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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS DEPARTAMENTO DE PRODUÇÃO VEGETAL JOSÉ DIAS DE SOUZA NETO CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR (FINGERPRINT) DE GENÓTIPOS DE ANTÚRIO COM MARCADORES ISSR ALEGRE, E.S 2012 JOSÉ DIAS DE SOUZA NETO CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR (FINGERPRINT) DE GENÓTIPOS DE ANTÚRIO COM MARCADORES ISSR Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Departamento de Produção Vegetal do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo, como requisito parcial para obtenção do título de Engenheiro Agrônomo. Orientadora: Profª. Drª. Taís Cristina Bastos Soares ALEGRE, E.S 2012 ii JOSÉ DIAS DE SOUZA NETO CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR (FINGERPRINT) DE GENÓTIPOS DE ANTÚRIO COM MARCADORES ISSR Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Departamento de Produção Vegetal do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo, como requisito parcial para obtenção do título de Engenheiro Agrônomo. Orientadora: Profª. Drª. Taís Cristina Bastos Soares. Aprovado em 09 de Novembro de 2012. COMISSÃO EXAMINADORA _______________________________________________________________ Profª. Drª. Taís Cristina Bastos Soares Universidade Federal do Espírito Santo – UFES _______________________________________________________________ Prof. Dr. Ruimário Inácio Coelho Universidade Federal do Espírito Santo – UFES _______________________________________________________________ Drª. Maristela Aparecida Dias Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão Rural –Incaper iii “Para um bom mestre não há má ferramenta.” (Dito popular) iv AGRADECIMENTOS À Deus pelo auxílio e companheirismo durante todo esse tempo de vida. Que possamos estar sempre juntos durante minha caminhada. Aos meus pais, Cecília, Ildefonso e Maria Rosária, que me ensinaram a caminhar sempre e ser uma melhor pessoa cada dia. Aos meus colegas de laboratórios que, graças ao bom senhor Deus, são tantos que não conseguirei os citar em apenas uma página. E amigos em especial a Maiara, Khétrin e Priscila, que foram pacientes comigo e que ensinaram não só lições de faculdade, mas também de vida. Espero sempre merecer a amizades de vocês. Ao Centro de Ciências Agrária da Universidade Federal do Espírito Santo, pela oportunidade de realizar o curso de Agronomia e por fornecer estrutura física e intelectual para meu desenvolvimento. Agradeço a minha orientadora Profª. Drª. Taís Cristina Bastos Soares que me orientou durante esses longos anos de faculdade, sendo paciente em meus erros e ensinando-me a possuir um olhar crítico aos problemas. Também por ser um ótimo exemplo de profissional e de pessoa justa, humana e amável. Também agradeço a Profª. Drª. Andreia Barcelos Passos Lima pela paciência em meus erros na cultura de tecidos e por tantas orientações em meus momentos de dúvida. Agradeço também a Neni, responsável pelo meu crescimento e por tantas outras dádivas que recebi. Obrigado por me incentivar a cursar uma faculdade. Por fim, agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a condução deste trabalho e também àqueles que estiveram presente durante a minha graduação. v RESUMO O Anthurium andraeanum é umas das flores de maior valor unitário, sendo a segunda de maior comercialização no mercado externo. É uma flor que apresenta grande diversidade em padrões de formas e cores, o que permite a abrangência de um amplo mercado, se fazendo necessário o conhecimento mais aprofundado dessa importante espécie, visando a seleção de caracteres que atendam as exigências do mercado consumidor. Devido a uma carência de informação a respeito das características moleculares desta espécie e quanto aos vários obstáculos a serem superados para a produção de plantas homogêneas e que atendam a exigência do mercado nacional e internacional, este projeto teve como objetivo caracterizar molecularmente genótipos de antúrios. Foram utilizados 17 marcadores moleculares do tipo ISSR para análise de fingerprint em 35 variedades de Anthurium andraeanum. Esses marcadores, associados à análise genética através do programa Genes, permitiram a alocação dos genótipos em 15 grupos que apresentaram grande diversidade entre si, abrindo um novo caminho para um programa de melhoria da espécie. Palavras chave: Antúrio, diversidade genética, fingerprint, ISSR. vi SUMÁRIO LISTA DE TABELAS ................................................................................................... vii LISTA DE FIGURAS .................................................................................................. viii 1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1 1.1 Objetivos ............................................................................................................... 2 1.1.1 Objetivo geral: .............................................................................................. 2 1.1.2 Objetivos específicos .................................................................................. 2 2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 2 2.1 Origem e distribuição .......................................................................................... 2 2.2 Anthurium andraeanum ...................................................................................... 4 2.3 Importância Econômica da Espécie ................................................................. 6 2.4 Variabilidade ........................................................................................................ 8 2.5 Sistemática ........................................................................................................... 9 2.6 Marcadores Genéticos ..................................................................................... 10 2.7 Biodiversidade e importância da diversidade genética ............................... 12 3 Metodologia .............................................................................................................. 14 3.1 Material Genético .............................................................................................. 14 3.2 Extração do DNA ............................................................................................... 14 3.3 Análise de ISSR ................................................................................................ 15 3.4 Avaliação de distâncias genéticas e análise de agrupamento .................. 16 4 Resultados ................................................................................................................. 16 5 Discussão .................................................................................................................. 27 6 Conclusões ................................................................................................................ 28 7 Referências Bibliográficas....................................................................................... 29 vii LISTA DE TABELAS Tabela 1: Principais variedades de Anthurium andraeanum segundo Silva (2008). ............................................................................................................................. 5 Tabela 2: Polimorfismo e número de bandas apresentado pelos primers ISSR utilizados para análise. ............................................................................................... 17 Tabela 3: Tabela de valores de dissimilaridade dos 35 genótipos de A andraeanum, obtidos por meio da análise do complemento do coeficiente de coincidências simples por meio do programa Genes.. .......................................... 20 Tabela 4: Grupos formados pelo corte do dendograma e dos genótipos de A. andraeanum correspondentes a cada grupo. ......................................................... 26 viii LISTA DE FIGURAS Figura 1: Distribuição do gênero Anthurium sp no mundo...................................... 4 Figura 2: Regiões de Hot spots ao longo do mundo.............................................. 13 Figura 3: Padrão de polimorfismo apresentado pelo Primer UBC841. ............... 18 Figura 4: Gráfico da distribuição dos valores do somatório da dissimilaridade entre os 35 genotipos de A. andaeanum avaliados. .............................................. 18 Figura 5: Distribuição de Frequência da dissimilaridade a partir de marcadores ISSR entre os 35 genótipos de antúrio nas dez classes. ...................................... 19 Figura 6: Gráfico de distribuição das médias de dissimilaridade entre os exemplares de A andraeanum analisados .............................................................. 