4 cromatografia em coluna atualizada

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Análise Instrumental 		Cromatografia Em Coluna Clássica		Prof. Marcelo Maia
Cromatografia em Coluna
CLS
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1 – Introdução
Usa-se uma coluna recheada com um sólido (fase estacionária) e uma fase móvel líquida. Empiricamente esta cromatografia em coluna (adsorção) pode ser escolhida porque é tecnicamente mais simples, não exigindo instrumentação avançada. Dependendo do tamanho da coluna usada, é facilmente, aplicada para fins preparativos, devendo se monitorizada, principalmente, por cromatografia em camada delgada.
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2 – Coluna
A coluna cromatográfica é constituída por um tubo de vidro, em posição vertical. 
As dimensões da coluna dependerão da quantidade de material a ser cromatografado, podendo-se usar até uma bureta como coluna.
Na parte superior da coluna se adapta um recipiente como reservatório da fase móvel e abaixo da torneira se colocam recipientes ou frascos do eluente, cujas dimensões dependem do volume de cada fração a ser coletada.
A fase que fica no interior da coluna (adsorvente) é suportada, na parte inferior, por um chumaço de lã de vidro ou algodão.
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Eluente
Reservatório
Coluna de vidro
Suspensão
Algodão
Frasco coletor
Amostra
Suspensão
Eluente
Eluente
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Coluna Preparativa
Separação de 1 Kg de amostra
Volume de eluente: 300 L
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3 – Preparação dos adsorventes
Para a preparação dos adsorventes (sílica gel, alumina, silicato de magnésio, carvão ativo), eles são aquecidos para dessorção de água e de outros materiais adsorvidos.
Para alumina, uma ótima temperatura para ativação é aproximadamente 400°C durante 4 horas; um período de aquecimento mais prolongado poderá causar a perda de atividade. Para os outros sólidos, um aquecimento ao redor de 200°C durante duas horas é suficiente.
A alumina com atividade grau I é a mais usada em cromatografia em coluna e é a mais ativa. Aquela de grau II tem 2-3 % de água, a de grau III tem 5-7 %, de grau IV tem 9-11 % e a de grau V tem 15 %, menos ativa. 
A cromatografia em coluna tem a desvantagem de produzir cauda (efeito de difusão) e, além disso, não apresenta separações totalmente reprodutíveis em virtude do adsorvente de mesmo lote poder ter suas atividades variadas. A reprodutibilidade pode ser aumentada usando um tamanho de partícula adequado; por exemplo, não se usaria um tamanho tão pequeno que impediria o fluxo da fase móvel. A quantidade de adsorvente a ser usada varia de acordo com a adsorbilidade do material; a proporção mínima de adsorvente/subatância é de 25:1.
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4 – Os processos de adsorção em coluna
Para se conhecer a natureza do processo de adsorção deve-se considerar a atividade do adsorvente, que traduz a força de adsorção. As substâncias eluirão na coluna segundo a sua polaridade. 
A atividade cromatográfica do sólido (fase estacionária), tendo grupos polares, aumenta sobre substâncias polares, observando-se a ordem:
-CO2H > -OH > -NH2 > -SH > -CHO > C=O > -CO2R > -OCH3 > -CH=CH-
Deve-se evitar que o movimento da substância adsorvida na coluna seja lento e que a banda se torne larga com baixa concentração e com tendência a se envolver com outras bandas.
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5 – Escolha de eluentes
A função das fases móveis tem sentido amplo:
Realizar sua função de solvente, considerando a solubilidade dos componentes da mistura;
Ter baixo ponto de ebulição (35 – 85°C);
Realizar a dessorção dos componentes da mistura durante a eluição.
A escolha do eluente se dá por cromatografia em camada delgada. Depois de se escolher o adsorvente, os eluentes são selecionados de acordo com seu poder de eluição: num aumento da habilidade de dessorver do adsorvente as substâncias (adsorvato) fixadas no mesmo. 
A dessorção é facilitada quando se usa um eluente polar e dificultada pelo uso daquele de polaridade menor; isto é, um adsorvato estará mais fixado no adsorvente quando o eluente em uso é pouco polar. Porém o deslocamento do adsorvato é lento.
