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Unidade II
Unidade II
5 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
Vamos estudar as propriedades da cromatografia de camada delgada e os temas relacionados à 
separação das moléculas em fase estacionária polar (placa de sílica). Discutiremos, também, os fatores 
que interferem na análise por cromatografia de camada delgada, os itens necessários para a realização 
desse tipo de análise qualitativa e a aplicação dessa técnica.
5.1 Introdução à cromatografia
A cromatografia foi desenvolvida incialmente pelo botânico russo Mikhail Semenovich Tswett 
(1872-1919), quando ele produziu uma separação colorida de pigmentos vegetais usando etanol. 
O botânico observou que, ao aplicar etanol sobre um papel filtro, os compostos eram extraídos e 
podiam ser identificados por apresentarem diferentes colorações, dando assim o nome à técnica, que 
se origina do grego cromatografia: chroma (cor) + graphein (grafia).
Anos mais tarde, Martin e Synge fundamentaram o princípio da partição (solubilidade) como base 
de separação, além do conceito de adsorção, inicialmente proposto por Tswett.
 Observação
A cromatografia não é um método colorimétrico, ou seja, um método 
que se baseia na presença de compostos coloridos que, em geral, têm a 
capacidade de absorver a luz.
A cromatografia é uma técnica utilizada para separar os componentes de uma mistura, qualquer 
que seja o tipo de cromatografia, seja ela cromatografia de papel, cromatografia de camada 
delgada, cromatografia gasosa ou cromatografia líquida – todas se baseiam no mesmo princípio 
de funcionamento.
O método consiste na maior afinidade que um componente da mistura possa apresentar pela fase 
estacionária ou pela fase móvel. A fase estacionária pode ser representada por uma substância em seu 
estado sólido ou líquido, neste último caso, mantido em um suporte sólido. E a fase móvel pode ser 
uma substância no estado líquido ou gás. A fase móvel atravessará a fase estacionária e, de acordo 
com a polaridade dos componentes e o coeficiente de partição de cada um, ocorrerá a separação, em 
diferentes velocidades.
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MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
 Observação
A fase estacionária é aquela que está imobilizada sobre uma superfície 
ou uma coluna, enquanto a fase móvel se move através da fase estacionária, 
arrastando com ela, em diferentes velocidades, os componentes da mistura 
do analito.
Considerando que as misturas são constituídas por componentes com diferentes propriedades, estes 
interagem com a fase estacionária e a fase móvel de formas distintas, fazendo com que a mobilidade ou 
a adsorção das espécies ocorram de diversas maneiras e velocidades.
A cromatografia pode ser classificada quanto aos seguintes critérios:
• Forma física do sistema de cromatografia: a forma estacionária pode ser alocada em um tubo 
cilíndrico ou uma superfície planar, podendo ser a cromatografia de coluna ou planar.
• Estado físico da fase móvel: podendo ser cromatografia gasosa ou líquida.
• Estado físico da fase estacionária: podendo ser sólido ou líquido, a depender do tipo de cromatografia.
Podemos representar simplificadamente a classificação cromatográfica com base na figura a seguir:
Cromatografia
Planar
Coluna
Cromatografia 
de papel
Cromatografia de 
camada delgada
Cromatografia 
gasosa
Cromatografia 
líquida
Figura 45 – Representação esquemática dos diferentes tipos de cromatografia
Existem outras classificações que dependem da técnica, e a classificação mais importante em 
cromatografia baseia-se no mecanismo de separação, que envolve processos físicos, químicos ou 
mecânicos (COLLINS; BRAGA; BONATTO, 2006).
88
Unidade II
 Saiba mais
Em geral, as técnicas analíticas são utilizadas em conjunto, de forma 
que seus resultados sejam complementares. Para que você possa se 
familiarizar com os procedimentos analíticos, sugerimos a leitura do 
artigo a seguir. Nele, foram investigadas amostras analisadas pela Anvisa 
sob a suspeita de substituição fraudulenta do conteúdo real por amido 
de milho.
YANO, H. M. et al. Adulteração de matéria-prima de uso controlado, 
encontrada em farmácia de manipulação, pela autoridade sanitária. 
Boletim Epidemiológico Paulista (BEPA), v. 9, n. 101, p. 16-23, 2012. 
Disponível em: http://periodicos.ses.sp.bvs.br/scielo.php?script=sci_
arttext&pid=S1806-42722012000500002&lng=pt&nrm=iso&tlng=pt. 
