles já conhecidos
no estado da técnica. Um outro termo
comumente utilizado é ‘de acordo
com a reivindicação’, a fim de expres-
sar a relação de dependência de uma
reivindicação dependente a uma de-
terminada reivindicação independen-
te.
Ainda é interessante ressaltar um
artifício comumente empregado por
especialistas na área de patentes: a
generalização. Ou melhor, é funda-
mental ter a noção de que ao
‘elaborador’ de um pedido de patente
é fundamental requerer a proteção
dos resultados de uma forma a mais
ampla possível; pois é ao ‘examina-
dor’ de pedidos de patente que cabe
a função de restringir, ou não, uma
proteção requerida”. Porém, é impres-
cindível manter uma coerência no
momento de utilizar a generalização
em questão.
Neste sentido, observando o
exemplo de reivindicação indepen-
dente supracitado, são apresentadas
diversas opções de extratos e suas
frações, os quais podem ser os ingre-
dientes ativos de tal composição. É
interessante reparar que, na maioria
das vezes, o pesquisador apenas rea-
lizou testes com um tipo de solvente,
a exemplo de um determinado
solvente orgânico. Porém, o elaborador
do pedido precisa estar atento à pos-
sibilidade de não restringir o requeri-
mento de proteção para uma compo-
sição cujo princípio ativo é um extrato
obtido com um solvente orgânico em
particular, mas sim para todos os ex-
tratos obtidoscom qualquer solvente
orgânico. Tal preocupação evita que
um terceiro possa, empregando um
tipo diferente de solvente orgânico,
obter o mesmo resultado do pesquisa-
dor; mas, não violar o documento de
patente pelo fato do escopo do mes-
mo se encontrar restrito. Logo, este
terceiro teria a chance de reproduzir a
pesquisa com fins comerciais e não
precisaria pagar nada a titular do docu-
mento em questão.
Lógico que uma reivindicação in-
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 71
dependente apenas poderá ser elabo-
rada da forma supracitada se a pesqui-
sa puder ser realizada com um extrato
aquoso e diferentes extratos orgâni-
cos. Porém, sabe-se que nem sempre
esta situação é real. Então, em tais
casos não será possível tamanho nível
de abrangência da proteção solicitada.
O mesmo raciocínio pode ser empre-
gado para explicar o emprego do
termo ‘veículo farmacêuticamente
aceitável’ em tais reivindicações.
Assim, o fundamental é sempre
ter atenção a não restringir o escopo
do seu pedido de patente. É melhor
reservar esta preocupação aos exami-
nadores dos mesmos.
Conclusão
Os pontos abordados pelo pre-
sente trabalho evidenciam a gama de
informações relevantes acerca do sis-
tema de patente, em especial quando
da sua aplicação à proteção dos resul-
tados de pesquisas com extratos de
plantas e seus derivados. Sem dúvida
alguma, o tema “patentes” não é im-
possível de ser aprofundado no cená-
rio nacional. Este aprofundamento
merece ser estimulado!
Contudo, é imperativo que idéias
equivocadas, as quais geram precon-
ceitos sobre a utilização do sistema em
questão, sejam completamente elimi-
nadas. Afinal, este sistema de proteção
de invenções não pode ser encarado
como um ‘inimigo’ da sociedade.
Quando compreendido e bem utiliza-
do, o sistema de patentes proporciona
a premiação merecida àqueles que
utilizaram o conhecimento e tornaram
concretas as soluções necessárias ao
desenvolvimento humano. Neste sen-
tido, a sociedade como um todo tam-
bém é beneficiada.
O Brasil é um país privilegiado.
Este país possui a biodiversidade mais
rica do mundo e é dotado de profissi-
onais qualificados para estudá-la. Ape-
sar das pesquisas até então realizadas
por profissionais nacionais, ainda há
muito o que aprender sobre a
biodiversidade brasileira. Ela está aqui,
é alvo de cobiça internacional, mas
precisa ser explorada racionalmente,
e pelos brasileiros. É necessário
compreendê-la e ter orgulho dos re-
sultados decorrentes de tal conheci-
mento, mas é fundamental que se
saiba ocultar as informações resultan-
tes destas pesquisas enquanto neces-
sário. Então, o orgulho também preci-
sa estar associado ao fato de se escon-
der os dados relevantes e somente
revelá-los após tomar os devidos cui-
dados com a sua proteção pelo siste-
ma pertinente. Neste caso em particu-
lar, o sistema de patentes.
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72 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
Pesquisa
Desenvolvimento
Sustentável e biodiversidade
Bernardo Elias Correa Soares
Núcleo de Biossegurança, Vice-Presidência de Serviços
de Referência e Ambiente, Fundação Oswaldo Cruz
bernardo@fiocruz.br
Aldo Pacheco Ferreira
Departamento de Saneamento e Saúde Ambiental,
Escola Nacional de Saúde Pública Sérgio Arouca,
Fundação Oswaldo Cruz
aldoferreira@fiocruz.br
1. Introdução
O Século XX testemunhou o mai-
or e mais rápido avanço tecnológico da
história da humanidade e também as
maiores agressões ao meio ambiente,
decorrentes de um desenvolvimento
que não considerou os impactos rele-
vantes da revolução industrial e a
finitude dos recursos naturais. Por ou-
tro lado, nas últimas décadas, o concei-
to ecológico vem se ampliando, den-
tro de um modelo de desenvolvimen-
to que busca uma relação de equilíbrio,
resgatando uma nova ética na relação
do homem com a natureza (Schramm,
1999).
Até 1972, época da Conferência
de Estocolmo, o modelo de desenvol-
vimento vigente caracterizava-se pela
exploração não-planejada dos recur-
sos naturais, levando à degradação
ambiental. Hoje, presenciamos a cria-
ção de um novo paradigma ambiental,
que tira a natureza de uma posição de
passividade e inércia, concebendo o
meio ambiente como expressão de
criatividade, diversidade e depositário
da inter-relação de todos os seres,
visando à boa sobrevivência e qualida-
de de vida.
Os impactos ecológicos, na vida
cotidiana das sociedades, têm sido gran-
des, afetandoa qualidade de vida das
pessoas, além de semear interroga-
ções e críticas aos modelos de desen-
volvimento socioeconômicos adotados
até então. Tencionando resolver esses
impasses, tivemos a oportunidade de
presenciar reuniões de grande impor-
tância temática, como a Cúpula Mundi-
al para o Desenvolvimento Sustentá-
vel, a Rio + 10, na África do Sul – em
2002, em que observamos que pala-
vras vazias e declarações de efeito
tomaram o espaço de um verdadeiro
Resumo
Apesar do enfoque integrado, hoje praticado, entre condições e conheci-
mentos socioeconômicos e ambientais, o papel desempenhado por essa
integração nem sempre é reconhecido por projetos que envolvam impactos
estratégicos sobre o ambiente, nem figuram seriamente no contencioso das
políticas públicas, principalmente dos países em desenvolvimento. É necessária,
pois, uma abordagem epistemológica que reconheça a responsabilidade coletiva
sobre as crises ambientais globais, indicando-se a necessidade de consideração de
uma ética ambiental nos programas coletivos de sensibilização ecológica. Por
outro lado, os padrões ideológicos e tecnológicos, importados dos países centrais,
não permitem a utilização adequada do potencial ambiental de cada região, o que
pode levar à deterioração dos ecossistemas. Além da gestão racional e ecológica
dos recursos ambientais, os autores concluem que é preciso uma reeducação
ecológico-ambiental, que respeite os critérios de interdisciplinaridade científica,
os ditames de sobrevivência do planeta, bem como as perspectivas diferenciadas
da cultura, do ser e do pensar humanos.
Gestão racional e ecológica dos recursos ambientais
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 73
plano de ações concretas que real-
mente implementasse a chamada
“Agenda 21”, acordada, preliminarmen-
te, na conferência planetária anterior, a
Eco-92, no Rio de Janeiro.
Doblhoff-Dier and Collins (2001)
afirmaram que a Terra, nesse período,
conheceu mudanças hidrográficas, cli-
máticas e biológicas, que diferiram dos
episódios anteriores de mudança glo-
bal, em virtude de que o fator
modificante desta vez é eminente-
mente humano. Os momentos anteri-
ores de mudanças climáticas na história
do planeta não tiveram como causa a
ação humana. O que temos hoje, como
exemplo, é a destruição da camada de
ozônio, atribuída ao acúmulo de
clorofluorcarbonetos (CFCs) na estra-
tosfera, originado em nossas atividades
industriais poluentes; o aumento das
taxas de dióxido de carbono na atmos-
fera, motivado pelo uso crescente de
combustíveis fósseis e pela eliminação
da cobertura florestal, como também a
perda da diversidade biológica
(extinção de espécies e de seus
habitats), em razão da derrubada cres-
cente de áreas tropicais de florestas
úmidas para fins de exploração agríco-
la não-planejada e predatória.