19 Figura 7: Dendograma obtido pela análise de primers ISSR pelo complemento do índice de coincidências simples, com agrupamento pelo método de Ligação Média Entre Grupos (UPGMA). ................................................................................. 26 1 1 INTRODUÇÃO Dentre as espécies tropicais importantes para floricultura brasileira destaca-se o antúrio (Anthurium andraeanum Lind.), uma monocotiledônea originária da Colômbia, pertencente à família Araceae (COLLETTE et al., 2004), compreendendo no gênero cerca de 1500 espécies tropicais muito importantes para a ornamentação (DUFOUR e GUERIN, 2003). Contudo, menos que um décimo dessas espécies encontram-se em cultivo. Por ser uma planta de fecundação cruzada, o antúrio é normalmente propagado via semente e, em consequência, suas progênies são muito heterogêneas, necessitando-se, portanto, utilizar métodos de propagação vegetativa para o desenvolvimento comercial da cultura, visto que estes métodos permitem a conservação das características da planta-mãe (TOMBOLATO, 2002). Devido à complexidade de sua sistemática e peculiaridades morfológicas de suas folhagens e inflorescências, as plantas da família Araceae têm despertado o interesse de muitos botânicos. Entretanto, sua morfologia bastante diferenciada dos demais grupos vegetais resulta em uma nomenclatura própria, dificultando sua compreensão (TEMPONI, et al, 2005). A dificuldade do posicionamento taxonômico de algumas espécies do gênero Anthurium deve-se, principalmente, à plasticidade morfológica deste. Essas espécies são muito semelhantes, com diferenças morfológicas e vegetativas sutis, dando margem a uma taxonomia confusa dentro do grupo (CORRRÊA, et al, 2007). Deste modo, com a escassez de dados morfológicos vegetativos e reprodutivos para a delimitação taxonômica do gênero, fazem-se necessários estudos mais detalhados e confiáveis onde os marcadores moleculares, por exemplo, podem auxiliar distinguindo-as a partir das proximidades genômicas. Diante do exposto, este projeto teve como objetivo caracterizar, molecularmente, genótipos de antúrios, utilizando marcadores moleculares ISSR. 2 1.1 Objetivos 1.1.1 Objetivo geral: Caracterização de genótipos de antúrio por meio de marcadores moleculares. 1.1.2 Objetivos específicos Caracterizar molecularmente (fingerprint) genótipos de antúrio, utilizando marcadores moleculares ISSR. Selecionar genótipos que apresentem características de interesse comercial. Capacitar tecnicamente o estudante na área de Biologia Molecular com o emprego de técnicas reconhecidas nas análises de diversidade genética. Consolidar uma nova linha de pesquisa no Centro de Ciências Agrárias da UFES, utilizando técnicas de Biologia Molecular. 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Origem e distribuição As Araceas compreendem um grupo de monocotiledôneas herbáceas com 117 gêneros e espécies de hábitos variados, sendo 34 gêneros endêmicos das Américas, onde Anthurium e Philodendron são os mais representativos (CATE-ARACEAE, 2009; GOVAERTS et al. 2011 apud PONTES e ALVES, 2011). Divididas em nove subfamílias: Gymnostachydoideae, Pothoideae, Monsteroideae, Calloideae, Lasioideae, Philodendroideae, Colocasioideae, Aroideae e Pistioideae (BOGNER e NICOLSON, 1991) a família apresenta cerca de 4.000 espécies distribuídas pela América Tropical e do Norte, África Tropical Continental e do Sul, Eurásia Temperada, Arquipélago Malaio, Madagascar e Seychelles (MAYO et al., 1997). No Brasil, foram reconhecidas aproximadamente 460 espécies (COELHO et al. 2010) que estão distribuídas 3 por quase todos os estados. Essas plantas são utilizadas na ornamentação, medicina e conservação de ambientes. Muitas espécies de aráceas possuem valor econômico, em usos comestíveis, fibrosos, medicinais, ornamentais (RIBEIRO et al. 1999), bem como pesticidas e corantes naturais (ACEBEY et al, 2010). Dessas, 1.100 espécies pertencem ao gênero Anthurium Schott, considerado o maior desta família, espalhando-se por uma área constituída essencialmente pela América Tropical, incluindo países como Argentina, Uruguai, Índias Ocidentais e também o Brasil, onde 126 espécies foram descritas (COELHO E TEMPONI, 2012), como pode ser visto na figura 1( MAYO et al. 1997; COELHO e CATHARINO, 2005; BARGUIL et al. 2008, COELHO, 2009). O gênero apresenta grande diversidade entre seus representantes, como pode ser verificado por Temponi (2006), com 16 a 19 secções, e com distribuição bastante diversificada em matas úmidas tropicais de baixas e médias elevações, em florestas nebulares, em áreas brejosas, sobre afloramentos rochosos, áreas arenosas abertas e em regiões semi-áridas. As espécies podem ser hemiepífitas trepadeiras, terrestres, epífitas, litófitas (crescem sobre as rochas), sendo raramente helófitas ou reófitas (margens ou ilhas rochosas de rios) (SAKAI, 2004; COELHO et al. 2009). Estudos evolutivos sobre a família Araceae e, em especial, sobre o gênero Anthurium, postulam que essa espécie possa ser um anfidiploide, com um número cromossômico básico secundário x = 15, o qual foi encontrado na maioria das contagens e que se originou através de hibridações e duplicações, a partir de espécies com números básicos x = 7 e x = 8 (SHEFFER e CROAT, 1983; PETERSEN, 1989; GRAYUM, 1990; COTIAS-DE-OLIVEIRA et al. 1999). Já, Bogner e Petersen (2007) propõem os números básicos x = 10, 12, 14 e 15 para o gênero Anthurium, em consequência das espécies diploides, tetraploides e hexaploides encontradas. Dentre todas as espécies deste gênero, o Anthurium andraeanum é o demaior importância comercial, com utilização como flor de corte e também como planta de vaso (CASTRO e TOMBOLATO, 2002). 4 Figura 1: Distribuição do gênero Anthurium sp no mundo. Fonte: Royal Botanic Gardens, Kew 2008. World Checklist of Selected Plant Families. Acesso em 18 jul 2012. 2.2 Anthurium andraeanum O Anthurium andraeanum é uma arácea nativa das florestas tropicais da América Central e Sul (GANTAIT et al., 2008), sendo um diploide, com complemento cromossômico 2n = 2x = 30 (SHEFFER e CROAT, 1983). Foi descoberto pelo botânico e viveirista francês M. André, nas florestas tropicais da Venezuela e Colômbia no ano de 1876 (POLACK, 2006). A flor é constituída de uma bráctea, folha modificada, e uma espádice onde estão dispostas as verdadeiras flores. Suas flores são andróginas, ou seja, possuem tanto os órgãos reprodutores masculinos quanto femininos e apresentam o fenômeno da protoginia, impedindo a autofecundação e favorecendo o cruzamento (TOMBOLATO et al., 2004).Sendo assim, o estigma somente pode ser polinizado por grãos de pólen oriundos de outra flor da mesma planta ou de outra planta. Quando a espata que envolve a espádice acaba de desenrolar, nota-se que a superfície fica recoberta por inúmeras gotículas incolores, parecendo orvalho. Essas gotículas indicam o ponto exato de maior receptividade dos estigmas para os grãos do pólen (POLACK, 2006 apud O DIRIGENTE RURAL, 1967). A planta é uma espécie alógama, e por esse 5 motivo sua variabilidade é grande. Silva (2008) demonstra essa variabilidade de acordo com padrões morfológicos florais que a espécie possui (Tabela 1). Essa variabilidade é vista como algo inconveniente para o cultivo comercial, sendo dificultando essa padronização ou homogeneidade das flores produzidas. Com isto, a propagação vegetativa é preferida à seminífera, pois além de evitar essa variabilidade, apresenta as vantagens de necessitar de menor tempo para produção de um grande número de plantas. Com uso de novas técnicas in vitro, a propagação vegetativa tem se tornado mais vantajosa pois requere: menor espaço, maior número de plantas, possui homogeneidade genética entre as mudas e uma certificação de sanidade da planta gerada (TORRES et al., 1998). A propagação in vitro de Anthurium andreanum foi primeiramente realizada por Pierik et al. (1974). Atualmente, a produção in vitro é realizada utilizando gemas axilares (KUNISAKI,1980), gemas adventícias (CEN et al., 1993), organogênese de folhas (PIERIK et al.,1974; FINNIE e VAN STADEN, 1986; KUEHNLE e SUGII, 1991) e através de embriões somáticos provindos de explantes foliares (KUEHNLE et al., 1992). Em conjunto com a propagação in vitro, agentes mutagênicos têm sido utilizados para modificação e criação de novos cultivares de antúrio por meio de alterações cromossômicas (PUCHOOA e SOOKUN, 2003). Tabela 1: Principais variedades de Anthurium andraeanum segundo Silva (2008). Variedade Característica Var. album possui espata branca, espádice branco; Var. amoenum possui espata róseo-carmim, espádice branco e amarelo-claro; Var. closoniae possui espata grande (20 cm de comprimento x 10 cm de largura) de colorido variado, ápice branco; Var. gameri possui espata vermelho brilhante; Var. grandiflorum possui espata de colorido variado, com comprimento maior que 20 cm e cerca de 15 cm de largura; Var. laurenciae possui espata vermelha e larga; 6 Var. lucens possui espata vermelho sangue, muito longa; Var. giganteum possui espata vermelho salmão, espádice não muito proeminente, recurvado, branco- amarelado; Var. rhodoclorum possui plantas vigorosas, espata rosa-clara, espádice branco com amarelo; Var. roseum possui espata cor-de-rosa brilhante; Var. rubrum possui espata vermelho-escura; Var. salmoneum possui espata de coloração salmão; Var. sanguineum possui espata vermelho-sangue 2.3 Importância Econômica da Espécie Por ser a segunda flor tropical mais comercializada no mundo, perdendo somente para as orquídeas, (LAWS e GALINSKY, 1996; CASTRO et al.,2004; CEAGESP, 2010;), o antúrio vem sofrendo processo de melhoramento visando características agronômicas e fitossanitárias, ocorrendo dessa forma perda genética, o que vem a preocupar não só em questão patológica, mas também em relação à diversidade de caracteres do material. Andrade et al.