Testes imunológicos

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Testes imunológicos 
 
• Introdução: 
Os testes imunológicos é um importante tema e de constante avanço no transplante 
renal. Desde o clássico estudo de Terasaki em 19691, é proibitivo a realização do 
transplante sem antes ser avaliado o risco imunológico do procedimento. 
Podemos dividir os testes em dois grandes grupos: as provas cruzadas e os testes 
de fase sólida. As provas cruzadas podem ser por citotoxicidade dependente de 
complemento (CDC) ou por citometria de fluxo, enquanto os testes de fase sólida 
são exames imunoenzimáticos semiquantitativos que visam a detecção de 
anticorpos contra antígenos HLA (Human Leukocyte Antigen) presentes na 
população em geral (teste de reatividade contra painel – PRA) ou no doador (neste 
caso – “donor specific alloantibody” – DSA). 
Cada teste imunológico tem um grau de especificidade, e quando bem executados 
e interpretados podem ser muito úteis para predizer o risco de rejeição aguda e 
com isso ajudar na definição de conduta baseado no perfil do serviço de transplante 
em questão e no contexto clínico do paciente. De uma forma geral, apenas a prova 
cruzada por CDC contraindica o transplante pela sua alta associação a rejeição 
hiperaguda, entretanto, qualquer evidência de anticorpo pré-formado contra o 
doador, desde que não seja considerado falso positivo (como será comentado 
adiante), reflete um maior risco de menor sobrevida do enxerto, sendo importante 
para ponderar risco-benefício da realização do transplante. 
 
• Princípios Gerais: 
 
O primeiro passo na avaliação imunológica do transplante é a avaliação da 
compatibilidade pelo sistema ABO. Pacientes ABO incompatíveis não avançam nos 
testes de compatibilidade. Para o transplante renal é feita a tipagem sanguínea 
ABO através das técnicas usuais de aglutinação direta, e respeitado a 
compatibilidade (a mesma regra utilizada para transfusões sanguíneas) com 
 
exceção dos casos de doador falecido, onde, por questão de “justiça social”, são 
alocados os órgãos pela identidade em vez da compatibilidade. 
A avaliação inicial do transplante envolve o estabelecimento do risco de 
sensibilização, através da história clínica. Pacientes com passado de transfusões 
sanguíneas, gestações prévias e transplante anterior apresentam uma 
probabilidade pré-teste muito maior do que os que não apresentam eventos como 
estes de possuírem anticorpos pré-formados, e esta informação é importante para 
analisar os resultados de testes imunológicos que vão interferir no desfecho clínico 
do transplante. Pacientes candidatos a transplante que já possuem um transplante 
prévio, história de gestação ou hemotransfusões apresentam maior probabilidade 
de terem desenvolvidos anticorpos anti-HLA. Essa sensibilização não acontece de 
forma imediata e, portanto, o soro do paciente candidato a receptor deve ser testado 
novamente sempre após 15 dias do evento sensibilizatório. 
O sistema HLA é composto por moléculas presentes em todas as células - HLA 
classe I - e células especializadas apresentadoras de antígenos (macrófagos, 
células dendríticas, linfócitos B, linfócitos T e células endoteliais ativadas) - HLA 
classe II. Essas substâncias são glicoproteínas de superfície celular, originadas do 
complexo principal de histocompatibilidade, ou MHC (major histocompatibility 
complex), nome este dado justamente devido a importância do produto da tradução 
destes genes na resposta imunológica ao transplante. A molécula HLA I é composta 
de uma uma cadeia α e uma cadeia menor chamada β2-microglobulina, enquanto 
a molécula HLA II é composta de uma cadeia α ligada de forma não covalente a 
uma cadeia β. Por serem formado por duas cadeias polimórficas, os genes que 
codificam as moléculas de HLA clase II em geral vem escrito com a letra A ou B 
depois das duas primeiras letras (p. ex: gene DQA1, DRB4, DQB1 etc.). Essas 
moléculas possuem intenso polimorfismo, apresentam herança mendeliana 
simples com codominância, e estão associadas à apresentação de uma gama 
variada de antígenos, sendo, portanto, peças chaves no processo imunogênico do 
transplante. No contexto da doação de órgãos, um dos primeiros passos é a 
tipificação HLA da dupla doador x receptor, através de técnicas de amplificação do 
DNA. Idealmente, no transplante renal, a tipificação HLA inclui os loci A, B, C, 
 