Por outro lado, o crescente au-
mento das liberações ambientais de
organismos geneticamente modifica-
dos – OGMs, em diversas regiões do
planeta, indica, ainda, a necessidade
de mão-de-obra qualificada para ativi-
dades de vigilância e avaliação de
riscos. Atualmente, a preocupação
mundial com a biodiversidade pede
maior compromisso dos cientistas na
luta pela preservação dos recursos
naturais e pelo planejamento de pro-
gramas ligados às questões sociais (So-
ares, 1997). A diversidade de
ecossistemas requer, também, cuida-
dosa análise caso a caso para as solici-
tações de liberação ambiental de OGMs
ou de outros produtos derivados da
biotecnologia (Hood, 2002). Nesse
sentido, é possível dizer-se que, em
futuro próximo, diante das cautelas
adotadas no processo de pesquisa
dos OGMs, evoluiremos da imagem
caricatural que muitas vezes
desfrutam, na opinião pública,
para uma percepção de que,
inequivocadamente, apesar de se cons-
tituírem em novas tecnologias, pode-
rão, no futuro, representar alternativas
eficientes e sem nenhum risco para a
saúde humana e coletiva.
No entanto, para além das deci-
sões técnicas e planejadas somente
pela perspectiva administrativa e eco-
nômica, temos praticamente uma vi-
são unânime de que as variáveis
ambientais devem ser consideradas
sobre qualquer perspectiva de proje-
tos de desenvolvimento. Nessa pers-
pectiva, surgiu a idéia, hoje corrente e
seriamente estudada, do desenvolvi-
mento “sustentável”.
2. Desenvolvimento
sustentável
A necessidade de conciliar desen-
volvimento econômico e preservação
ambiental, duas questões antes trata-
das separadamente, levou à formação
do conceito de desenvolvimento sus-
tentável, que surge como alternativa
para a comunidade internacional. A
consciência de que é necessário tratar
com racionalidade os recursos naturais,
uma vez que estes podem se esgotar,
mobiliza a sociedade no sentido de se
organizar para que o desenvolvimento
econômico não seja predatório, mas
sim, “sustentável”. Tal aspecto é lem-
brado por Leff (2002), ao afirmar que
“a questão ambiental não é ideologi-
camente neutra nem distante dos pro-
blemas sociais e interesses econômi-
cos”. Nesse sentido, as estratégias de
ação política sobre os processos ecoló-
gicos vinculam-se a ações práticas de
desenvolvimento social e é através
dos limites epistemológicos da ciência
que se configura um conceito próprio,
capaz de racionalizar a “complexidade
ambiental”.
No entanto, o processo de de-
senvolvimento sustentável, baseado
na manutenção da biodiversidade e no
equilíbrio dos ecossistemas, requer
mudança completa no comportamen-
to dos processos humanos de produ-
ção diante da natureza. Da mesma
forma como, por exemplo, as inter-
venções sobre saneamento visam ao
controle dos vetores que exercem efei-
tos nocivos sobre a saúde, o desenvol-
vimento sustentável objetiva devolver
ao ser humano os direitos a uma vida
saudável e produtiva, sem que isso
afete negativamente o equilíbrio da
biosfera. Conforme assinalam Ferreira
et al. (2003), o desenvolvimento eco-
nômico deve ater-se ao controle da
poluição e à preservação dos
ecossistemas naturais. De acordo com
Egler (2001), além da necessidade de
constantes avaliações ambientais es-
tratégicas sobre projetos de desenvol-
vimento em territórios circunscritos, o
desenvolvimento sustentável pressu-
põe o estabelecimento de metas de
qualidade ambiental e/ou taxas de
emissão que viabilizem o alcance des-
sas metas; o fortalecimento institucional
para se promover o alcance combina-
do de metas de qualidade ambiental e
de desenvolvimento econômico; e o
uso intensivo de instrumentos econô-
micos para conduzir as economias para
caminhos que viabilizem um desen-
volvimento sustentável efetivo.
3. O crescimento da
consciência ambiental
A consciência ambiental é
estruturada, na atualidade, sobre fatos
reais e confiáveis: a existência do cha-
mado “efeito-estufa”, por exemplo,
confirmada por meteorologistas e ci-
entistas renomados, assim como ou-
tros problemas ecológicos de natureza
global, vem sendo enfocados por orga-
nismos de credibilidade internacional
como a ONU, que notabilizou o seu
programa de estudos ambientais
(PNUMA, 2003), cuja importância vem
sendo acolhida inclusive pelas classes
empresariais dos países em desenvol-
vimento.
A posição pró-ativa de industriais
em relação à questão ambiental é,
entretanto, fato recente. Conforme
Gomes (1998), no entanto, é recente
também o impacto causado pela ativi-
dade industrial humana no ambiente
global. Para o autor, a empresa, que até
há um século mantinha um interesse
quase insignificante em relação à natu-
reza, o que propunha uma visão irres-
ponsável de desenvolvimento, evo-
luiu para uma nova postura, em que
empresários e executivos não se colo-
cam mais em oposição sistemática aos
movimentos e organizações não-go-
vernamentais que defendam,
porventura, o meio ambiente. Introdu-
ziu-se, então, na maioria das empresas,
uma visão nova, de gerenciamento74 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
dos recursos naturais e de exame aten-
to dos projetos em relação a seus
futuros impactos ambientais.
Percebe-se uma mudança na ma-
neira de empresários e industriais en-
xergarem a questão ambiental, com-
preendendo a perspectiva de que os
problemas ambientais globais são, agora,
de responsabilidade não mais de uni-
dades isoladas (instituições, empresas,
comunidades científicas ou governos),
mas sim de toda a sociedade. Nesse
contexto, Christiansen and Sandoe
(2000) concordam em que é inegável
a influência da questão ambiental no
mundo dos empreendimentos, a tal
ponto que as empresas que compre-
enderem tal realidade irão obter vanta-
gens estratégicas. Não se ignora,
tampouco, a dificuldade de se incluir
conceitos novos de gestão ambiental
em qualquer organização, mas tam-
bém não podem ser ignoradas as pres-
sões impostas pelo mercado e pela
sociedade como um todo.
Cortina (1998), por sua vez, apre-
senta abordagem sintética sobre o re-
lacionamento entre economia e meio
ambiente. Argumenta ser difícil, para
não dizer impossível, proteger o meio
ambiente sem o uso de instrumentos
econômicos. Afirma, ainda, que o meio
ambiente sempre fora abordado de
maneira subordinada e suplementar
nos estudos econômicos, o que foi
modificado por nova configuração
paradigmática, em que a economia
passaria a ser integrada e não conflitiva
em relação às questões ecológicas.
Avalia, ainda, que os choques do petró-
leo, nos anos 70 do século passado, e
os acidentes nucleares, radioativos e
de vazamento de combustíveis fós-
seis, que expuseram a evidência de
perigos à sobrevivência dos
ecossistemas, além da possibilidade
de esgotamento de recursos naturais
escassos, produziram transformações
importantes nos conceitos estritamen-
te econômicos, principalmente os afe-
tos à questão do crescimento. Enfatiza,
também que, em nossos dias, desde as
teorias ortodoxas de economia (libe-
rais, neoliberais e neoclássicas), pas-
sando pelas teorias keynesianas e
neokeynesianas e chegando às hete-
rodoxas, como a marxista, coexistem e
são interpenetradas pelos novos con-
ceitos oriundos da “economia
ambiental”, que procura embutir nos
processos econômicos os ciclos
biofísicos do planeta. Assim, a econo-
mia ambiental, recentemente forma-
da, apresenta elementos das teorias
que a precederam, incorporando ele-
mentos de outras áreas de conheci-
mento, como a biologia e a ecologia.
Enfim, ressalta o autor que as respostas
dadas pela economia neoclássica, do-
minante no mundo ocidental até como
uma espécie de “pensamento único”,
não são suficientes para resolverem os
problemas universais de escassez de
recursos, mudanças climáticas globais,
perdas significativas na camada de
ozônio, extinção de espécies essenci-
ais ao equilíbrio ecológico, efeito estu-
fa, etc.
Hoje, o trinômio econômico-soci-
al-ambiental constitui a base do desen-
volvimento sustentável e as decisões
empresariais devem ser avaliadas à luz
dos impactos ambientais, fazendo par-
te da estratégia corporativa da gestão
ambiental em um conjunto de ativida-
des e ações integradas dentro de um
complexo paradigma ecológico
(Fiocruz, 1998; Ferreira, 2000).
4. Gestão empresarial e
meio ambiente no Brasil
É possível valorar e quantificar os
recursos ambientais? É possível formar
uma nova linhagem de gestores
ambientais, que aglutinem vários cam-
pos de conhecimento e sejam capazes
de responder às questões que a nova
consciência do sistema global-ecológi-
co suscitam neste Terceiro Milênio?