(2009) avaliaram a diversidade genética de 12 populações de duas espécies de Anthurium, verificando grande diversidade em uma delas. Souza Neto et al.(2010) verificaram grande variabilidade em A. andraeanum utilizando primers RAPD. Jeshima Khan e Pankajaksan (2010) também verificaram variabilidade em materiais de A. andraeanum. Sheffer e Croat, (1983); Ranamukhaarachchi et al. (2001) e Nowbuth et al. (2005), no entanto, verificaram elevados valores de similaridades entre as cultivares estudadas. Isso se deve ao nível do estudo, já que estes trabalharam com material melhorado de empresas, enquanto que plantas derivadas de propagação via semente apresentam materiais com grande heterose (PIERIK et al., 1974; GEIER, 1990; GEORGE apud SANTOS et al.,2005). Atualmente, o gênero engloba muitos tipos, formas, padrões de coloração, tamanhos de plantas e flores. Comercialmente, a principal espécie do gênero é o Anthurium andraeanum Lindl. utilizada como flor de corte e 7 também como planta de vaso (CASTRO e TOMBOLATO, 2002). No período de julho de 2012, o Anthurium apresentou crescimento de 49,8%,comparado com o mesmo período em 2011(IBRAFLOR, 2012), mostrando assim sua significância no ramo da horticultura. Tanto a flor quanto as folhagens podem ser comercializados. Sendo assim, as espécies desse gênero são classificadas quanto sua finalidade comercial, podendo ser destinadas para corte, tanto flor quanto folhas, e também na forma de planta em vaso. Como principais importadores da produção brasileira, têm-se a Comunidade Européia, Estados Unidos e Japão (SILVA, 2008). Os valores praticados no mercado são de US$ 0,30 a US$ 0,60 por inflorescência no nível de produtor (SEBRAE, 2008). O negócio torna-se compensador também pela fenologia que a planta apresenta. O antúrio floresce o ano todo, A sequência folha, flor, folha, flor é mantida durante toda a vida da planta, dependendo das condições ambientais, nutricionais e o intervalo de tempo entre elas. As flores emergem da base de cada nova folha. (HIGAKI et al., 1984; TOMBOLATO et al., 2002). Os maiores produtores internacionais são Estados Unidos (Havaí como flor de corte e Flórida como planta em vaso) e Holanda (LAWS e GALINSKY, 1996). Segundo Laws e Galinsky (1996) e Caldari Junior (2004), a Holanda é o maior pólo de produção e também de comercialização de antúrio, com aproximadamente 30 milhões de hastes produzidas anualmente. No Brasil, os principais produtores estão localizados nas regiões de Holambra, Atibaia e Vale do Ribeira, São Paulo (POLACK, 2006). Alguns outros Estados brasileiros mostram início de atividade de maior expressão, podendo ser citados os Estados de Pernambuco, Ceará e Bahia, que além do mercado interno objetivam a exportação (CALDARI JUNIOR, 2004). Essa flor tem passado por processos de melhoramento que visem características agronômicas desejáveis, como: elevada qualidade da folha; haste floral ereta, firme e medindo 60 cm; espata com brilho, aberta, de textura firme, coloração uniforme e contrastante com a cor da espádice e de nervuras acentuadas; espádice ligeiramente arqueada e medindo cerca de dois terços do comprimento da espata, de pequeno diâmetro, cônica e com a porçãoterminal afilada; maior durabilidade pós-colheita; produtividade nunca em número inferior a cinco haste por ano por planta e também serem resistentes ou tolerantes às 8 principais doenças (VAN HERK et al, 1998; (CASTRO e TOMBOLATO, 2002; TOMBOLATO et al., 2004). 2.4 Variabilidade A variabilidade do grupo das aráceas também é demonstrada pela morfofisiologia não só das flores, mas também dos demais órgãos das plantas desse grupo. Conforme Hotta (1971), a família Araceae, é considerada um grupo natural com grandes variações morfoanatômicas entre seus membros, reunindo características derivadas e primitivas, conferindo interesse ao estudo morfoanatômico desta família de monocotiledôneas. São frequentes, na literatura, informações sobre a diversidade estrutural dos órgãos vegetativos e reprodutivos, bem como no hábitat. Em plantas desenvolvidas de Araceae têm sido registrada uma grande diversidade de tipos de caules. Dahlgren et al. (1985) menciona, para a família, caules subterrâneos na forma de tubérculos ou rizomas, caules aéreos que podem ser eretos, escandentes ou procumbentes e em plantas flutuantes podem ser estolões. Para o gênero Anthurium, Reitz (1957) descreve a ocorrência de caules eretos ("assurgente, adradicante") ou escandentes, raramente rastejantes ou arborescentes. Diversos autores (REITZ, 1957; ARBER, 1961; CRONQUIST, 1981) têm referido que o desenvolvimento do caule de Araceae é simpodial, sendo raramente monopodial. Dahlgren et al. (1985) esclarecem que, em plantas jovens de Araceae, o crescimento geralmente é monopodial, alterando para simpodial com o desenvolvimento da primeira inflorescência, o que foi constatado por Gomes (1990), para A. scandens. As folhas de Araceae, geralmente, estão dispostas em espiral, ao longo do caule, mais raramente dispostas em roseta e, algumas vezes, poucas ou solitárias (REITZ 1957). A lâmina foliar apresenta morfologia variada em tamanho e forma, desde inteira, ovada, cordada, sagitada, hastada, trífida ou trissecta, pedatífida, pinatífida, pedatisecta a dracontióide (RIBEIRO et al. 1999), variando de coriácea até herbácea ou pergaminosa (REITZ 1957). 9 2.5 Sistemática Devido à complexidade de sua sistemática e peculiaridades morfológicas de suas folhagens e inflorescências, as plantas da família Araceae têm despertado o interesse de muitos botânicos. Entretanto, sua morfologia bastante diferenciada dos demais grupos vegetais resulta em uma nomenclatura própria, dificultando sua compreensão (TEMPONI, et al., 2005). A dificuldade do posicionamento taxonômico de algumas espécies do gênero Anthurium deve-se, principalmente, à plasticidade morfológica deste. Essas espécies são muito semelhantes, com diferenças morfológicas e vegetativas sutis, dando margem a uma taxonomia confusa dentro do grupo (CORRÊA, et al., 2007). De acordo com Judd et al. (1999), a família pode ser dividida em subfamílias com base na variação de hábitat, organização e morfologia das folhas, morfologia floral, estrutura do pólen, anatomia e número de cromossomos. Dahlgren et al. (1985) e Keating (2002) enfatizam a importância das características anatômicas das folhas (lâmina, nervuras e pecíolo) para a análise filogenética com as espécies de Araceae. Também Temponi (2006), que, em seu trabalho, avaliou 77 espécies do gênero Anthurium quanto aos caracteres anatômicos foliares de forma a servirem de informativos para análises cladísticas, obtendo nove caracteres informativos para a secção Urospadix. Não só a família Araceae, mas todas as monocotiledôneas variam muito quanto às características morfológicas externas, sendo de grande importância a diferenciação que ocorre nas plântulas, durante os estádios de desenvolvimento, nos quais pode ser evidenciada a derivação estrutural (TILLICH, 1998). No entanto, por serem influenciados pelo ambiente, pelo pequeno número de marcadores e por seus fenótipos dependerem do desenvolvimento da planta, caracteres morfológicos acabam por serem limitados ao uso de diversidade e agrupamento de indivíduos (FERREIRA e GRATTAPLAGIA, 1998). Com base nisto, marcadores genéticos surgem de modo a reforçar e/ou auxiliar na distinção entre indivíduos trabalhados (BORÉM e MIRANDA, 2005). 