DRB1,3,4,5, DQB1, DQA; DPB1 e DPA2,3, mas muitas vezes essa tipificação 
completa não é feita. Aqui no Brasil, usualmente os laboratórios tipificam apenas 
os HLA A, B e DR. Alguns poucos laboratórios realizam a tipificação do dos demais 
loci gênicos, de acordo com a necessidade, afim de uma análise mais acurada do 
risco imunológico. 
A tipificação HLA pode ser realizada em alto, médio ou baixo grau. Em baixo grau 
permite a definição das especificidades HLA/grupos de alelos. Na tipificação HLA 
em média resolução é possível restringir os possíveis alelos. Nesses casos, 
utilizamos o código NMDP para representa-los, que é um código baseado no banco 
de dados de doadores de medula óssea norte-americano. Em alto grau temos o 
alelo definido. Para cada nível de diferenciação é colocado um número separado 
por “dois pontos”. Um alelo já definido é representado convencionalmente pelos 
números até a segunda casa. Para o transplante renal a tipificação em médio grau 
já é o suficiente. No caso de transplantes de doadores vivos aparentados, após a 
determinação dos grupos de alelos, é realizada a análise dos haplótipos herdados. 
A determinação da coincidência de alelos é realizada através da dedução dos 
haplotipos parentais. Outros tipos de transplantes, como o transplante de medula 
óssea, precisam de uma tipificação mais precisa, que diferencia o gene em alta 
resolução. A nível de estudos biológicos, muitas vezes é feita a tipificação que 
levam em consideração a análise completa da molécula de DNA, incluindo 
variações silenciosas nos éxons e os introns, sendo este nível de especificidade 
estão representados pela nomenclatura através dos números a partir da terceira 
casa, como exemplificado na figura abaixo. 
 
 
 
 
 
 
• Testes de fase sólida 
Os testes de fase sólida são exames semiquantitativos onde o soro do paciente é 
testado contra antígenos implantados em uma superfície sólida, e formam os 
principais exames envolvidos na avaliação imunológica do transplante. Atualmente 
a principal metodologia de quantificação utilizada é a imunofluorescência – 
Luminex. Usualmente o teste envolve duas etapas, com a primeira de triagem com 
placas contendo microesferas chamadas “beads” com vários antígenos, 
normalmente separados em HLA-I e HLA-II, e uma segunda com “beads” HLA 
específico. O resultado então é dado como intensidade de fluorescência média 
(MFI). 
Geralmente esses exames são os mais importantes na escolha do doador pela sua 
alta sensibilidade, entretanto, por não ser um resultado qualitativo dicotômico, pode 
gerar dificuldade em sua interpretação e o valor de corte ou “cut-off” ideal ainda não 
está tão bem estabelecido na literatura2,3,6,7. 
O ponto de corte deve ser interpretado baseado no objetivo clínico do teste e 
aplicado aos algoritmos de aceitação de órgãos baseado no perfil do serviço. A 
presença única e simplesmente de anticorpo contra determinado antígeno, sem que 
isso necessariamente represente um desfecho clínico desfavorável, deve ser 
definido como um valor de MFI superior ao do soro-controle negativo acrescido de 
três desvios-padrão (em torno de 300 a 500 MFI). Para predizer prova cruzada 
positiva (testes que estão mais classicamente associado ao risco de rejeição 
aguda) os valores de MFI devem ser tão altos como >5.000 para prova cruzada por 
citometria de fluxo ou >10.000 paraCDC3. No nosso serviço, baseado em estudo 
retrospectivo realizado com soros de doadores no período de 2001 a 2006 (antes 
da utilização da tecnologia de Luminex), observou-se uma correlação positiva do 
ponto de corte de 1.500 MFI com rejeição aguda, menor sobrevida do enxerto em 
05 anos e menor clearance de creatinina ao final do primeiro mês, primeiro ano e 
 
quinto ano pós transplante, sendo portanto adotado como referência na nossa 
prática e em conformidade com o “cut-off” ideal em outras referências da literatura, 
que gira em torno de 1.500-3.000 MFI2,3,8. 
 