Partindo-se do princípio de que os
conceitos econômicos e ecológicos tra-
dicionais não são satisfatórios para ul-
trapassar tais questionamentos (Mar-
ques, 1996), a coexistência de teorias
econômicas diferentes, concebidas ao
longo da história dos países capitalistas
ocidentais, pautou-se pela inclusão das
variáveis ambientais nas múltiplas e
mais importantes teorias. Observando-
se as novas proposições para o relaci-
onamento entre economia/meio am-
biente/gestão ambiental, constata-se
que existe uma convergência no sen-
tido de se valorizar as intenções e
tentativas de valoração dos recursos
naturais, uma vez que as preocupa-
ções ecológicas são fundamentadas
em fatos inegáveis – como vimos – já
disseminados, comprovados pela ci-
ência e adotados pela sociedade como
sinais inequívocos da necessidade de
adoção do novo paradigma.
É necessário esclarecer que esses
níveis de exigência ainda não são total-
mente praticados no Brasil, onde exis-
tem sérias pendências sociais e econô-
micas a serem resolvidas, sobretudo as
desigualdades de rendas, o que não
induz à incorporação completa pelo
desenvolvimento econômico e social
das variáveis ambientais, ainda conta-
minadas por uma visão um pouco
atrasada de preservacionismo, tal como
praticada pelos governos federal e
estaduais, nos idos dos anos 60 do
século passado.
No entanto, vale dizer que, para
um país em desenvolvimento, um es-
tatuto de proteção ambiental e a ava-
liação ambiental como fórmula estraté-
gica não são luxos, mas parte de um
projeto de sustentação da vida huma-
na, melhoria social e de qualidade de
vida para muitos segmentos de popu-
lação desassistidos.
Dessa forma, os alertas de ecolo-
gistas e da comunidade científica de-
vem ser tratados com a máxima aten-
ção, sob pena de o futuro reservar-nos
problemas ainda mais graves. Além
disso, se o desenvolvimento nacional
for orientado por um caminho susten-
tado, pode-se estabelecer uma forma
pioneira de crescimento econômico
que não ensejem os mesmos erros
cometidos pelas nações desenvolvi-
das, que adiaram a preocupação com o
meio ambiente até o limite onde este
não possa mais ser desconsiderado. No
Brasil, pode-se adotar, desde já, uma
consciência de crescimento
ambientalmente saudável, o que não
significa apenas exigências e encar-
gos, ainda que estes possam existir,
mas também oportunidades novas
paras empresas nacionais que consi-
gam se adaptar à nova mentalidade
ambiental.
Egler (2001) argumenta que é
possível quantificar os recursos
ambientais através de sua avaliação
estratégica, que assegurem que fato-
res ambientais e sociais sejam adequa-
damente considerados no processo de
tomada de decisões de desenvolvi-
mento. Em sua forma mais comum,
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 75
uma Avaliação de Impacto Ambiental
pressupõe um procedimento de avali-
ação inicial (“screening”); identifica-
ção dos aspectos econômicos, sociais e
ambientais significativos; preparação
de Estudo de Impactos Ambientais;
revisão do estudo, preparação de rela-
tório e implementação das ações per-
tinentes, que incluam medidas de
mitigação e um sistema de
monitoramento, que objetivem verifi-
car se as medidas foram realmente
implementadas para mitigar os efeitos
negativos ambientais dos empreendi-
mentos. Ainda segundo o autor, ques-
tões como a consideração de diferen-
tes alternativas (economia de escala,
localidade, tempo e tecnologia) e as
medidas de mitigação de efeitos nega-
tivos sobre os ecossistemas (territórios,
bacias, rios, etc...) podem dar uma
perspectiva correta da quantificação
dos recursos naturais em jogo, princi-
palmente se considerarmos devida-
mente que a natureza das interven-
ções feitas em território brasileiro são
significativamente diferentes, se com-
paradas com aquelas feitas em países
europeus ou nos Estados Unidos. Dife-
rentemente desses países, o Brasil ain-
da dispõe de imensas áreas a serem
ocupadas, bem como são díspares os
nossos projetos de eixos de desenvol-
vimento e programas de zoneamento
ecológico e econômico, praticados nos
estados da Federação, e que diferem
fundamentalmente dos projetos lança-
dos por países do Primeiro Mundo.
5. Consideraçõesfinais:
consciência ecológica, socie-
dade e políticas
públicas
Os governos, como organizações
institucionais pesadas, raramente res-
pondem às reivindicações das socieda-
des, o que também ocorreu no plano
das questões ecológicas. Foram mais
de quarenta anos, transcorridos, desde
a década de 60 do século passado, para
que o organograma administrativo dos
governos ocidentais adotassem, siste-
maticamente, ministérios e secretarias
dedicados às questões de controle e
fiscalização de ecossistemas e manan-
ciais hídricos.
Hoje, as questões de exaustão de
reservas de petróleo e de água potável
no mundo vêm ensejando uma série
de conferências preventivas sobre quais
as novas alternativas energéticas a se-
rem usadas (termoelétrica, solar, eólica
etc.), sendo que a comunidade cientí-
fica vem acenando com pesquisas cada
vez mais excitantes nos campos da
biotecnologia, da genética, da química
fina e outras oportunidades a serem
descobertas, inclusive as mais recen-
tes, de fusão dos átomos de hidrogê-
nio.
Os políticos, sempre sensíveis à
opinião pública, perseguem denoda-
damente as percepções de suas popu-
lações sobre a problemática ecológica,
que incluem questões de bem-estar e
qualidade de vida. No entanto, a crise
ambiental é acima de tudo um proble-
ma de conhecimento (Leff, 2000), o
que nos leva a repensar o ser do
mundo complexo e entender suas vias
de complexificação. Esta via de com-
preensão da complexidade ambiental
emerge por meio da desnaturalização
da história natural, que culminou na
tecnificação e economização do mun-
do, com base nas quais o ser e o pensar
se encontram relacionados pelo cálcu-
lo e pela planificação, pela determina-
ção e pela legalidade; deste mundo
dominado e assegurado que chega a
seu limite com o caos e a incerteza.
Leff (2000) assinala que “a crise
ambiental leva-nos a interrogar o co-
nhecimento do mundo, (...)
corporifica um questionamento da
natureza e do ser no mundo, com
base na flecha do tempo e na entropia
vistas como leis da matéria e da vida,
com base na morte vista como lei
limite na cultura que constitui a or-
dem simbólica do poder e do saber.
(...) A complexidade ambiental inau-
gura uma nova reflexão sobre a natu-
reza do ser, do saber e do conhecer,
sobre a hibridização de conhecimen-
tos na interdisciplinaridade e na
transdisciplinaridade; sobre o diálo-
go de saberes e a inserção da subjeti-
vidade, dos valores e dos interesses
nas tomadas de decisão e nas estraté-
gias de apropriação da natureza.”
Quando o homem procura com-
pensar a sua “falta de ser” pelo conhe-
cimento, procura idéias ordenadoras e
absolutas sobre si mesmo e sobre a
natureza, o que faz uma obstrução de
sua capacidade de escolher e respeitar
a diversidade. Parece que, em princí-
pio, as políticas públicas devem ser
redirecionadas no sentido de respeito
à biodiversidade e às diferenças, obe-
decendo a complexidade ambiental,.
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76 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
1.Introdução
ordem isoptera é constitu-
ída por 86 gêneros de inse-
tos, comumente chamados
de cupins, térmitas, siriris
ou aleluias. Estes insetos
de tamanho médio vivem em castas
sociais e apresentam um sistema de
vida comunitária altamente desen-
volvido. Ocorrem nas áreas tropicais
e temperadas do mundo, entre os
paralelos 52º N e 45º S. No Brasil,
cerca de 200 espécies estão, atual-
mente, registradas. Um número, cer-
tamente, subestimado visto que exis-
tem muitas que ainda não foram
detectadas e outras que devem ser
descritas. Segundo Constantino
(1998), na região neotropical, consi-
derada a segunda região
zoogeográfica com maior número de
espécies do mundo, as 5 principais
famílias estão assim distribuídas : I -
família Kalotermitidae (122 spp.) es-
tritamente xilófagos; II - família
Rhinotermitidae (35 spp.) térmitas
de comportamento subterrâneo; III -
família Serritermitidae (1 spp.) IV
Termitidae (381 spp.), considerada
a mais evoluída, subdividida em 3
subfamílias: Apicotermitinae (41
spp.), Nasutitermitinae (248 spp.) e
Termitinae (92 spp.); e, por último,
a família Termopsidae (4 spp). Fo-
ram descritas mais de 1900 espécies
em todo o mundo, entre espécies
vivas e fósseis. De acordo com o
autor entre as cinco famílias acima
mencionadas, as famíl ias
Kalotermitidae e as Rhinotermitidae,
a lém de Mastotermit idae e
Hodotermitidae são famílias de
Pesquisa
Metabolismo da
Celulose em Isoptera
Marcos Barros de Medeiros
Prof. Dr., Departamento de Agropecuária
Centro de Formação de Tecnólogos
Universidade Federal da Paraíba
mbmedeir@yahoo.com.br
Ilustrações cedidas pelo autor
térmitas inferiores, visto que possu-
em formas livres de protozoários nas
partes posteriores de seus intesti-
nos. Esses são protozoários flagelados
simbiontes. Portanto, essas famílias
dependem desses protozoários
flagelados na digestão da celulose.