10 2.6 Marcadores Genéticos Os marcadores genéticos são quaisquer características, processos bioquímicos ou fragmentos de DNA que permitam a distinção de indivíduos que apresentam constituição genética diferente. Há quatro tipos de marcadores genéticos utilizados em plantas: morfológico, citológico, molecular e bioquímico (BORÉM e MIRANDA, 2005). Contudo, a grande limitação da maioria dos marcadores é a falta de especificidade. O marcador ideal seria uma substância de ocorrência exclusiva em determinado tipo celular (ELIAS e SOUZA, 1998). Dentro desse contexto, são utilizados métodos bioquímicos, como ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), eletroforese de compostos enzimáticos e com base em DNA, onde se verifica a proximidade de um indivíduo com outro pela similaridade do perfil formado. Os procedimentos empregados em análises de marcadores bioquímicos se baseiam na utilização de enzimas, compostos ou metabólitos secundários específicos para um grupo de células, órgãos ou organismos, (VIEIRA e AGOSTINI-COSTA, 2007) de forma a agrupar semelhantes quanto àquela característica ou grupo de compostos. Dentro desses grupos de marcadores, os moleculares são mais fidedignos e com alta reprodutibilidade. Marcadores moleculares são pontos de referência nos cromossomos, definidos como todo e qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene expresso (isoenzimas) ou de um segmento de DNA, que pode ser regiões expressas ou não do genoma (FERREIRA e GRATTAPLAGIA, 1998). O desenvolvimento dos marcadores isoenzimáticos, deu início à tecnologia dos marcadores moleculares, levando ao crescimento do número de marcadores, disponibilizando a técnica para todas as espécies de plantas. Entretanto, as isoenzimas apresentam limitações como cobertura parcial do genoma, baixo nível de polimorfismo, atividade isoenzimática diferenciada de acordo com estágio de desenvolvimento da planta, da influência das condições ambientais e tecidos vegetais utilizados (BORÉM e CAIXETA, 2005). Com o surgimento da técnica de síntese de DNA in vitro, a Reação em Cadeia de Polimerase - PCR (Polymerase Chain Reaction), uma nova classe de marcadores moleculares foi desenvolvida. As técnicas denominadas AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplification of 11 Polymorphic DNA), SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions), SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeats), CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic) e ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) são exemplos de marcadores moleculares baseados em PCR que construíram novas possibilidades de detecção de polimorfismo na molécula de DNA (BORÉM e MIRANDA, 2005; FERREIRA et al., 2007). Os marcadores moleculares são utilizados no monitoramento da variabilidade genética, identificação de indivíduos ou famílias divergentes, construção de mapas genéticos, identificação de locos relacionados aos caracteres quantitativos (DALE e CHAPARRO, 1997). Têm gerado informações valiosas sobre variabilidade genética de espécies cultivadas e nativas para estudos de populações, taxonomia, conservação de germoplasma (CARVALHO e TORRES, 2002) sistema de cruzamento (CIAMPI e GRATTAPAGLIA, 2001), identificação de indivíduos e de espécies crípticas e a formulação de hipóteses filogenéticas (SOLÉ-CAVA, 2001). Atualmente, os marcadorestêm ampla aplicação para estudos referentes à genética da conservação, e espera-se que estes sejam cada vez mais utilizados para este fim, pois com o avanço rápido da ciência, será possível obter informações com baixo custo para o pesquisador. Para estudo de genética de populações de plantas, atualmente, os marcadores mais utilizados são RAPD, Isoenzimas e SRR. A superioridade dos marcadores SSR para estudos populacionais é indiscutível, porém, devido ao custo e facilidade, os outros marcadores ainda são comumente utilizados (GOMES e MOURA, 2010). Marcadores moleculares geram uma grande quantidade de caracteres adicionais, que, combinadas com características fenotípicas, favorecem um quadro mais completo para o agrupamento de genótipos e o planejamento de cruzamentos (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998). Há diversas classes de marcadores moleculares: RAPD, ISSR, SSR, SCAR, AFLP, RFLP, SNP, e outros. Cada classe apresenta suas características e propriedades que os tornam úteis para determinada análise. Dentro destas classes, O ISSR apresenta vantagens como não requerer informações prévias de sequências de DNA da espécie-alvo, produzir fragmentos com grande reprodutibilidade, quando comparados a outros marcadores com base em PCR não-específico 12 como RAPD (WOLFE e LISTON, 1998).O ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) é um marcador molecular associado ao uso de sequências microssatélites, que são sequências simples repetidas, organizadas em tandem, contendo de 1 a 3 bases, abundantemente distribuídas ao longo de todo o genoma de eucariotos (WANG et al., 1994; RATNAPARKHE et al., 1998; LIU e WENDEL, 2001; REDDY et al., 2002). Eles representam umas das mais recentes classes de marcadores moleculares descritos por Zietkiewicz et al. (1994). Marcadores ISSR são usados desde avaliação de divergência genética em plantas (BATISTA, et al.,2008), pragas de cultura comercial (SOUZA, et al., 2008) e animais (CASTRO, 2009). Em culturas autógamas, onde se necessita de grandes quantidades de cruzamentos para geração de grande variabilidade, os marcadores moleculares são uma ótima ferramenta, pois permitem seleção dos genitores mais divergentes (BERED et al., 1997). 2.7 Biodiversidade e importância da diversidade genética A biodiversidade é produto da evolução biológica na qual são geradas diferentes formas devido ao acúmulo de variações hereditárias, inicialmente polimórficas dentro de espécies que, posteriormente, se fixam em unidades taxonômicas, como as espécies (SANTOS et al.,2009 ). Segundo o ecólogo inglês Norman Myers, a biodiversidade não está distribuída de forma uniforme no planeta, então seria necessário identificar as áreas (regiões) da Terra onde os mais altos níveis de biodiversidade se concentram, e para as quais seriam mais urgentes as ações de conservação. Essas áreas foram denominadas, em 1988, como Hot spots (SANTOS, 2010) (Figura 2). 13 Figura 2: Regiões de Hot spots ao longo do mundo. Fonte: http://www.berkeley.edu/news/media/releases/2009/02/05_atlanticforest.shtml A diversidade genética é uma medida de biodiversidade que mede a variação genética dentro de cada espécie , tanto entre populações geograficamente separadas como entre os indivíduos de uma dada população (PRIMACK, 2006 apud WIKIPÉDIA, 2012), estando relacionada à valores de dissimilaridade entre indivíduos, sendo um dos principais responsáveis pelo sucesso de um programa de melhoramento. Não somente, a aquisição de informações sobre a diversidade genética de um organismo se torna essencial para o seu manejo (MILLAR E WESTFALL, 1992; SAVOLAINEN e KAERKKAEINEN, 1992, citados por KANASHIO et al., 1997) , mas também para o entendimento das relações entre a ecologia e genética de indivíduos e populações, possibilitando o estabelecer diretrizes para sua conservação e utilização de recursos genéticos (LEE, 2000). A diversidade genética é gerada, fundamentalmente, por mutação na sequência nucleotídica durante a replicação do DNA, e que vem sendo passadas durante todo processo evolutivo. Quando esta variação ocorre entre indivíduos da mesma espécie, chamamos de polimorfismos ou diversidade intraespecífica. Quando ocorre entre espécies de um mesmo táxon, dizemos que se deu uma substituição de caráter, (SANTOS et al., 2009). 14 3 Metodologia 3.1 Material Genético Neste experimento foram utilizados 35 genótipos de antúrios pertencentes ao Horto Nuvem Azul localizado no município de Venda Nova do Imigrante, ES e ao sítio Santo Antônio da localidade do distrito de Piaçu do município de Muniz Freire, ES. Estes antúrios foram cultivados em vasos contendo latossolo vermelho incrementado com pedaços de cascas de coco e folhas de árvores que auxiliaram na drenagem do excedente de água, em casa de vegetação do CCA-UFES em condições de clima ameno e com luminosidade baixa e indireta. 3.2 Extração do DNA As folhas de cada planta foram coletadas e a extração de DNA foi feita de acordo com o protocolo de Doyle e Doyle (1990), com algumas modificações propostas por Abdelnoor et al. (1995). Cerca de 200 a 300 mg de folhas foram triturados na presença de N2 líquido, sendo o pó resultante transferido para microtubos identificados. Após a adição de 700 μL de tampão de extração constituído de 2% v/v de CTAB, 1,4 mol/L de NaCl2, 20 mMol/L de EDTA, 100 mmol/L de Tris-HCl a pH 8, 0; 2% p/v de Polivinilpirrolidona sólido e 0,2% v/v de β-mercaptoetanol, levou-se ao vórtex por aproximadamente 20 segundos e encubou os tubos em banho-maria a 65º C por aproximadamente por 40 minutos. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas por cinco minutos a 14000 RPM em centrífuga Heittich Zentrifugen MIKRO 200 e o sobrenadante, transferido para novos tubos. Ao sobrenadante foi adicionado igual volume da mistura de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). Os tubos foram suavemente invertidos e centrifugados por cinco minutos a 14000 rpm. A fase superior foi transferida para outros tubos e adicionou-se isopropanol gelado ao sobrenadante (na proporção de 1:1 de isopropanol:sobrenadante). Agitou-se suavemente os tubos algumas vezes e estes foram incubados a - 20º C por uma noite. 15 Após esta etapa, os tubos foram levados a centrifuga por 10 minutos a 14000 rpm, removeu-se o sobrenadante e lavou-se o precipitado duas vezes com etanol 70% e uma vez com etanol 95%, após seco a temperatura ambiente. Este precipitado foi ressuspenso em 0,200 ml de TE (10 mmol/L de Tris-HCl, 1 mmol/L de EDTA a pH 8,0), contendo RNAse na concentração final de 40 μg/mL e incubado em banho-maria à 37ºC por uma hora e meia. A concentração do DNA foi estimada através da comparação das bandas produzidas pelo marcador de peso molecular nas concentrações de 25, 50 e 100 ng/μL e pelas amostras de DNA, visualizadas em gel de agarose a 0,8%. Realizou-se a diluição, quando necessário, da amostra de DNA para 10 ng/μL. 3.3 Análise de ISSR As reações de amplificação dos primers ISSR foram feitas em um volume total de 25 μL, contendo MgCl2 (2,4 mM), Tris/KCl pH 8,3 (0,25 mM), dNTP (0,25 mM de cada nucleotídeo), 0,2 μM do primer, uma unidade de Taq- polimerase e 30 ng de DNA. As amplificações foram realizadas em termociclador programado (Thechne TC 412). O programa utilizado para a amplificação dos fragmentos consistiu das seguintes etapas: uma desnaturação a 94º C (15 minutos), seguido de 35 ciclos de: 94ºC por 30 segundos, 52º C por 30 segundo e 72 º C por um minuto, ao final dos 35 ciclos, uma extensão final a 72º C por 7 minutos. Para os primers UBC 819, 845e 827, foi utilizado outro programa: 94º C (4 minutos), seguido de 35 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 52º C por 1 minuto e 72ºC por 2 minutos, ao final dos 35 ciclos, uma extensão final a 72º C por 7 minutos. Os produtos das reações foram separados por eletroforese em gel de agarose 2,5% imersos em tampão SB 1X, a 110 volts durante 4 horas, utilizando para distinção e estimação da massa molecular dos fragmentos um marcador de 100 pares de base (Fermentas®). 16 3.4 Avaliação de distâncias genéticas e análise de agrupamento Estudos de diversidade genética destinados a identificação de genitores têm sido feitos a partir de informações de caracteres quantitativos ou de marcadores moleculares. O registro de dados moleculares foi feito a partir das bandas polimórficas detectadas entre os cultivares. Foi gerada uma matriz de valores binários, onde a codificação (0) significará ausência e (1) presença da banda. As estimativas de dissimilaridade genética (Dij) foram feitas de acordo com o complemento aritmético do coeficiente de coincidências simples (SNEATH, SOKAL, 1973): em que: Sij = coeficiente de similaridade; a = número de encontros 1,1; b = número de encontros 1,0; c = número de encontros 0,1; d = número de encontros 0,0. Os valores de dissimilaridade genética foram organizados em matrizes, que foram empregadas na análise de agrupamento pelo método de Ligação Média Entre Grupos (UPGMA). As análises de divergência genética e de agrupamento foram realizadas com o auxílio do programa Genes (CRUZ, 2001). O presente projeto foi desenvolvido em parceria entre os Laboratórios de Biotecnologia e Bioquímica do Centro de Ciências Agrárias da UFES, sediado em Alegre/ES. 4 Resultados Foram obtidos 261 fragmentos a partir dos 17 primers ISSR (Tabela 2). Destes fragmentos 4 (1,53%) foram monomórficas e 257 (98,47%) apresentaram padrão polimórfico. O padrão de bandas amplificadas teve mínimo de 200pb e com máximo acima de 1000pb. A figura 3 apresenta o padrão de polimorfismo apresentado pelo Primer UBC841. Dij =1- Sij =1 - a + d = b + c a+b+c+d a+b+c+d 17 Tabela 2: Polimorfismo e número de bandas apresentado pelos primers ISSR utilizados para análise. Identificação do Primer Números de bandas Número de bandas polimórficas Teor de CG (%) Tamanho de bandas amplificadas (pb) Sequência (5’→3’) UBC841 24 24 52.8 Acima de 200 (GA)8YC UBC843 13 12 47.2 Acima de 400 (CT)8RA UBC854 15 14 52.8 Acima de 400 (TC)8RG UBC855 13 13 47.2 Acima de 500 (AC)8YT UBC857 16 16 52.8 Acima de 300 (AC)8YG UBC859 14 14 52.8 Acima de 400 (TG)8RG UBC880 11 10 60.0 Acima de 400 (GGAGA)3 UBC808 11 11 52.9 Acima de 500 (AG)8C UBC827 21 21 52.9 Acima de 300 (AC)8G UBC810 18 18 47.1 Acima de 400 (GA)8T UBC834 18 17 47.2 Acima de 300 (AG)8YT UBC890 18 18 50.0 Acima de 300 VHV(GT)7 UBC849 09 09 47.2 Acima de 500 (GT)8YA UBC862 06 06 66.7 Acima de 500 (AGC)6 UBC864 14 14 33.3 Acima de 400 (ATG)6 UBC819 19 19 47.1 Acima de 600 (GT)8A UBC845 21 21 52.8 Acima de 300 (CT)8RG Total 261 257 18 Figura 3: Padrão de polimorfismo apresentado pelo Primer UBC841. Legenda: M- marcador de massa molecular, e os números de 1 a 23 representam diferentes genótipos de A. andreanum. Foram obtidos, através dos dados gerados pelo programa Genes, os gráficos do somatório de dissimilaridade (Figura 4) e a distribuição de frequência da dissimilaridade (Figura 5). As médias de dissimilaridade (Figura 6) foram obtidas por meio das funções do Microsoft Excel. Figura 4: Gráfico da distribuição dos valores do somatório da dissimilaridade entre os 35 genotipos de A. andaeanum avaliados. 19 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0, 0 a 0, 09 0, 1 a 0, 19 0, 2 a 0, 29 0, 3 a 0, 39 0, 4 a 0, 49 0, 5 a 0, 59 0, 6 a 0, 69 0, 7 a 0, 69 0, 8 a 0, 89 0, 9 a 1 Dissimilaridade (Classes) Fr eq uê nc ia (% ) Figura 5: Distribuição de Frequência da dissimilaridade a partir de marcadores ISSR entre os 35 genótipos de antúrio nas dez classes. Figura 6: Gráfico de distribuição das médias de dissimilaridade entre os exemplares de A andraeanum analisados Através do programa Genes também obteve-se valores de dissimilaridade dos 35 genótipos de Anthurium andraeanum, obtidos por meio da análise do complemento do coeficiente de coincidências simples (Tabela 3). 20 Tabela 3: Tabela de valores de dissimilaridade dos 35 genótipos de A andraeanum, obtidos por meio da análise do complemento do coeficiente de coincidências simples por meio do programa Genes. Em laranja, os valores de dissimilaridade entre os indivíduos, média e somatório da dissimilaridade dos 35 genótipos com base no dendograma (Figura 1), e em roxo os de maior dissimilaridade com base nesta tabela. Células em cinza indicam cruzamentos de baixo valor de dissimilaridade e em azul, os de maior valor de dissimilaridade com base neste estudo. I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1 0 2 0,18293 0 3 0,69663 0,69892 0 4 0,6381 0,61947 0,75 0 5 0,67273 0,6748 0,71429 0,61404 0 6 0,73529 0,74775 0,70886 0,69903 0,54545 0 7 0,68817 0,71028 0,69412 0,64646 0,59292 0,65169 0 8 0,74038 0,76522 0,71084 0,76786 0,66942 0,59302 0,60825 0 9 0,74699 0,76667 0,63793 0,7619 0,75281 0,66176 0,76923 0,70667 0 10 0,5102 0,53211 0,7234 0,62609 0,64167 0,67308 0,63 0,74336 0,6988 0 11 0,77465 0,79221 0,73684 0,80769 0,79787 0,75806 0,77465 0,82192 0,68182 0,8 0 12 0,65873 0,69014 0,66949 0,63158 0,61224 0,71094 0,68702 0,75172 0,76415 0,66187 0,79798 0 13 0,71429 0,736 0,72 0,67826 0,64122 0,64078 0,625 0,68644 0,75 0,71901 0,7931 0,62857 0 21 14 0,67742 0,70504 0,71429 0,71852 0,57746 0,69672 0,65891 0,70073 0,77228 0,65909 0,81818 0,58861 0,63121 15 0,75893 0,76033 0,79612 0,76068 0,7197 0,69697 0,73214 0,73043 0,75 0,68142 0,80519 0,68276 0,74419 16 0,74242 0,75714 0,75862 0,68217 0,67832 0,71429 0,75188 0,74627 0,69149 0,70149 0,85294 0,59868 0,68085 17 0,76667 0,76699 0,76623 0,7732 0,75229 0,76087 0,71765 0,76344 0,75714 0,68478 0,85938 0,73729 0,77778 18 0,73394 0,74576 0,70238 0,70796 0,66957 0,63043 0,69072 0,72549 0,68493 0,68421 0,80263 0,70149 0,68182 19 0,82609 0,84158 0,825 0,80645 0,76786 0,7125 0,73864 0,78261 0,76119 0,80208 0,87692 0,79339 0,68 20 0,76042 0,8 0,76404 0,77778 0,72807 0,74444 0,72043 0,78302 0,77778 0,68817 0,89333 0,66935 0,68182 21 0,73394 0,7395 0,8 0,72414 0,75 0,73267 0,75676 0,75221 0,78049 0,68966 0,86076 0,66187 0,72131 22 0,82456 0,80992 0,82222 0,76786 0,80153 0,80583 0,77778 0,79279 0,76923 0,78632 0,89189 0,76552 0,77419 23 0,76623 0,74359 0,74545 0,67143 0,7027 0,80882 0,63934 0,76389 0,70909 0,73684 0,80435 0,72826 0,71053 24 0,86585 0,84524 0,80769 0,81481 0,82143 0,84058 0,85915 0,82857 0,77358 0,85057 0,85366 0,83333 0,84091 25 0,81818 0,81633 0,74286 0,8 0,7 0,7 0,66667 0,80435 0,72973 0,82143 0,78788 0,77049 0,66667 26 0,8 0,78947 0,76744 0,85185 0,72414 0,7451 0,7234 0,75439 0,75 0,77778 0,86486 0,82432 0,67857 27 0,80851 0,83871 0,65625 0,83871 0,79412 0,80769 0,79245 0,8 0,7381 0,79104 0,86111 0,77778 0,80952 28 0,80952 0,76923 0,70588 0,76563 0,76 0,73684 0,72581 0,68116 0,75472 0,83099 0,88462 0,7284 0,69118 29 0,82716 0,8 0,72131 0,79747 0,75 0,73611 0,774650,75 0,70492 0,81481 0,82353 0,76842 0,75 30 0,83333 0,82716 0,81667 0,80519 0,76471 0,74286 0,76119 0,71014 0,76786 0,84337 0,77083 0,78889 0,76543 31 0,70909 0,74194 0,6383 0,73684 0,71642 0,75862 0,77193 0,72131 0,6383 0,78462 0,73171 0,72603 0,64286 32 0,76712 0,75362 0,66667 0,75 0,80822 0,71154 0,78846 0,77586 0,65116 0,77465 0,66667 0,8046 0,8 33 0,76136 0,75556 0,76119 0,72414 0,73626 0,7013 0,73611 0,73171 0,68966 0,73034 0,71429 0,72642 0,67442 22 Continuação da tabela. 