 
 
 
• Prova Cruzada 
As provas cruzadas são consideradas o exame final para determinar o risco de 
rejeição aguda do transplante, entretanto é menos sensível de uma forma geral que 
os testes de fase sólida. O CDC é o teste historicamente mais utilizado e mais bem 
estabelecido como risco de rejeição hiperaguda, sendo contraindicação ao 
transplante quando positivo. Nesse teste os linfócitos do doador e o soro do 
receptor são misturados junto com complemento, levando a lise celular e sendo 
utilizado um corante vital para marcar as células mortas. Através da comparação 
com um controle negativo é dado o resultado do teste. Erros operacionais na 
execução e interpretação do teste podem ocorrer, sendo importante a expertise do 
laboratório. A análise do soro contra os linfócitos T pode avaliar a presença de 
anticorpo anti-HLA I. O testes CDC contra linfócitos B avalia a presença tanto de 
anticorpos HLA-I quanto HLA II. Entretanto, o enriquecimento do material biológico 
com células B é tecnicamente um pouco mais difícil. Esse teste também não é 
capaz de detectar anticorpos que não são capazes de se ligar ao complemento ou 
tem baixa afinidade. No CDC contra linfócitos T existe a possibilidade da adição de 
uma etapa de mistura de anticorpos capazes de ligar complemento contra 
anticorpos humanos (CDC-AGH) aumentando a sensibilidade do exame. 
A citometria de fluxo tem uma sensibilidade maior de detectar anticorpos contra 
antígenos HLA I e II do que o CDC e também diminui a subjetividade e a 
variabilidade interobservador associada ao método, todavia a sua associação com 
a rejeição hiperaguda está menos estabelecida do que o CDC e as sociedades de 
transplante de uma forma geral não obrigam a utilização deste método como prova 
cruzada de escolha. A maioria dos serviços optam pela citometria de fluxo junto 
 
com os testes de fase sólida, a fim de realizar uma avaliação mais apurada do risco 
imunológico do transplante2,3,5,8. 
 
• Estratificação de risco 
Como citado anteriormente, a estratificação de risco do transplante é o produto 
tanto da interpretação do resultado dos testes imunológicos como da história clínica 
de sensibilização do receptor. Assim, por exemplo, um DSA positivo em um 
paciente sem história prévia de sensibilização e com prova cruzada negativa deve 
ser analisado com muita cautela e ponderando o contexto clínico do paciente e o 
perfil do serviço. 
Além disso, para a adequada interpretação desses testes é fundamental a ampla 
comunicação entre o laboratório de imunogenética e a equipe clínica, afim de tentar 
desvendar possíveis falso positivos ou falso negativos. Algumas das possíveis 
armadilhas nesse contexto são: 
 
- Anticorpo contra HLA desnaturado: erros na confecção das moléculas de HLA em 
superfície sólida podem acabar levando a desnaturação da molécula e 
consequentemente exposição de epítopos que não seriam apresentados na 
molécula in natura, consequentemente podendo levar a resultado de um Anti-HLA 
falso positivo. Uma forma de detectar esse fenômeno é tratar as “beads” com ácido, 
que levará a desnaturação de todo o HLA e se o resultado mantiver positivo é 
indicativo da presença deste erro laboratorial. 
 
- Ligação não específica de anticorpos contra linfócitos do doador por substâncias 
presentes no soro do receptor, como por exemplo nos casos de tratamento recente 
com anticorpo monoclonal anti-CD20 (rituximab) pode levar a resultado falso 
positivo na citometria de fluxo. O pré-tratamento dos linfócitos do doador com a 
enzima pronase ajuda a remover este efeito2,9. Há relato na literatura da influência 
do uso do Rituximab no resultado de prova cruzada até 06 meses. 
 