Ao que tudo indica, a família
Termitidae é a mais evoluída e não
depende desses protozoários. Tra-
ta-se de uma família cujos indivíduos
têm uma digestão evoluída, bastante
numerosa e com grande especializaão
social (Krishna & Weesner, 1969).
Em razão da devastação de seu
habitat natural, as florestas, atual-
mente constituem-se num grande
problema para a humanidade por
invadirem ecossistemas do campo e
das cidades, causando perdas
irreparáveis na agricultura e danos
nas estruturas de edificações que
levam madeira como matéria-prima.
Este artigo tem por objetivo explicar
os mecanismos de digestão envolvi-
dos processo metabólico da celulose
e o papel dos f lagelados
endosimbiontes no trato digestivo
de cupins inferiores.
2.A celulose como principal
alimento dos isopteros
A celulose é um polissacarídeo
complexo de cadeia longa e de ele-
vado peso molecular, cuja composi-
ção (C
6
H
10
O
5
)n é o principal consti-
tuinte estrutural da parede celular
dos vegetais e um importante com-
ponente da madeira. Tem uma es-
trutura vizinha à do amido, onde se
forma longas cadeias helicoidais de
glicose remanescentes. Mas, a celu-
Como agem os flagelados que nidificam o intestino de cupins inferiores
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 77
lose é formada de β -glucosídios (e
não α - glucosídios ), como os cons-
tituintes da celobiose. Este tipo de
ligação glicosídica confere à molécu-
la uma estrutura espacial muito line-
ar, que forma fibras insolúveis em
água. Apresenta-se impregnada por
outras substâncias poliméricas, não
sendo digerida pelos animais, que
não apresentam enzimas para que-
brar as ligações do tipo β, a exceção
de animais herbívoros, que possuem
bactérias e protozoários simbióticos
que digerem a celulose em seus
aparelhos digestivos, a exemplo dos
cupins.
O número de moléculas
freqüentemente elevado, mais de
1500, explica a duração de molécu-
las de certas celuloses. Nas fibras de
madeira e em fibras têxteis, elas são
feitas de linhas de molécula que
chegam até a 10.000. Isto é, um
composto exclusivamente de
polissacarídeos de β- glucosídios. As
amilases e glucosidases atuam
hidrolisando os amidos e glucosídios.
As celulases hidrolisam as celuloses
originando produtos variáveis
(celodrextrinas, celotrioses), da qual
o último é a celobiose (açúcar em
C12), composto por duas moléculas
de glicose. Certas celulases condu-
zem a hidrólise de moléculas libe-
rando totalmente a glicose. A
celobiose composta por um par de
moléculas de glicose, também é
hidrolisada por uma outra enzima, a
celobiase. (Grasse, 1986)
A celulose é um alimento sem o
qual os térmitas não podem sobrevi-
ver, porém outros compostos substi-
tutos, deste glucosídeo, foram en-
contrados. Compostos com o mono
-, di -tri, polissacarídeos e pentoses,
foram rapidamente absorvidos por
Zootermopsis sp. quando submeti-
dos a uma dieta de jejum numa
temperatura acima de 30o C.
(Yamaoka, 1989).
Na madeira existem outros
glicídios, semelhantes ou próximos
celulose, as chamadas hemiceluloses
(termo inadequado, pois são profun-
damente diferentes das celuloses).
Na verdade são açucares em C5
(arabinose, xilose) ou em C6
(manose, galactose, glicose), que
quando condensadas num certo nú-
mero de moléculas, constituem as
pentoses (arabano, xilano) ou
hexoses (mananas, galactanas,
glucanas), as quais prendem-se a
moléculas complexas, L - arabinose,
D ácido - glicurônico, por exemplo,
no caso de xilanoses. Em geral, os
alimentos contêm uma proporão fra-
ca destes componentes, 7 %, na
madeira de Pinus, contra 58% de
celulose, 27% de lignina. Adota-se
valores medianos entre 7 a 12% nos
bosques tenros, 15 têm 30% na ma-
deira dura. A lignina tem uma larga
parte na constituição de na madeira.
Em sua natureza aromática há uma
molécula benzênica (fenil, geralmen-
te). Ela apresenta-se em estrutura
amorfa, insolúvel em solventes habi-
tuais, porém solúvel em fenol e ace-
tona. A estrutura dela é formada por
um polímero complexo de 1.000 a
4.000 monômeros, geralmente de
fenilpropanos. Uma parte da celulo-
se parece unir-se com a lignina
(Grassé 1986).
3.Digestão da celulose
nos isopteros
O sistema digestivo dos isopteros
Figura 01: Celulose
Figura 02: Celobiose
78 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
é considerado desenvolvido e geral-
mente ocupa uma ampla parte de
seu abdômen (Krishna & Weesner,
1969). Grassé (1986) descreve que
seu sistema digestivo é composto
por um tubo que começa no cibarium
ou parte superior da cavidade bucal.
Seguida pela hipofaringe, e posteri-
ormente, diferenciada em três par-
tes distintas: o estomodeumm ou
intestino anterior. Este é formado
por invaginações ectodérmicas que
se inserem entre o tritocérebro (3o
segmento) e às mandíbulas. O
mesêntero ou intestino médio, de
origem endodérmica e responsável
por grande parte da digestão e
absorção, e f inalmente, o
proctodeumm, formado por
invaginações embrionárias do
ectoderma, bastante desenvolvido.
Analisando a anatomia do tubo
digestivo em espécies do gênero
neotropical Tauritermes Krishna, vá-
rias diferenças foram estabelecidas
entre este gênero e outros de
Kalotermitidae, utilizando-se padrões
de comprimento do mesêntero e
observaões da est rutura e
ornamentaão cuticular dos segmen-
tos proctodeais. Estes caracteres do
intestino vêm sendo utilizados em
sistemática e filogenia de térmites e
permite diferenciar outros gêneros
dentro Kalotermitidae, por exemplo
(Godoy, 2004).
A fisiologia digestiva dos
térmitas é dominada por dois fenô-
menos: a) a vida social, acompanha-
da por contínuas trocas e intercâmbi-
os de nutrientes entre indivíduos,
processo denominado de trofolaxia
(trocas de alimentos entre indivídu-
os) e a digestão de material celulósico
com a colaboração de
microorganismos simbiontes locali-
zados em seu proctodeumm uma
região expandida da porão proximal
do intestino posterior. (Krishna &
Weesner,1969)
Até o presente, evidencia-se que
os produtos microbianos da digestão
no metabolismo da celulose são áci-
dos graxos de cadeia curta, princi-
palmente acetato (Yamim, 1980),
que são ativamente transportados
para o inglúvio (Hogan et al, 1985).
O caminho do acetato no metabolis-
mo foi localizado em térmitas junta-
mente com ácidos gordurosos e
lipídeos e o acetato também pode
ser um precursor para aminoácidos,
hidrocarboneto de formação cuticular
e terpenos. (Tonada e Kaya, 1994).
4. Importância dos
flagelados endosimbiontes
no metabolismo da
celulose
Foram relatados mais de 300
espécies de protozoários simbiontes
de cupins (Tonada e Kaya, 1994), 54
delas só em Rhinotermitidae, com a
ocorrência dos principais gêneros Spi-
rotrichonympha, Pseudotrichonym-
pha, Holomastigoides (Kitade & Mat-
sumoto, 1998). Os gêneros Tera-
tonympha, Trichonympha, Pyr-
sonympha, e Dinenympha também
foram relatados por Yamaoka (1989).
Mais recentemente, estudando-se a
patologia desses insetos, verificou-
se, através de exame fecal em fezes
depositadas por operárias, a presen-
ça de flagelados e bactérias. Acredi-
ta-se que a reinfestação ou transmis-
são destes simbiontes para as formas
jovens (ninfas) dos cupins ocorra
através da ingestão de exudatos do
ânus, de origem proctodeica, ou pela
aceitação de alimento regurgitado
pelas operárias, oriundos do mesên-
tero (Tonada e Kaya, 1994). Segun-
do Borror & DeLong (1984) além da
madeira e de seus derivados os cu-
pins também se alimentam de exu-
vias e de fezes excretadas pelas
operárias ou alimentam-se de seus
cadáveres.