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Série Eluotrópica 
(por ordem crescente de polaridade e de ponto de ebulição baixo)
				Hexano
				Éter de petróleo
				Ciclohexano
				Tetracloreto de carbono
				Benzeno
				Tolueno
				Diclorometano
				Clorofórmio
				Éter etílico
				Acetato de etila
				Piridina
				Acetona
				Etanol
				Metanol
				Ácido acético
A vazão do eluente pode ser aproximadamente de uma gota por segundo. Não se deve aumentar muito a polaridade do eluente para se evitar a sobreposição de bandas.
Polaridade e PE
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6 – Enchimento da coluna
Quanto mais uniforme for o enchimento da coluna, maior será a sua eficiência. Durante o enchimento o ar pode ficar retido entre as partículas, o que não é conveniente, pois formaria canais na coluna que alargariam as abandas em eluição. para se evitar a retenção de ar o adsorvente deve ser agitado num frasco, com a fase móvel, até a constituição de uma pasta, a qual será então colocada dentro da coluna, já contendo 1/3 da fase móvel, acompanhada com vibração, deixando o material assentar gradualmente.
Deve-se evitar deixar a coluna secar durante o enchimento ou durante a eluição, porque aparecem rachaduras na coluna, prejudicando a separação.
Uma vez montada a coluna cromatográfica, a amostra deve ser colocada no topo da mesma. Isto é feito colocando ou amostra sólida solubilizada num volume mínimo de solvente, ou amostra líquida, ou extrato, por meio de pipeta, na superfície do adsorvente. 
As amostras tanto sólida ou líquida podem ser misturadas com o adsorvente e, após evaporar o solvente, a mistura é colocada no topo da coluna. O eluente deve estar ultrapassando aquela superfície, formando uma camada de 2-3 cm de espessura. Após toda amostra ter sido colocada é adicionada a fase móvel, cuidadosamente, até que se forme uma coluna líquida incolor e límpida acima do nível superior da amostra. Para manter esta superfície da amostra uniforme, é conveniente colocar, antes de adicionar a primeira fase móvel, uma camada do recheio (1 a 2 cm de espessura) sobre ela para evitar anormalidades quando da adição das fases móveis.
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7 – Eluição
Uma coluna cromatográfica pode ser fixada em qualquer posição no espaço, porém a mais conveniente é fixá-la em posição vertical. Assim a eluição se processará por ação da gravidade, não sendo necessário o uso de pressão, como em outras posições. É comum observar nas bandas cromatográficas uma parte frontal e uma cauda, quanto maior a distância percorrida pelo material eluído, num determinado estágio de sua passagem descendente.
Parte frontal
Cauda
Banda Ideal
Cauda difusa
e longa
Banda não desejada
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A fase móvel, quando está passando através do adsorvente na coluna, arrasta consigo os componentes da amostra que está sendo cromatografada. A velocidade de movimento descendente de um componente depende de sua adsorção pela fase estacionária, isto é, quanto mais fracamente o componente for adsorvido mais rápida é a sua passagem
pela coluna, e vice-versa. Conclui-se, portanto, que quanto maior a diferença entre os coeficientes de adsorção, mais completa será a separação do composto (terá maior grau de pureza). Esta separação dos componentes de uma mistura é devido às diferenças nas forças de adsorção entre eles e o adsorvente.
Para ocorrer uma completa separação, a fase móvel deve:
 Ser fracamente adsorvida pela fase estacionária;
 Não ser afetada quimicamente;
 Possibilitar realmente o desenvolvimento de uma corrida cromatográfica, ocasionado por um determinado grau de adsorção.
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8 – Reações na coluna
Os sólidos usados nas colunas cromatográficas às vezes tornam-se catalisadores de reações. Este problema é maior com a alumina do que com a sílica. Por exemplo, a alumina alcalina pode causar a condensação de aldeídos e cetonas; neste caso se usaria uma alumina neutra. A acetona não é usada como fase móvel quando se utiliza alumina. O carvão ativo pode levar à decomposição química, e a sílica pode causar a isomerização de terpenos e esteróides.
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9 – aplicações da cromatografia em coluna
São várias as áreas de pesquisa nas quais este tipo de cromatografia é utilizada, como por exemplo:
Em laboratórios que trabalham com compostos orgânicos, para a separação e purificação de reagentes e materiais obtidos por síntese;
Em laboratórios de produtos naturais, os quais são normalmente submetidos a estes métodos em escala analítica e preparativa;
Em laboratórios de análises clínicas para separar esteróides de urina ou de sangue.