34 0,79487 0,81609 0,81034 0,82022 0,77778 0,73529 0,75362 0,73913 0,67391 0,82222 0,82692 0,76699 0,75 35 0,64706 0,66667 0,72973 0,61905 0,65957 0,61538 0,74359 0,69231 0,64286 0,69565 0,7 0,69231 0,66667 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 0 15 0,68531 0 23 16 0,5906 0,62016 0 17 0,73684 0,575 0,75229 0 18 0,68 0,70755 0,61538 0,7766 0 19 0,75424 0,75532 0,77391 0,72368 0,68675 0 20 0,68033 0,69307 0,74194 0,60526 0,73913 0,64103 0 21 0,63636 0,57143 0,65891 0,60976 0,67925 0,72414 0,6875 0 22 0,78621 0,73684 0,74242 0,60976 0,80734 0,78889 0,65263 0,65686 0 23 0,71111 0,76923 0,68182 0,74138 0,72857 0,76471 0,77778 0,76 0,68571 0 24 0,8172 0,74286 0,81443 0,66038 0,81579 0,76364 0,69492 0,71831 0,68254 0,66667 0 25 0,65957 0,78261 0,71429 0,75 0,73469 0,64706 0,66667 0,63636 0,77778 0,65517 0,7 0 26 0,75362 0,70588 0,79104 0,66 0,64583 0,67308 0,64 0,73585 0,76271 0,70732 0,68571 0,5 0 27 0,79104 0,76786 0,77419 0,74468 0,75862 0,70732 0,78261 0,77049 0,81132 0,71053 0,74286 0,65625 0,56 28 0,69333 0,73239 0,68056 0,76786 0,72131 0,74138 0,73529 0,64063 0,71212 0,72 0,71739 0,70732 0,63415 29 0,71591 0,77333 0,76923 0,78082 0,72603 0,72727 0,74286 0,71429 0,77632 0,77193 0,71429 0,63889 0,64444 30 0,75904 0,77941 0,76471 0,75758 0,82278 0,81667 0,78261 0,81081 0,77465 0,77551 0,81132 0,76744 0,69048 31 0,72727 0,72727 0,56897 0,74545 0,72881 0,80769 0,78333 0,8 0,77419 0,6 0,70732 0,7 0,63889 32 0,80233 0,73846 0,82418 0,81132 0,71875 0,76471 0,78571 0,76471 0,85075 0,80769 0,76316 0,7 0,78125 33 0,72917 0,6962 0,73958 0,78205 0,72289 0,77273 0,74359 0,75 0,78824 0,72 0,71698 0,72917 0,65116 34 0,77778 0,82278 0,74194 0,78261 0,7561 0,81818 0,71642 0,81707 0,76 0,75 0,83019 0,67568 0,61111 35 0,65306 0,64103 0,68889 0,68293 0,70213 0,76316 0,74419 0,71111 0,71429 0,59259 0,59259 0,66667 0,52381 24 Continuação da tabela. 27 28 29 30 31 32 33 34 35 MDG SVD 1 0,708336 24,79176 2 0,714468 25,00637 3 0,713714 24,98 4 0,712988 24,95458 5 0,688275 24,08961 6 0,693159 24,26056 7 0,695973 24,35907 8 0,716997 25,09491 9 0,704776 24,66715 10 0,703175 24,61112 11 0,77967 27,28844 12 0,697132 24,39963 13 0,690074 24,1526 14 0,687394 24,05878 15 0,704081 24,64285 16 0,697314 24,406 17 0,71257 24,93996 25 Fim da tabela MDG: Média de dissimilaridade entre genótipos; SVD: Somatório dos valores de dissimilaridade. 18 0,698161 24,43563 19 0,737996 25,82987 20 0,709301 24,82552 21 0,701633 24,55715 22 0,744035 26,04121 23 0,703664 24,62824 24 0,748398 26,19392 25 0,694006 24,29021 26 0,687076 24,04765 27 0 0,71896 25,1636 28 0,68182 0 0,696666 24,3833 29 0,60526 0,58824 0 0,700544 24,51903 30 0,76596 0,5625 0,60784 0 0,725028 25,37597 31 0,67857 0,73333 0,65306 0,58696 0 0,676971 23,69399 32 0,53846 0,77273 0,69767 0,8 0,74194 0 0,729461 25,53112 33 0,65217 0,66102 0,60714 0,58929 0,64583 0,62222 0 0,686269 24,01942 34 0,68293 0,68889 0,64583 0,54167 0,61538 0,81818 0,68966 0 0,720035 25,20121 35 0,66667 0,64706 0,6 0,61111 0,41176 0,70833 0,56757 0,57143 0 0,635178 22,23123 26 A amplificação dos 17 primers ISSR permitiram a distinção dos genótipos e formação de 15 grupos (Figura 7). Determinou-se o ponto de corte do dendograma com o valor de DGM (Diversidade Genética Média). Figura 7: Dendograma obtido pela análise de primers ISSR pelo complemento do índice de coincidências simples, com agrupamento pelo método de Ligação Média Entre Grupos (UPGMA). Tabela 4: Grupos formados pelo corte do dendograma e dos genótipos de A. andraeanum correspondentes a cada grupo. Grupo Indivíduos Grupo Indivíduos G1 33, 35. G09 19, 28. G02 7, 22, 6. G10 27, 32, 17. G03 10, 14. G11 31, 34. G04 1, 5. G12 13, 25. G05 11, 24, 12. G13 4. G06 2, 9. G14 3, 20. G07 23, 30, 21, 29. G15 15, 26, 16. G08 8, 18. 100,0 100,0 4,2 39,6 100,0 11,5 5,1 16,6 13,4 37,4 9,1 100,0 100,0 7,8 100,0 0 100,0 100,0 11,0 5,3 100,0 8,1 13,4 100,0 100,0 100,0 15,1 100,0 11,6 2,5 5,8 7,2 26,0 13,1 100,0 25,8 69,6 27 5 Discussão A grande porcentagem de padrões polimórficos em relação aos monomórficos apresentados nesse trabalho supera em muito os valores por descritos em algumas literaturas (WITONO et al.,2008; DOMYATI et al.,2011; ZHOU et al., 2008). Witono et al.(2008), utilizaram dez primers ISSR para análise do polimorfismo de Alocasia odora e A. cucullata, tendo uma taxa de polimorfismo de 72,60% para esses primers com 73 bandas amplificadas. Dentre esses dez, os primers: UBC808, UBC834, UBC843 e UBC845 obtiveram 37,74% de polimorfismo com caráter polimórfico de 75,52%. No presente estudo, os mesmos primers apresentaram 23,74% de polimorfismo com caráter de 96,69%. Embora para esses primers os valores de polimorfismo tenham sido pequenos, primers como os UBC841 (Figura 3), UBC845, UBC827 e UBC819 foram os que apresentaram maiores números de bandas com caráter polimórfico, igual a 100%, e respondendo com um valor de 33,07% do total de polimorfismo. Este resultado indica que embora seja a mesma família, os gêneros Alocasia e Anthurium apresentam grande distinção entre si, e são possuidoras de grande diversidade, o que aumenta a probabilidade de obtenção de materiais com novas características. A figura 7 mostra as diferentes classes formadas a partir da análise dos dados obtidos pelas amplificações. Domyati et al.(2011), para estudo feito com a utilização de marcadores moleculares, dentre eles o ISSR, para análise da diversidade genética de plantas medicinais no Sinai obteve um valor de 67% de bandas polimórficas das 914 amplificadas. Este valor acaba por ser muito baixo em relação ao obtido nesse estudo. Pela separação de fragmentos de DNA dos genótipos, se percebeu que a maior quantidade gerada pelos 17 primers se encontrava entre 500 a 1000pares de base. Contudo, houve bandas com peso superiores a 1000 pares de base e inferiores a 500, com mínimo de 200pb. George et al. (2006), obtiveram fragmentos amplificados de especiarias com peso variando entre 150 a 2000 pares de base. Valores próximos também foram encontrados por Abd El-Hady et al. (2010), que obtiveram bandas com peso entre 255 a 2838 pares de bases. 28 Pela tabela de dissimilaridade (Tabela 3), e pelos gráficos de média e de somatório de dissimilaridade (Figura 6 e 4), percebe-seque os indivíduos 24 e 11, sublinhados de cor roxa, se apresentam como sendo os de maiores valores de dissimilaridade e podendo ser indicados como genitores para produção de híbridos que proporcionam maior incremento de caracteres diferenciados. Pela análise da tabela 3 é possível a distinção dos cruzamentos de maior porcentagem de diversidade, sublinhados de azul, e os cruzamentos de menor probabilidade de gerar indivíduos contrastantes aos pais, ou seja, de menor valor de dissimilaridade, sublinhados em cinza. Através do somatório dos valores de dissimilaridade dos indivíduos e de sua média, foi possível a distinção dos que apresentavam elevados valores de dissimilaridade dos que apresentavam baixos valores. Percebe-se que, embora o indivíduo quatro não tenha apresentado elevado valor de dissimilaridade, ele foi o único indivíduo a constituir um grupo (Tabela 3 e 4). 