Tonada e Kaya (1994) afirmam
ainda que os térmitas menos evolu-
ídos podem ter mutualismo com bac-
térias e protozoários ou unicamente
com protozoários. Os cupins superi-
ores (família Termitidae) são carac-
terizados pelo alto grau de organiza-
ção social e pela ausência de
protozoários simbiontes no seu in-
testino posterior, que é diferenciado
em 5 segmentos: P1 a P5 (Kovoor,
1971).
Segundo Yoshimura et al.
(1994), a digestão da madeira por
protozoár ios endosimbiontes
(zooflagelados) termitícolas obser-
va-se facilmente in vivo. A fagocitose
de fragmentos de madeira por
espécias como Trichonimpha ou
Joenia tem sido observado in-vitro
(Grassé, 1986). A partícula de ma-
deira envolvida pelo citoplasma do
flagelado que se encarrega de
degradá-la (Grassé, 1986). Trager
[citado por Grassé (1986)] descobriu
a existência de uma celulase dentro
do intestino de Zootermopsis
angusticollis e supôs que esta enzima
era sintetizada pelos flagelados
simbiontes. A dieta dos térmitas, a
exemplo dos cupins de madeira seca,
muito pobre em proteínas, contudo,
existe evidência de que a fixação de
Figura 3: Detalhe do interior de uma colônia de Nasutitermes sp.
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 79
nitrogênio por bactérias simbiontes
presentes no inglúvio pode ser uma
fonte significativa de compostos
nitrogenados para esses cupins
(Panizzi & Parra, 1991).
Yoshimura et al. (1994), utili-
zando operárias de Reticulitermes
campinensis, constataram que após
a eliminaçãode Pseudotrichonym-
pha gassii do trado digestivo, houve
uma redução de 30 % na atividade
de atuação digestiva sobre o alimen-
to, afirmando-se que esta espécie
depende largamente destes proto-
zoários.
5. A degradação da celulose
no intestino dos isopteros
A degradação biológica da celu-
lose requer intervenção de várias
enzimas hidrolizadoras. Grassé
(1986) descreveu a seqüência de
enzimas no intestino dos cupins: pri-
meiro agem sobre o alimento as
celulases tipo C1, que atuam
hidrolizando a celulose cristalina,
substância de elevado peso
molecular. Em seguida, ocorrem as
celulases Cx. Estas atuam sobre os
fragmentos de celulose não cristali-
na e sobre outros derivados solúveis
ou produtos superiores, resultantes
da degradação das celuloses. Por
ultimo, segue a ação das celobiases
(β - glucosidases) que atuam sobre a
celobiose e moléculas livres de β -
glicosídeos.
Estudos reportam-se a dois ti-
pos de celulases detectadas na di-
gestão dos térmitas, uma secretada
pela glândula salivar e a outra sinte-
tizada pelo protozoário intestinal.
Estabeleceu-se, significativamente,
uma relação entre a diferenciação
ultra-estrutural e a função de absor-
ção de nutrientes no epitélio do
proctodeum, à ingestão seletiva de
par t ículas de celulose por
protozoários, a contribuição da fauna
de protozoário intestinal e uma in-
fecção oportuna deles. Um outro
fator é a presença de bactérias que
provêm condições boas para
protozoários intestinais (Tonada &
Kaya, 1994).
Atualmente sabe-se que esses
simbiontes agem bem sobre a celu-
lose, porém pouco praticamente
nada se conhece ou sobre as enzimas
que atuam sobre a molécula de
lignina, cuja digestão feita através de
bactérias, e apoiada pela ação de
micélios de basidiomicetos e
ascomicetos e, certamente, também
por protozoários flagelados que se
alimentam de lignina.
As celulases são enzimas tam-
bém encontradas em certas bactéri-
as e outros agentes presentes na
decomposição da madeira. Também
em outras que habitam no estômago
de ruminantes. Conteúdos de celula-
ses também são produzidos pelo
tubo digestivo de Moluscos Lamelli-
branches, e muitos insetos de solo
ou pragas de arvores como Ceram-
bycidae, por exemplo (Grassé,
1986). Exceto pelos cupins cultiva-
dores de fungo (subfamília Macro-
termitinae), os cupins superiores
parecem possuir o conjunto com-
pleto de enzimas necessárias para
digestão de celulose nativa (Schultz
et al. 1986), embora o envolvimento
de bactérias simbiontes na digestão
de celulose não possa ser desconsi-
derado. De acordo com Bignell et al.
(1983), a hidrólise da celulose ocor-
reria na região P3. Similar ao que
acontece com os cupins inferiores, o
nitrogênio é fixado nos cupins supe-
riores através da ação de bactérias
simbiontes (Bentley, 1984) e é pro-
vavelmente incorporado à massa
corpórea do cupim após a ingestão e
digestão das fezes previamente ex-
pelidas. Os cupins cultivadores de
fungo (Macrotermitinae) são capa-
zes de sintetizar as suas próprias
celobiases e celulases Cx. Entretan-
to, as celulases C1 críticas para de-
gradação de celulose são derivadas
dos conidióforos de um fungo que os
cupins cultivam em seus ninhos, e
que consomem em pequenas quan-
tidades, junto com madeira e outros
materiais de celulose que formam a
maior parte de seu alimento (Martin
& Martin 1979). Segundo Wood e
Thomas, (1989), usualmente eles
nidificam em ninhos ou termiteiros
onde cultivam os fungos utilizando
material de origem fecal, como meio
de cultura. Uma vez que a digestão
da celulose provavelmente realiza-
da no intestino médio, ao mesmo
tempo em que a de outros compos-
tos, a fermentação no intestino pos-
terior nos Macrotermitinae; talvez,
não seja muito importante. Presumi-
velmente, essa seria a razão pela
qual Macrotermitinae não apresenta-
ria o segmento misto, que se supõe
seja envolvido com a fermentação
no intestino posterior. (Panizzi &
Parra, 1991). Resultados disponíveis
mostram que celulose, amilase e in-
vertase ocorrem em glândulas sali-
Figura 4: Aspecto de um ninho de Nasutitermes sp. coletado em pomar de citros,
Bananeiras-PB
80 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
vares e intestino médio, enquanto
maltase só encontrada no intestino
médio (Veivers et al. 1982).
Itakura et al. (1995), estudando
coeficiente de digestibilidade para
glicose constituinte da celulose no
al imento de Coptotermes
formosanus (72 a 78%), concluíram
que a celulose é digerida eficiente-
mente por mecanismos de ação com-
binada entre a trituração e as enzimas
celulolíticas existentes no trato di-
gestivo deste inseto.
Itakura et al. (1998) purificaram
e estudaram a distribuição de
celulases no sistema digestivo dos
térmitas, cerca de 20%, 18% e 36 %
da atividade enzimática de C.
formosanus foi detectada na saliva
glandular, intestino médio e posteri-
or, respectivamente. Os mesmos
autores constataram ainda que 35%
da CMcase (Carboximetil celulase)
estão em ação já na saliva glandular,
21,1 % no mesêntero e 18,2 % no
proctodeum Constataram também
que 75 % da D- glucosidase encon-
travam-se no mesêntero, 93 % da
glucose e 87% da trealose do inseto,
presentes em todo o trato intestinal,
sendo 66 % da glicose no mesêntero.
Com base nestes resultados, conclu-
íram que a celulose hidrolisada em
oligossacarídeos já nas partes anteri-
ores no aparelho digestivo, sendo
posteriormente hidrolisados por b -
D - glucosidases em monossacarídeos
(glicose), os quais são absorvidos
também no mesêntero. Neste traba-
lho 5 componentes das celulases
foram purificados, 2 no proctodeum
e 3 no mesêntero, entre eles a
CMcase e avicelase.
6.Perspectivas futuras para
o controle biológico
dos cupins
A evolução da resistência de
cupins aos inseticidas químicos sin-
téticos tem se tornado num dos gran-
des entraves para os programas de
controle dessa praga. Partindo para
um novo horizonte, visando uma
forma de controle biológico dos cu-
pins, Lelis (1992) estudando a ação
do hormônio juvenil impregnado no
alimento (papel de filtro) sobre os
protozoários simbiontes dos gêneros
Dynenynpha, Pyrsonympha, Spyro-
trichonympha e Trichonympha, em
adultos e operárias de Reticuliter-
mes santonensis, constatou que os
térmitas perderem completamente
suas colônias de simbiontes, sugerin-
do uma ação tóxica desse hormônio
àqueles microorganismos. Desse
modo alertou para a possibilidade de
uso deste agente no controle de
cupins. No mesmo sentido, Belitz &
Waller (1998) estudaram em Reticu-
litermes flavipes o efeito da tempe-
ratura sobre a fagocitose dos proto-
zoários simbiontes, observaram que
Trichonympha permaneceu com alta
fagocitose por 96 horas no intestino
a 32o C., enquanto que Pyrsonym-
pha e Dinenympha, foram significa-
tivamente reduzidos até 72 horas
após, a esta mesma temperatura.