 
- Presença de prova cruzada positiva devido a auto-anticorpo. Essa situação pode 
ser testada com a realização de uma auto-prova cruzada, ou seja, realização de 
uma citometria de fluxo com soro e linfócitos do próprio receptor. A experiência de 
um grande centro especializado em transplante tem demonstrado resultados que 
levam a crer que a presença de citometria de fluxo positiva devido a auto-anticorpo 
apresenta desfecho semelhante à prova cruzada negativa2. 
 
- Efeito “prozona”: a presença de intensa quantidade de anticorpos pode acabar 
saturando as “beads” ou ativar o complemento presente no próprio soro do paciente 
e levar a um paradoxal efeito de MFI baixa. Existem várias técnicas de detectar 
esse erro como, por exemplo, a diluição do soro do receptor até 1:8, ou realizando 
pré-tratamento do soro que seja capaz de inativar o complemento (aquecimento do 
soro, EDTA ou DTT são os mais utilizados). A presença do efeito “prozona” 
contraindica o transplante devido a alta probabilidade de rejeição aguda. 
 
-Tipificação HLA incompleta da dupla doador x receptor. Como mencionado 
anteriormente, idealmente, a tipificação HLA deve contemplar os loci A, B, C, 
DRB1,3,4,5, DQB1, DQA; DPB1 e DPA2,3, embora na nossa realidade quase nunca 
essa tipificação completa é feita e, por conta disso, uma prova cruzada pode vir 
inesperadamente positiva, pela presença de DSA contra um antígeno HLA não 
tipificado inicialmente, principalmente em pacientes hipersensibilizados. 
 
Pacientes hipersensibilizados (PRA > 80%), portanto, devem ter alta suspeição 
para o risco de rejeição aguda, sendo preconizado sempre a comunicação entres 
as equipes clínica e do laboratório de imunogenética, afim de se evitar falsos 
negativos e melhor apurar o resultado dos exames. 
Além disso, algumas situações ainda possuem risco de rejeição aguda incerto 
como, por exemplo, a presença de DSA em soro histórico. O paciente candidato a 
transplante deve ser submetido periodicamente aos testes imunológicos, e em 
soros anteriores (ou soro histórico), o paciente pode apresentar anticorpo contra o 
doador, mesmo este não estando mais presente no momento do transplante e a 
 
prova cruzada estando negativa. O real valor deste resultado ainda é desconhecido, 
entretanto muitos serviços optam por não realizar o transplante nesses casos. 
Outra situação com risco imunológico incerto é quando o paciente apresenta DSA 
positivo, entretanto, com prova cruzada negativa. Embora todo DSA deva ser 
evitado, a presença da prova cruzada negativa pode indicar que esse anticorpo não 
apresenta relevância clínica e, excepcionalmente, pode ser indicado transplante. 
Nesses casos, está indicado monitoramento do anticorpo no pós-transplante. 
Quando acontece o inverso e a prova cruzada é positiva na ausência de DSA, 
mesmo com tipificação HLA completa, isto pode indicar a presença de auto-
anticorpos ou direcionados a antígenos não HLA. A significância clínica da 
presença desses anticorpos também precisa ser melhor estudada. 
 
 
• Abordagem prática 
Na prática, o uso racional dos testes imunológicos e das diversas técnicas passa 
pela análise da história de sensibilização, do tipo de doador (vivo x falecido), do 
contexto clínico e do perfil de cada serviço, além da comunicação entre o corpo 
clínico do hospital e o laboratório de imunogenética. No nosso serviço por ter um 
perfil de transplantes com baixo riscoimunológico, preconizamos a realização da 
prova cruzada por citometria de fluxo e do teste de fase sólida com tecnologia 
luminex (crossmatch virtual), com ponto de corte de 1.500 de MFI para todas as 
duplas intervivos. Nos casos de transplantes doador falecido, fazemos CDC AGH 
e o crossmatch virtual para todos os casos. Particular atenção deve ser dada aos 
pacientes sensibilizados (PRA > 50%) ou hipersensibilizados (PRA > 80%), e em 
caso de dúvidas é discutido caso entre equipe clínica e laboratório de 
imunigenética. 
 
 
Referências: 
 
 
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