6 Conclusões Com o presente trabalho, concluímos que os marcadores ISSR são informativos para avaliar a diversidade presente nos genótipos de Anthurium andraeanum permitindo a distinção entre eles. Também se verificou que os indivíduos 11 e 24 de antúrio a elevado, em comparação aos demais analisados, o que indica serem boas escolhas para realização de cruzamentos com os demais indivíduos gerarão progênies com padrões divergentes ao dos pais, possibilitando uma gama de novos produtos e desse modo novos mercados consumidores. Também se verificou que cruzamentos do indivíduo 11 com o 19, 22 e o 28, apresentaram elevados valores de dissimilaridade, demostrando serem bons parentais para uma progênie segregante. Enquanto que cruzamentos entre os indivíduos 35 x 31; e 2 x 1, são desvantajosos pois não apresentarão progênie tão segregante quanto os demais, já que seus valores de dissimilaridade são muito baixos. Contudo, para uma sólida afirmativa, análises dos caracteres morfológicos e agronômicos deverão ser realizadas, permitindo uma melhor seleção de cruzamentos controlados para obtenção de plantas com padrões exigidos pelo consumidor. 29 7 Referências Bibliográficas ABD EL-HADY, E. A. A.; HAIBA, A. A. A.; ABD EL-HAMID, N. R.; AL-ANSARY ABDEL-R, M. F.; MOHAMED, A. Y. Assessment of Genetic Variations in Some Vigna Species by RAPD and ISSR Analysis. New York Science Journal, 3: 11.2010 ABDELNOOR, R.V.; BARROS, E.G. DE; MOREIRA, M.A. Determination of genetic diversity within Brazilian soybean germplasm using random amplified polimorphic DNA techniques and comparative analysis with pedigree. Revista Brasileira de Genética, v. 18, p.265-273, 1995. ACEBEY, A.; KRÖMER, T.; MAASS, B.L.; KESSLER, M. Ecoregional distribution of potentially useful species of Araceae and Bromeliaceae as non- timber forest products in Bolivia. Biodiversity Conservation, n.19, p. 2553- 2564. 2010. ARBER, M.A.A. Monocotyledons. A morphological study. London, University Press. 258p. 1961. BATISTA, E. C., TELLES, M. P. C., RAMOS, J. R., SOARES, T. N., DINIZ FILHO, J. A. , FERREIRA, H. D. Variabilidade genética intrapopulacional utilizando marcadores ISSR em Tibouchina papyrus.2008. Disponível em:<http:// www.cpac.embrapa.br/download/437/t >Acesso em: 04 maio 2010 BARGUIL, B. M.; OLIVEIRA, S. M. A.; COÊLHO, R. S. B. Summa Phytopathol. 2008, 34, 156. BERED, F; BARBOSA NETO, J. F; CARVALHO, F. I. F. de. Marcadores moleculares e sua aplicação no melhoramento genético de plantas. Ciência Rural, Santa Maria, v, 27, n.3, p. 513-520, 1997. 30 BOGNER, J., AND D. H. NICOLSON. A revised classification of Araceae with dichotomous keys. Willdenowia, 21: 35–50. 1991. BOGNER, J. e PETERSEN, G. The chromosome numbers of the Aroid genera. Aroideana, 30:82-90. 2007. BORÉM, A.; MIRANDA, G. V. Melhoramento de plantas. 4 ed. Viçosa: UFV, 525p. 2005. CARVALHO, D.; TORRES, G. A. Marcadores Moleculares. Lavras: UFLA/FAEPE. 2002. 35p. CASTRO, C. E. F. ; TOMBOLATO, A. F. C. . Seleção de variedades de Antúrio (Anthurium andraeanum Lindl. ) para Flor de Corte no Instituto Agronômico. In: Hortitec 2002, Holambra. Resumos Hortitec 2002, p. 18-18. 2002.. Disponível em: <http://www.portaldoagrovt.com.br/agro/seminario_internacional_de_cultivo_pr otegido/mg_anturio.pdf >. Acesso em: 17 out 2012. CASTRO, A.C.R.; RESENDE, L.V.; GUIMARÃES, W.N.R; LOGES, V. Uso de técnicas moleculares em estudo de diversidade genética em Anthurium. Revista Brasileira de Horticultura Ornamental, v.10, n.1/2, p.6-9, 2004. CASTRO, N. K.; AVANZI, V. M.; GUEDES, A. A. de S.; OLIVEIRA, A. V. de. Análise genética de espécies do gênero hypostomus sp. Do Rio ivaí, através de marcadores moleculares ISSR. 2009. Disponível em: < http://www.cesumar.br/epcc2009/anais/natascha_karoline_castro.pdf >. Acesso em 15 jun 2012. CALDARI JUNIOR, P. Técnicas de cultivo do antúrio (Anthurium andraeanum). Revista Brasileira de Horticultura Ornamental, v.10, n.1/2, p.42–44, 2004. 31 CATE-ARACEAE. Creating a taxonomic e-science. 2009. Disponível em:<http://www.cate-araceae.org>. Acesso em: 18 jul. 2012. CEAGESP, Disponível em: http://www.ceagesp.gov.br/cotacoes Acesso em: 01 de maio de 2010. CIAMPI, A. Y.; GRATTAPAGLIA, D. Variabilidade genética em populações de copaíba (Copaifera langsdorffii Desf. – Caesaelpiniaceae) estimada com polimorfismo de AFLP, microssatélites e sequenciamento de cpDNA. Boletim de Pesquisa de Desenvolvimento 12, EMBRAPA, Brasília, dez., 2001. COELHO, M.A.N.; CATHARINO, E.L.M. Duas espécies novas de Anthurium Schott (Araceae) para o Brasil. Rodriguésia: Revista do Jardim Botânico do Rio de Janeiro, v.56, p.35-41, 2005. COELHO, M. A. N.; WAECHTER, J. L.; MAYO, S. J. Rodriguésia, n, 60, 799. COELHO, M.A., SOARES, M., SAKURAGUI, C., MAYO, S., ANDRADE, I.M., TEMPONI, L.G. 2010. Araceae. In: Lista de Espécies da Flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Disponível em:<http://floradobrasil.jbrj.gov.br/2010/FB000051>. Acesso em: 18 agos. 2010. COELHO, M.A.N., TEMPONI, L.G. 2012. Anthurium In: Lista de Espécies da Flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Disponível em :<http://floradobrasil.jbrj.gov.br/2012/FB004912>. Acesso em : 18 jul 2012. COLLETTE, V.E. et al. Temporal and spatial expression of flavonoid biosynthetic genes in flowers of Anthurium andraeanum. Physiologia Plantarum, v.122, n.3, p.297-304, 2004. Disponível em: <http://www3.interscience.wiley.com/ cgi-bin/fulltext/118761191/PDFSTART>. Acesso em: 05 fev. 2010. doi: 10.1111/j.1399-3054.2004.00402.x. 32 COTIAS-DE-OLIVEIRA, A.L.P., GUEDES, M.L. e BARRETO, E.C. Chromosome numbers for Anthurium and Philodendron spp. (Araceae) occurring in Bahia. Genetics and Molecular Biology, 22: 237-242. 1999. CRONQUIST, A. An integrated system of classification of flowering plants. New York, Columbia University Press. 1097p. 1981. CRUZ, C.D. GENES – versão Windows. Editora UFV. Viçosa, MG. 642p. 2001. DAHLGREN, R.M.T.; CLIFFORD, H.T.; YEO, P.F. The Families of the Monocotyledons. Structure, Evolution, and Taxonomy. Germany, Springer- Verlag, 519p. 1985. DALE,G.; CHAPARRO, J. Integration of molecular markers into tree breeding and improvement programs. In: IUFRO CONFERENCE ON SILVICULTURE AND IMPROVEMENT OF EUCALYPTUS, Salvador. Proceedings. Colombo: EMPRAPA/CNPF, 1997. v.2 p.80, 1997. DOMYATI, F. M.; YOUNIS, R. A. A.; EDRIS, S.; MANSOUR, A.; SABIR, G.; BAHIELDIN, A. Molecular markers associated with genetic diversity of some medicinal plants in Sinai. Journal ofMedicinal Plants Research, Vol. 5(2). 2011. 200-210 p. Disponível em: < http://www.academicjournals.org/jmpr/PDF/pdf2011/18Jan/Domyati%20et%20al .pdf>. Acesso 18 jul 2012. DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, v.12, p.13-15, 1990. DUFOUR, L.; GUERIN, V. Growth, developmental features and flower production of Anthurium andraeanum Lind. in tropical conditions. Scientia Horticulturae, 2003, vol. 98, no. 1, p. 25-35. ELIAS, D. O.; SOUZA, M. H. L. Novos marcadores bioquímicos da injúria miocárdica. Centro de Estudos de Circulação Extracorpórea. 1998. Disponível 33 em: <http://perfline.com/artigos/artigos98/markers.htm>. Acesso em 20 jul 2012. ENGLER, A. Araceae. In C.F.P. von Martius, Flora Brasiliensis 3(2): 25-224, tt. 2-52. F. Fleischer, Leipzig. 1878. ENGLER, A. Engler´s Botanische Jahrbücher (25): 393, 394, 400, 411, 413, 415. 1898. ENGLER, A. Pothoideae. In: A. Engler (ed.). Das Pflanzenreich IV. Ed., 23B (Heft 21). Engelmann, Leipzig, pp. 133-174. 1905. FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 3º ed. Brasília: EMBRAPA, CENARGEN, p. 220, 1998. FERREIRA, M.E; MORETZSOHN, M. C.; BUSO, G.S.C. Fundamentos de caracterização molecular de germoplasma vegetal. In: NASS, L.L. Recursos genéticos vegetais. Brasília. Embrapa recursos genéticos e biotecnologia. 2007. 858p. GANTAIT, S.; MANDAL, N.; BHATTACHARYYA, S.; DAS, P. K.In vitro Mass Multiplication with Pure Genetic Identity in Anthurium andreanum Lind. Plant Tissue Cult. e Biotech, 18(2): 113-122, 2008. GEIER, T. Anthurium, In: P.V.Ammirato, D.A. Evans, W.R. Sharp, and Y.P.S. Bajaj (eds.). Handbook of plant cell culture. McGraw-Hill, New York vol. 5. p. 228-252.1990. GEORGE, K.J.; VARMA, R.S.; GANGA, G.; UTPALA, P.; SASIKUMAR, B.; SAJI, K.V.; PARTHASARATHY, V.A. ISSR markers for genetic diversity analysis in spices - An appraisal. Indian J. Hort, 63(3), September : 302-304, 2006. 34 GOMES, S.R.P. Morfo-anatomia do desenvolvimento de Anthurium scandens (Aublet.) Engler. Dissertação de mestrado em Botânica, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR. 89p. 1990. GOMES, C. C.; MOURA ,T. M. de. Estrutura genética em populações de plantas do cerrado. Agrotecnologia. Trabalho de Conclusão de Curso. UEG. v. 1, n. 1 .2010. Disponível em: < www.prp.ueg.br/revista/index.php/agrotecnologia/article/view/211>. Acesso em 17 out 2012. GRAYUM, M.H. Evolution and phylogeny of the Araceae. Annals of the Missouri Botanical Garden 77:628-697. 1990. HIGAKI, T.; RASMUSSEN, H. P. ; CARPENTER, W. J. A study of some morphological and anatomical aspects of Anthurium andraeanum Lind. Honolulu: University of Hawaii, 1984. 12p. (HITHAR Research Series, 30). HOTTA, M. Study of the family Araceae- general remarks. Jpn. J. Bot, 20:269- 310. 