Estes trabalhos apontam para o de-
senvolvimento de protozoicidas ca-
pazes de atuarem reduzindo as ativi-
dades simbiontes nos cupins, até
ocasionarem a sua morte. Por isso,
também na mesma direção, Waller
et al. (1996) sugerem o uso de uma
combinação de antibióticos (ampici-
lina ou tetraciclina) associada à uréia
como potentes agentes promissores
contra as populações desses proto-
zoários.
Atualmente tem sido promissor
a interação de profissionais de
entomologia com profissionais de
outras ciências na busca de soluções
para o controle de insetos e vetores
de doenças de plantas e animais.
Pesquisas no ramo da fitoquímica
tem-se alavancado, por exemplo, na
prospecção de atividades biológicas
e obtenção de novos compostos bi-
ologicamente ativos de plantas. Di-
versas espécies vegetais já apresen-
tam atividades biológicas úteis para
o controle de insetos e protozoários.
A combinação de diferentes formas
de combate, pode ser o meio mais
eficaz para o controle de cupins.Trabalhos nessa direção vêm sendo
desenvolvidos no Laboratório de
Tecnologia Farmacêutica da UFPB e
pelo Laboratório de Fitoquímica do
Departamento de Química da UFAL
e apontam para novas descobertas,
onde se inclui a modificação de com-
postos e sua micro-encapsulação para
Figura 5: Cupim de solo (Cornitermes sp.) coletado no campus da UFPB em
Bananeiras-PB
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 81
lenta liberação. Este e outros proces-
sos têm se constituído em novas
ferramentas para o controle de inse-
tos e vetores de doenças, a exemplo
dos que já vêm sendo utilizados pela
farmacognosia e pesquisados pela
etnobotânica.
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82 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
Introdução
seqüenciamento comple-
to do genoma de diver-
sos organismos possibili-
tou o desenvolvimento
de uma nova área de
pesquisa denominada genômica fun-
cional. O desafio da atualidade é ana-
lisar a função dos genes identificados
com o seqüenciamento do DNA e
compreender como esses genes
interagem entre si para determinar
uma característica ou função fisiológi-
ca específica.
Metodologias inovadoras, como
aquelas envolvidas nos arranjos de
DNA (DNA arrays), foram desenvolvi-
das para explorar os dados gerados a
partir das seqüências de DNA e produ-
zir informações sobre os níveis dinâmi-
cos de expressão gênica de genomas
inteiros. Essa técnica faz parte de uma
nova classe de biotecnologias que
permite o monitoramento dos níveis
de expressão de milhares de genes
simultaneamente (Laughlin et al.,
2002).
Os arranjos de DNA são constitu-
ídos por suportes sólidos, comumente
vidro ou náilon, aos quais estão fixadas
de forma ordenada seqüências com-
pletas ou parciais de genes em fita
simples de DNA, com ou sem função
conhecida (Duggan et al., 1999). A
partir do mRNA obtido das células em
estudo, são produzidas sondas de
cDNA (DNA complementar), via trans-
crição reversa na presença de um
nucleotídeo marcado com elemento
radioativo ou fluorescente, permitin-
do assim sua posterior detecção (Heller
et al., 1997; Baldwin et al., 1999).
Pesquisa
Macroarray: uma importante ferramenta para análise de expressão gênica em bovinos
As sondas de cDNA marcadas são
hibridizadas aos arranjos e quanto mai-
or a expressão de um gene em uma
determinada condição, maior será a
intensidade do sinal derivado da sonda
hibridizada na região do arranjo que
contém a seqüência deste gene. A
seqüência de cada gene é imobilizada
no suporte em locais específicos e
uniformemente distribuídos denomi-
nados de spots (Felix, 2002).
Os conjuntos de cDNAs podem
ser seqüencialmente hibridizados em
um único arranjo, no caso das lâminas
de vidro (microarray), ou em arranjos
separados, no caso das membranas de
náilon (macroarray). A análise dos
padrões diferenciais de expressão
gênica é realizada através do cálculo
da razão entre os valores dos sinais das
distintas hibridizações, que refletem a
diferença na quantidade do transcrito
(Baldwin et al., 1999). A produção das
membranas de náilon ou das lâminas
de vidro é feita utilizando sondas esco-
lhidas diretamente de bancos de da-
dos como o GeneBank, o dbEST e o
Unigene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
ou a partir de dados gerados de bibli-
otecas específicas de cDNA.
Schena et al. (1995), descreve-
ram pela primeira vez a grande capa-
cidade analítica da técnica, monitorando
45 genes de Arabidopsis simultanea-mente. Desde então, a aplicação da
tecnologia de DNA arrays vem sendo
relatada em vários organismos tais como
plantas (Schena, 1996; Felix, 2002),
leveduras (De Risi et al., 1997;
Schoondermark-Stolk et al., 2002), se-
res humanos (Bubendorf et al., 1999;
Chin et al., 2002) e animais (Moody et
al., 2002; Dalbiès-Tran & Mermillod,
Hibridização de cDNA bovino
em Macroarray humano
Fabiane Siqueira
Doutora em Genética do Instituto de Biociências,
Universidade Estadual Paulista – Campus de
Botucatu, SP.
biasiqueira@hotmail.com
Erika Cristina Jorge
Doutoranda em Biotecnologia Animal,
Departamento de Zootecnia, Esalq, Universidade de
São Paulo – Piracicaba, SP.
ecjorge@esalq.usp.br
Silvia Edelweiss Crusco dos Santos
Pós-doutoranda em Medicina Veterinária no
Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular
Animal, Universidade Estadual Paulista – Campus de
Araçatuba, SP.
silviacrusco@terra.com.br
Gustavo Arbex Avelar
Doutorando em Genética do Instituto de
Biociências, Universidade Estadual Paulista –
Campus de Botucatu, SP.
garbex@hotmail.com
Maury Dorta de Souza Júnior
Médico Veterinário, Universidade Estadual Paulista
– Campus de Araçatuba, SP.
maurydorta@yahoo.com.br
Cláudio Manoel Rodrigues de Melo
Prof. Assistente Dr. do Departamento de Aqüicultura
- AQI, Universidade Federal de Santa Catarina,
Florianópolis, SC.
cmrmelo@cca.ufsc.br
Luiz Lehmann Coutinho
Prof. Associado do Departamento de Zootecnia,
Laboratório de Biotecnologia Animal, Esalq,
Universidade de São Paulo – Piracicaba, SP. Email:
llcoutin@carpa.ciagri.usp.br
Catalina Romero Lopes
(Orientadora) Profa. Titular do Departamento de
Genética, do Instituto de Biociências, Universidade
Estadual Paulista – Campus de Botucatu, SP. Email:
dtcatalina@terra.com.br
José Fernando Garcia
(Co-orientador) Prof. Assistente Dr. do
Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal,
Universidade Estadual Paulista – Campus de
Araçatuba, SP e Pesquisador na International
Atomic Energy Agency – IAEA – Vienna – Austria,
j.f.garcia@iaea.org
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 83
2003; Evans et al., 2004).
Entretanto, a contribuição desta
técnica para a ciência depende da
complexidade e da identidade da bi-
blioteca de cDNA a partir da qual o
arranjo é feito. No momento, a coleção
de cDNAs humanos é a mais represen-
tativa e melhor caracterizada entre
todas as espécies de mamíferos, po-
dendo fornecer uma alternativa viável
para a identificação de um grande
número de genes em espécies do-
mésticas com importância econômica,
como bovinos, suínos e caprinos, devi-
do à alta taxa de homologia existente
entre as seqüências gênicas dessas
espécies (Adjaye et al.; Jones et al.,
2004).
O uso de arranjos de DNA para
estudos de análises de expressão gê-
nica em bovinos ainda é raro, apesar
da disponibilidade de aproximadamen-
te 497.315 ESTs de bovinos Bos pri-
migenius taurus e 5.950 ESTs de
bovinos Bos primigenius indicus de-
positadas no banco de dados do Gen-
Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
dbEST/dbEST_summary.html). Uma
das razões para o fato de que esta
tecnologia não esteja sendo mais am-
plamente empregada em bovinos é a
inexistência de arranjos de DNA bovi-
nos disponíveis comercialmente (Jo-
nes et al., 2004), com exceção do
CattleArray 7600TM, que contém mais
de 7.000 clones de cDNA de bibliote-
cas de baço e de placenta impressos
em duplicata em uma lâmina de vidro
(Pyxis Genomics Inc, Chicago, EUA).
Especificamente na esfera
reprodutiva de animais de produção, a
análise da expressão gênica pode ser
de grande utilidade na busca de genes
candidatos responsáveis por fenótipos
desejáveis. Como o sucesso
reprodutivo é essencial para o desen-
volvimento econômico dos rebanhos,
muitos estudos têm sido direcionados
para essa área, dentre eles a seleção
de bovinos da raça Nelore (Bos
primigenius indicus) que apresen-
tem características desejáveis quanto
à precocidade sexual, comparáveis
àquelas apresentadas por animais Bos
primigenius taurus. A raça Nelore é a
principal raça de gado de corte no
Brasil, compondo 80% do rebanho
nacional, estando distribuída nas regi-
ões Sul, Sudeste, Nordeste e, predomi-
nantemente no Centro-Oeste e Norte
do país (De Lucia, 2002).
Em geral, fêmeas bovinas da raça
Nelore atingem a maturidade
reprodutiva acima dos 24 meses de
idade, enquanto que as fêmeas bovi-
nas das raças que compõem a
subespécie Bos primigenius taurus
atingem essa fase entre 12 e 16 meses
de idade. Esta disparidade fenotípica
entre as diferentes raças que com-
põem as duas subespécies gera trans-
tornos no processo produtivo, levan-
do, no caso das fêmeas da subespécie
Bos primigenius indicus, a atraso de
pelo menos um ano na cadeia de
produção bovina, quando comparado
com o que ocorre nas fêmeas da
subespécie Bos primigenius taurus.
O desenvolvimento biotecnoló-
gico e a aplicação desse conhecimen-
to à pecuária nacional podem trazer
novas perspectivas e diminuir o tem-
po de seleção de animais genetica-
mente superiores.
Devido ao alto grau de conserva-
ção das seqüências gênicas entre es-
pécies relacionadas e da importância
do conhecimento dos processos fisio-
lógicos que controlam o sistema
reprodutivo em bovinos, este trabalho
teve como objetivo avaliar o uso de
arranjos de náilon contendo cDNA
humano em hibridizações heterólogas
com cDNAs bovinos, para identificar
genes diferencialmente expressos en-
tre folículos dominantes de novilhas
da raça Nelore pré-púberes e púberes.
Metodologia
Animais
Para a realização dos experimen-
tos, foram utilizadas 3 novilhas da raça
Nelore com 7 meses de idade (pré-
púberes) e 2 novilhas com 25 meses
Figura 1: Novilhas da raça Nelore utilizadas nos experimentos. A – Novilhas
pré-púberes (Grupo I). B – Novilhas púberes (Grupo II).
B
A
84 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
de idade (púberes), provenientes do
município de Araçatuba, SP (Figura 1).
O acompanhamento da dinâmica
folicular foi feito através de exames
ultra-sonográficos diários (a partir dos
4 meses de idade para as novilhas pré-
púberes e dos 22 meses de idade para
as novilhas púberes) utilizando o equi-
pamento de ultra-sonografia GE (Ge-
neral Eletric LogicTM α-100 CE 0459;
GE Medical System, Milwaukee, EUA)
acoplado a um transdutor linear de 5
MHz para uso transretal. Os exames
para avaliação dos ovários foram feitos
de acordo com metodologia descrita
por Ginther et al. (1996). As novilhas
foram abatidas quando seus folículos
dominantes apresentavam o diâmetro
máximo de crescimento, determinado
arbitrariamente após o acompanha-
mento das ondas de crescimento
folicular, durante 3 meses nos dois
grupos experimentais. Imediatamen-
te após o abate, o folículo dominante
foi dissecado do ovário e congelado
em nitrogênio líquido.
Extração de RNA total
O RNA total foi extraído dos
folículos dominantes pelo método
TRizol (Invitrogen Life Technologies,
Carlsbad, CA, EUA), conforme o proto-
colo do fabricante. Em seguida, o RNA
foi submetido a tratamento com DNase
(Amersham Biosciences, Piscataway,
NJ, EUA) para garantir a remoção de
qualquer resquício de DNA
contaminante presente nas amostras.
A quantificação do RNA total foi reali-
zada por espectrofotometria a 260nm
em equipamento UV/VIS
Spectrometer Lambda Bio 10 (Perkin
Elmer, CT, EUA). A qualidade das amos-
tras de RNA foi avaliada em gel de
agarose desnaturante de formaldeído
a 1% e por meio da análise da razão
espectrofotométrica DO
260
/DO
280
. O
índice DO
260
/DO
280
 foi considerado
adequado para hibridizações
heterólogas em membranas de náilon
quando esteve acima de 1,8, indican-
do tratar-se de boa extração sem a
presença de contaminaçãopor prote-
ínas.
Síntese de cDNA marcado
radioativamente
Para a síntese do cDNA foram
utilizados 10 µg de um pool constitu-
ído de quantidades iguais de RNA total
proveniente de folículos de novilhas
pré-púberes e 10 µg de um pool
constituído de quantidades iguais de
RNA total proveniente de folículos de
novilhas púberes. Os cDNAs foram
sintetizados através da reação de
transcriptase reversa, utilizando-se o
sistema SuperScriptTm First-Strand
Synthesis System for RT-PCR
(Invitrogen Life Technologies,
Carlsbad, CA, EUA) com a utilização de
oligo dT, na presença de 5 µL de α 33P-
dCTP (10 mCi/mL; Amersham
Biosciences, Piscataway, NJ, EUA).
O cDNA marcado com o isótopo
radioativo (sonda) foi purificado atra-
IopurGonsosserpxesiamseneG IIopurGonsosserpxesiamseneG
edoremúN
seneg )%(megatnecroP senegedoremúN )%(megatnecroP
sezev15> 2 56,4 1 33,2
sezev05-14 4 03,9 0 00,0
sezev04-13 1 33,2 1 33,2
sezev03-12 5 36,11 2 56,4
sezev02-11 4 03,9 4 03,9
sezev01-2 01 52,32 5 26,11
sezev2< 1 33,2 3 89,6
latoT 72 97,26 61 12,73
Tabela 1: Genes envolvidos com a reprodução mais expressos nas novilhas pré-púberes (Grupo I) e nas novilhas púberes
(Grupo II).
Porcentagens são calculadas como frações do total de 43 genes diferencialmente expressos (P < 0,01).
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 85
vés de passagem por colunas de
cromatografia (ProbeQuantTM G50
Micro Columns - Amersham
Biosciences, Piscataway, NJ, EUA) para
remover os nucleotídeos que não fo-
ram incorporados durante a síntese.
Em seguida, a sonda foi desnaturada
em termociclador (PTC-100TM
Programmable Thermal Controller MJ
- Research, CA, EUA) a 96ºC por 10
minutos e acondicionada em gelo, até
o momento de ser adicionada à mem-
brana no processo de hibridização.
Hibridização e aquisição
das imagens
Para as hibridizações foram utili-
zadas duas membranas Human Named
Genes - GF211 (Research Genetics -
Invitrogen Life Technologies,
Huntsville, AL, USA), que contém 5.184
seqüências de genes humanos com
função conhecida. Uma membrana foi
utilizada para hibridizar o cDNA sinte-
tizado a partir do RNA total dos folículos
das novilhas pré-púberes e a outra
para o cDNA originado a partir do RNA
total dos folículos das novilhas púberes.
Cada ponto da membrana con-
tém aproximadamente 0,5 ng de
inserto de DNA de um clone contendo
a terminação 3’ do transcrito. Os clones
de cDNA foram selecionados da cole-
ção do Integrated Molecular Analysis
of Genomes and their Expresion
(IMAGE Consortium, LLNL).
As membranas foram inicialmen-
te lavadas em solução previamente
aquecida a 100ºC de dodecil sulfato de
sódio 0,5% (SDS) por 10 minutos e
pré-hibridizadas em forno de
hibridização (Isotemp Hybridization
Incubator, Fisher Scientific, Pittsburg,
PA, EUA) em 5 mL de solução MicroHyb
(Invitrogen Life Technologies,
Carlsbad, CA, EUA) contendo 5 µg (1
µg/µL) dos agentes bloqueadores
PolydA (Invitrogen Life Technologies,
Carlsbad, CA, EUA) e Cot-1 DNA
(Invitrogen Life Technologies,
Carlsbad, CA, EUA), incubando-se por
2 horas a 42ºC. Em seguida, a sonda
desnaturada foi adicionada a esta solu-
ção e as membranas foram hibridizadas
em garrafas distintas por aproximada-
mente 16 horas a 42ºC. Após a
hibridização, as membranas foram la-
vadas duas vezes por 20 minutos a
50ºC em 30 mL de solução 2 X SSC/1%
SDS e uma vez por 15 minutos a 55ºC
em 30 mL de solução 0,5 X SSC/1%
SDS. Após as lavagens, as membranas
foram embaladas individualmente em
filme plástico (Brand plastic film –
Johnson, EUA), expostas por 24 horas
a um écran intensificador (Imaging
Plate, Fuji Film, Japan) e digitalizadas
a 50 µm de resolução em equipamen-
to Phosphor Imager Storm 860
Molecular Dynamics (Amersham
Biosciences, Piscataway, NJ, EUA).
Análises
As imagens foram analisadas com
o auxílio do software ArrayVisionTM
8.0 (Imaging Research Inc, Ontario,
Canada). O programa gerou tabelas de
dados com informações referentes à
hibridização de cada ponto (região da
membrana contendo um único gene).