1971. IBRAFLOR (Instituto Brasileiro de Floricultura). Agosto de 2012 – Ano 03/ Volume 27. Disponível em: <http://www.ibraflor.com/publicacoes/vw.php?cod=182>. Acesso em 20 out 2012. JESHIMA KHAN, Y. e PANKAJAKSAN, M. Genetic diversity among commercial varieties of Anthurium andreanum Linden using RAPD markers. Journal of Plant Genet & Transgenics, 1 (1): 11-15, 2010 JUDD,W.S.; CAMPBELL,C.S.; KELLOG,E.A. Plant systematics- A phylogenetic approach. USA, Sinauer Associates, 464p. 1999. KANASHIRO, M.: HARRIS, : SIMONS, A. RAPD Diversity in Brazil Nut (Bertolletia excelsa Humb. And Bonpl., Lecythidaceae). Silvae Genética, 35 Frankfurt, v.46, n.4, p.219-224, 1997. KEATING, R.C. Leaf anatomical characters and their value in understanding morphoclines in the Araceae. Botanical Review, 68: 510-523. 2002. KUEHNLE, A. R.; SUGII, N. Callus Induction and Plantlet Regeneration in Tissue Cultures of Hawaiian Anthuriums. HORTSCIENCE, 26. p919-921. 1991. KUEHNLE, A. R.; Chen, F. C.; SUGII, N. Somatic embryogenesis and plant regeneration in Anthurium andraeanum hybrids. Plant Cell Reports, v. 11 p. 438-442. 1992. LAWS, N.; GALINSKY, B. Anthurium world market survey. FloraCulture International, p.21-23, june, 1996. LEE, S.L. Genetic Diversity of a Tropical Tree Species, Shorea leprosula Miq.(Dipterocarpaceae), in Malaysia: Implications for Conservation of Genetic Resources and Tree Improvement. Biotropica, St. Louis, v.32, n.2, p.213-224, june 2000. LIU, B.; WENDEL, J.F. Inter-simple sequence repeat (ISSR) polymorphisms as genetic marker system in cotton. Molecular Ecology Notes, 1:205-208, 2001. MAYO, S.J.; BOGNER, J. e BOYCE, P.C. The genera of Araceae. Royal Botanical Garden, Kew, London. 370p. 1997. MILLAR, C.I.; WESTFALL, R.D. Allozyme markers in forest genetic conservation. New Forests, v.6, p.347-371, 1992. NOWBUTH, P.; KHITTOO, G.; BAHORUN, T.; VENKATASAMY, S. Assessing genetic diversity of some Anthurium andraeanum Hort. cut-flower cultivars using RAPD Markers. African Journal of Biotechnology, Vol. 4 (10), pp. 1189- 1194, Oct. 2005. Disponível em: < 36 http://www.academicjournals.org/AJB/PDF/Pdf2005/Oct/Nowbuth%20et%20al.p df >. Acesso em : 14 de junho de 2010. PETERSEN, G. Cytology and systematics of Araceae. Nordic Journal of Botanic, 9:119-166. 1989. PIERIK, R.L.M., STEEGMANS, H.H.M. e VAN DER MEYS, J.A.J. 1974. Plantlet formation in callus tissues of Anthurium andreanum Lind. Scientia Horti., 2: 193-198. POLACK, S.W. Produção em diferentes adubações e substratos e pós- colheita de antúrios de corte. 2006. 84p. Dissertação (Mestrado em Fitotecnia) – Universidade Federal do Paraná, Curitiba. PUCHOOA, D E SOOKUN, D. Induced mutation and in vitro culture of Anthurium andreanum. Food and Agricultu ral Research Council, Réduit, Mauritius. AMAS 2003. RANAMUKHAARACHCHI, D.G.; HENNY, R.J.; GUY, C.L. DNA fingerprinting to identify nine anthurium pot plant cultivars and examine their genetic relationships. Horticultural Science, 36: 758 -760, 2001. RATNAPARKHE, M. B; TEKEOGLU, M; MUEHLBAUER, F. J. Inter-simple- sequence-repeat (ISSR) polymorphisms are useful for finding markers associated with disease resistance gene clusters. Theoretical and Applied Genetics, 97: 515-519, 1998. REDDY, M. P ; SARLA, N.; SIDDIG, E. A. Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding. Euphytica, 129:9-17, 2002. REITZ, P.R. Araceas Catarinenses. Sellowia, 20-70. 1957. RIBEIRO, J.E.L.S.; HOPKINS, M.J..G.; VICENTINI, A.; SOTHERS, C.A.; COSTA, M.A.S.; BRITO, J.M.; SOUZA, M.A.D.; MARTINS, L.H.P.; LOHMANN, 37 L.G.; ASSUNÇÃO P.A.C.L.; PEREIRA, E.C.; SILVA, C.F.; MESQUITA, M.R. e PROCÓPIO, L.C. Flora da Reserva Ducke. Guia de identificação das plantas vasculares de uma floresta de terra-firme na Amazônia Central. Manaus, INPA. 816p. 1999. SAKAI, E. Cultivo de antúrio: uma experiência no Vale do Ribeira. Revista Brasileira de Horticultura Ornamental, v.10, n.1/2, p.27–34, 2004. SANTOS, M. R. A. DOS; TIMBÓ, A. L. DE O.; CARVALHO, A. C. P. P. DE; MORAIS, J. P. S. Callus induction and plant regeneration from Anthurium andraeanum lindl. Fruits. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 1, n. 2, p. 77-79, 2005. SANTOS, F. R. dos; FONSECA, C G. da; SOUZA, E. C. de; BORBA, E. L.; DERGAM, J. A.; LOVATO, M. B. Diversidade Genética. IN: Biota Minas: diagnóstico do conhecimento sobre a biodiversidade no Estado de Minas Gerais. (eds) Gláucia Moreira Drummond, Cássio Soares Martins, MagdaBarcelos Greco, Fábio Viera; equipe técnica Amanda Alves dos Santos... [et al.] Belo Horizonte: Fundação Biodiversitas, 2009. 624 p. Disponível em: <http://www.biodiversitas.org.br/biotaminas/publicacao/biotaminas.pdf>. Acesso em: 12 nov 2012. SANTOS, Fernando Santiago dos. A Importância da Biodiversidade. Revista Paidéi@,UNIMES VIRTUAL, v. 2, n. 4, dez. 2010. Disponível em: <http://revistapaideia.unimesvirtual.com.br>. Acesso em: 12 nov 2012. SEBRAE. Estudo para Implantação de Pólo de Floricultura Tropical em MS. Serviço de Apoio às Micro e Pequenas Empresas de Mato Grosso do Sul – SEBRAE/MS, 40p. 2008. (Relatório). Disponível em: <http://www.sebrae.com.br/uf/mato-grosso-do sul/setores/agronegocios/agro/Estudo%20Flores.pdf>. Acesso em: 14 jul 2011. SHEFFER, R.D. e CROAT, T.B. Chromosome numbers in the genus Anthurium (Araceae). II. American Journal of Botany, 70:858-871. 1983. 38 SNEATH, P.H.; SOKAL, R.R. Numerical taxonomy: the principles and practice of numerical classificacion. San Francisco: W. H. Freeman, 573p. 1973. SOLÉ-CAVA, A. M. Biodiversidade molecular e genética da conservação. In: MATIOLI, S. R. (ed.). Biologia Molecular e Evolução. Ribeirão Preto: Holos, p.172-192, 2001. SOUZA, G. A. de; CARVALHO M. R. de O.; MARTINS E. R.; GUEDES, R. N. C.; OLIVEIRA, L. O. de. Diversidade genética estimada com marcadores ISSR em populações brasileiras de Zabrotes subfasciatus . Pesq. agropec. bras., Brasília, v.43, n.7, p.843-849, jul. 2008. Disponível em:< http://webnotes.sct.embrapa.br/pdf/pab2008/07/43n07a08.pdf > Acesso em 30 abr 2010. TEMPONI, L.G.; GARCIA, F.P.G.; SAKURAGUI, C.M.; CARVALHO-OKANO, R.M. Diversidade morfológica e formas de vida das Araceae no Parque Estadual do Rio Doce, Minas Gerais. Rodriguésia, 56: 1-13. 2005. TILLICH, H.J. Development and organization. In: The Families and Genera of Vascular Plants. Vol.3. Flowering Plants. Monocotyledons. Lilianae (except Orchidaceae). Berlin, Ed. K. Kubitzki. p.1-19. 1998. TOMBOLATO, A.F.C.; RIVAS, E.B.; COUTINHO, L.N.; BERGAMAN, E.C.; IMENES, S.L.; FURLANI, P.R.; CASTRO, C.E.F.; MATTHES, L.A.F.; SAES, L.A.; COSTA, A.M.M.; TAGLIACOZZO, G.M.D.; LEME, J.M. O cultivo de antúrio: produção comercial. Campinas: Instituto Agronômico, 47p. 2002. (Série Tecnologia APTA, Boletim técnico IAC, 194) TOMBOLATO, A. F.; FURLANI, P. R., CASTRO, C. E. F.; MATHES, L. A. F.;TAGLIACOZZO, G. M. D.; SAES, L.A.; RIVAS, E. B.; COUTINHO, L. N.; BERGMAN, E. C.; IMENES, S. L.; COSTA, A. M. M..; LEME, J. M. Antúrio 39 (Anthurium andraeanum Lindl.). In: TOMBOLATO, A. F. Cultivo comercial de plantas ornamentais. Campinas: Instituto Agronômico, 2004. p. 61-94. TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Embrapa,1998. 509 p. VIEIRA, R.F.; AGOSTINI-COSTA, T. S. Caracterização química de metabólitos secundários em germoplasma vegetal. In: Nass, L.L. Recursos genéticos vegetais. Brasília. Embrapa recursos genéticos e biotecnologia. 2007. 858p. VAN HERK, M.; VAN KOPPEN, M.; SMEDING, S.; VAN DER ELZEN, C. J.; VAN ROSMALEN, N.; VAN DIJK, J.; LONT, A.; VAN SPINGELEN, J. Cultivation guide anthurium: global know-how for growers around the globe. Bleiswijk: Anthura B. V., 1998. 140 p. WANG, Z.; WEBER, J.L.; ZONGH, G.; TANKSELY, S.D. Survey of plant short tandem DNA repeats. Theoretical and Applied Genetics, 88: 1-6, 1994. WIKIPÉDIA. 2012. Disponível em:< http://pt.wikipedia.org/wiki/Diversidade_gen%C3%A9tica>. Acesso em 20 out 2012. WITONO, J.R.; KONISHI, T.; KONDO, K. DNA polymorphisms analysis of Alocasia odora and A. cucullata in Ishigaki Island, Japan generated by RAPD and ISSR markers and ITS nrDNA sequence data . Chromosome Botany, 3: 11-18, 2008. WOLFE, A.D.; LISTON, A. Contributions of PCR-based methods to plant systematics and evolutionary biology. In: SOLTIS, D.E.; SOLTIS, P.S.; DOYLE, J.J. (Ed.). Molecular systematics of plantsII: DNA sequencing. Boston: Kluwer, p.43-86. 1998. 40 ZHOU, Y.; ZHOU, C.; YAO, H.; LIU, Y.; TU, R Application of ISSR markers in detection of genetic variation among Chinese yam (Dioscorea opposita Thunb) cultivars. Life Science Journal, Vol 5, No 4, 6 – 12p. 2008. ZIETKIEWICZ, E., RAFALSKI, A., LABUDA, D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, v.20, p.176-183, 1994.