Cada gene recebeu um valor numéri-
co de acordo com a sua respectiva
intensidade na imagem. Após a
quantificação dos sinais, o background
(emissão de fundo presente em toda
membrana) foi subtraído do valor refe-
rente a cada ponto. Em seguida, os
dados foram normalizados dividindo-
se a intensidade de sinal de cada ponto
pela mediana do sinal de todos os
pontos na membrana (Richmond &
Somerville, 2000). Os valores de in-
tensidade dos genes expressos nos
folículos das novilhas pré-púberes
(Grupo I) foram comparados com os
valores de intensidade dos genes ex-
pressos nos folículos das novilhas
púberes (Grupo II) utilizando o teste
t (P< 0,01).
Resultados e discussão
Devido ao fato da reprodução ser
um evento controlado por múltiplos
genes e da possibilidade de analisar
simultaneamente os perfis de expres-
são desses genes em distintos mo-
mentos fisiológicos, a técnica de arran-
jos de DNA, utilizando hibridização
heteróloga (bovino x humano), foi
aplicada com o intuito de avaliar a
expressão gênica diferencial em
folículos de novilhas da raça Nelore
antes e após o estabelecimento da
A B
Figura 2: Imagens digitalizadas das membranas de náilon GF211 contendo 5.184 seqüências de genes humanos, submetidas a
hibridizações heterólogas utilizando cDNA bovino. A – RNA total de folículo dominante de novilhas pré-púberes. B – RNA total
de folículo dominante de novilhas púberes.
86 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004
puberdade.
Para analisar alterações na ex-
pressão gênica em folículos dominan-
tes de novilhas pré-púberes (Grupo I)
e púberes (Grupo II), membranas de
náilon contendo 5.184 seqüências de
genes humanos foram hibridizadas com
cDNAs provenientes de RNA total de
folículos dominantes desses animais.
Exemplos de imagens geradas pela
hibridização heteróloga são apresen-
tados na Figura 2.
Condições extringentes de hibri-
dização e de lavagens foram mantidas
conforme as especificações do fabri-
cante da membrana (Research Gene-
tics - Invitrogen Life Technologies,
Huntsville, AL, USA) sugeridas para
hibridização homóloga, com o objeti-
vo de preservar a confiabilidade dos
resultados e de manter um baixo sinal
de background na membrana. Segun-
do Schoondermark-Stolk et al. (2002),
as membranas GF100 (Research Ge-
netics) contendo 3072 seqüências de
genes de Saccharomyces cerevisiae,
quando utilizadas para hibridizações
heterólogas com cDNA de outra leve-
dura (Zygosaccharomyces rouxii),
apresentaram resultados não confiá-
veis e mostraram afinidades de ligação
não-específica quando as temperatu-
ras de hibridização, das lavagens ou a
combinação de ambas foram diminuí-
das.
A análise dos padrões diferenciais
de expressão gênica foi realizada atra-
vés do cálculo da razão dividindo-se a
média de intensidade dos genes das
novilhas pré-púberes pela média de
intensidade dos genes das novilhas
púberes. Os genes foram considera-
dos diferencialmente expressos quan-
do apresentaram valores de razão aci-
ma de 1,5 (P < 0,01).
Dos 5.184 genes presentes na
membrana Human Named Genes
GF211 (utilizada no presente estudo),
526 genes (10,14%) foram considera-
dos diferencialmente expressos utili-
zando o teste t (P < 0,01), sendo que
destes 404 (7,79%) foram mais ex-
pressos nas novilhas pré-púberes e
122 (2,35%) foram mais expressos nas
novilhas púberes. Dos 526 genes dife-
rencialmente expressos, 43 genes
(8,17%) estão envolvidos com repro-
dução, entre eles estão presentes al-
guns hormônios, como hormônio
liberador de gonadotrofinas (GNRH)
que estimula a liberação de FSH e LH,
o receptor de leptina (LEPR) que está
envolvido na regulação do metabolis-
mo de gordura e possivelmente na
reprodução, o receptor de ocitocina(OXTR) que facilita o transporte de
gametas, induz contrações uterinas e
induz a descida do leite, e o receptor
de hormônio esteróide (ESRRA) que
está relacionado ao receptor de
estrógenos.
Alguns genes relacionados a fato-
res de crescimento também apresen-
taram expressão diferencial, como, por
exemplo, a proteína ligadora do fator
de crescimento semelhante à insulina
(IGFBP5) que regula a proliferação e
a diferenciação de vários tipos celula-
res, o fator de crescimento de transfor-
mação (TGFBI) que está intimamente
relacionado ao fator de crescimento
epidérmico sendo produzido nas célu-
las da granulosa, da teca e no oócito, e
o receptor para ativina A (ACVR2) que
está associado à liberação de FSH. Os
fatores de crescimento são substâncias
relacionadas aos hormônios e contro-
lam o crescimento e o desenvolvi-
mento de diversos órgãos, tecidos e
células em cultivo. Além dos hormônios
das glândulas endócrinas, inúmeras pes-
quisas revelaram o papel de fatores de
crescimento peptídicos em reprodu-
ção durante a última década (Hafez &
Hafez, 2004). A Tabela 1 apresenta o
número de genes mais expressos nas
novilhas pré-púberes e púberes e as
porcentagens referentes aos 43 genes
diferencialmente expressos envolvi-
dos com reprodução.
Cada experimento de hibridização
foi realizado em duplicata com o obje-
tivo de verificar a repetibilidade da
técnica e de aumentar a confiabilidade
dos dados. O coeficiente de correlação
de Pearson foi calculado entre duas
membranas hibridizadas em momen-
tos diferentes com cDNA sintetizado a
partir do mesmo RNA. O coeficiente
de correlação (r) é uma medida da
intensidade de associação existente
entre duas variáveis quantitativas
(Callegari-Jacques, 2003). Os valores
obtidos para o coeficiente de correla-
ção foram 0,98 e 0,99 para os folículos
das novilhas pré-púberes e púberes,
respectivamente. Estes resultados in-
dicam que a reprodutibilidade da téc-
nica foi alta para as hibridizações entre
os dois grupos de animais. Moody et al.
(2002) utilizando a mesma membrana
(GF211) analisaram hibridizações
heterólogas entre cDNA de suíno e de
humano e, por meio do cálculo de
coeficientes de correlação de Pearson
e de Spearman, obtiveram valores de
0,96 (Pearson) e 0,97 (Spearman) en-
tre as hibridizações com cDNA suíno
em membranas contendo genes de
humanos e 0,97 para ambos coeficien-
tes entre hibridizações com cDNA de
humano nas mesmas membranas.
A análise comparativa entre as
seqüências de genes humanos que
estão presentes na membrana com as
seqüências de genes bovinos que es-
tão depositadas no banco de dados do
National Center for Biotechnology
Information (NCBI) revelou um índi-
ce médio de homologia de 90%, indi-
cando que esta alta homologia permi-
te o uso de hibridizações heterólogas
para avaliar expressão gênica em
folículos dominantes de novilhas da
raça Nelore. Segundo Schoondermark-
Stolk et al. (2002), o índice de
homologia utilizado para a detecção
de genes diferencialmente expressos
em hibridizações heterólogas deve
estar acima de 83%.
Conclusão
Trata-se do primeiro trabalho com-
pletamente realizado no Brasil envol-
vendo o uso de macroarrays para o
estudo de fenômenos fisiológicos em
animais de produção. A metodologia
para a hibridização heteróloga (bovino
x humano) utilizando arranjos de DNA
mostrou-se eficiente para o estudo de
expressão gênica em bovinos, geran-
do grande quantidade de informações
que deverão ser avaliadas cuidadosa-
mente nas próximas etapas, durante
as quais serão validados, utilizando a
técnica de Real-time Quantitative PCR
(Q-RT-PCR), alguns dos genes que
apresentaram expressão diferencial.
Estes resultados poderão auxiliar na
compreensão dos mecanismos envol-
vidos no estabelecimento da maturi-
dade sexual em fêmeas bovinas, con-
tribuindo para o conhecimento dos
processos fisiológicos que modulam
as atividades reprodutivas.
Espera-se que as informações pre-
Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - Edição nº 33 - julho/dezembro 2004 87
liminares obtidas neste trabalho sinali-
zem novos genes candidatos a
marcadores moleculares relacionados
à precocidade sexual em bovinos da
raça Nelore.
Agradecimentos
Os autores agradecem à Funda-
ção de Amparo à Pesquisa no Estado
de São Paulo e ao Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico – CNPq, pelo apoio fi-
nanceiro concedido a este projeto (Pro-
jetos FAPESP N° 97/13372-9 e 00/
07772-9 e Projetos CNPq N° 464357/
2000-4 e N° 301432/03-1). Nossos
agradecimentos a Fazenda Santa Cecí-
lia - OMF - Araçatuba, pelo forneci-
mento dos animais.
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