Acesso em: 2 jul. 2020.
5.2 Cromatografia em papel
A cromatografia em papel (CP) é uma das técnicas cromatográficas mais simples, e ela será 
abordada para auxiliar na compreensão dos conceitos da técnica de uma maneira geral. A CP é 
uma técnica de separação de líquido-líquido, e baseia-se no princípio da partição, estando um dos 
líquidos fixado a um suporte sólido (tira de papel). O método consiste na diferença de solubilidade 
das substâncias contidas na amostra e no solvente – em geral, a água é um dos líquidos. O solvente 
é saturado em água, e a partição se dá devido à presença da celulose no papel de filtro (DEGANI; 
CASS; VIEIRA, 1998). Esse método, embora não apresente a mesma eficiência que a coluna de 
camada delgada, é também muito útil para a separação de compostos polares, sendo uma técnica 
muito empregada em bioquímica.
5.2.1 Como é feita a cromatografia em papel
Para a realização da cromatografia em papel, algumas etapas devem ser seguidas.
Etapa 1
No centro de uma tira de papel, faz-se uma marca da solução a ser analisada a uma distância de 
aproximadamente 1 cm de uma das extremidades. Esse ponto deve estar sinalizado como o ponto 
de partida.
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MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
1 cm
Indicar a 
distância final
Tira de papel
Figura 46 – Marcação inicial na folha de papel
Etapa 2
Mergulha-se a extremidade inferior do papel em uma mistura de solvente orgânico e água.
1 cm Mistura de solvente 
orgânico + água
Tira de papel
Figura 47 – Imersão do papel na mistura de solventes
Etapa 3
Cobre-se o recipiente de modo a garantir que não ocorra a perda de solvente para o meio externo.
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Unidade II
Vedação da cuba 
cromatográfica
Figura 48 – Vedação da cuba cromatográfica
Etapa 4
Após um tempo em repouso, o líquido irá ascender pela tira, arrastando os constituintes da amostra 
em diferentes velocidades, de acordo com o coeficiente de partição, entre a água adsorvida e o solvente 
orgânico. O conjunto deve permanecer em repouso durante alguns minutos para que ocorra a separação 
dos componentes da mistura.
1 cm
1
2
3
Mistura de solvente 
orgânico + água
Figura 49 
Etapa 5
Quando a marca do solvente se aproximar do ponto mais próximo ao topo, remove-se a tira e 
marca-se sobre ela o ponto mais afastado. Algumas manchas se encontrarão distribuídas ao longo da 
tira, devendo ser marcadas as distâncias dos pontos iniciais, podendo ou não ser visíveis a olho nu. 
Nesse caso, deve ser utilizado algum método para revelação, como lâmpada de UV-VIS.
91
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
Solvente
1 cm
1
2
3
Rf
Mistura de solvente 
orgânico + água
Figura 50 – Observação da corrida da marca do solvente
Etapa 6
Calcular o valor do fator de retenção (Rf) correspondente a cada componente. O fator de retenção 
(Rf) indica a relação entre a distância percorrida de um componente em relação à distância explorada 
pelo solvente; ele poderá ser determinado pela equação a seguir:
f
distância percorrida pelo componente
R
distância percorrida pela frente do solvente
=
O Rf é uma medida experimental, portanto, é de extrema importância que ele seja determinado nas 
mesmas condições, ou seja, no mesmo tempo e no mesmo papel.
 Observação
O valor de Rf pode ser compreendido como uma medida de afinidade 
entre o componente e o solvente.
Com base nas marcas obtidas no cromatograma, entende-se que a solução inicial é composta 
de, no mínimo, três diferentes componentes, e que esses componentes interagem de diferentes 
maneiras com o solvente utilizado, devido à diferença de velocidade de migração das espécies na 
tira de papel. Na figura anterior, podemos dizer que o composto 3 tem a maiorinteração com a fase 
móvel, e que o composto 1 tem menor interação com o solvente e, por outro lado, maior interação 
com a fase estacionária.
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Unidade II
Exemplo de aplicação
Exemplo
Na figura anterior, sabe-se que a distância máxima percorrida pelo solvente foi de 6 cm, e que o 
componente 1 migrou 2,3 cm. Qual o Rf para esse componente?
Resolução
f
distância percorrida pelo componente
R
distância percorrida pela frente do solvente
=
f
2,3
R
6,0
=
Rf = 0,38
5.2.2 Aplicação na área farmacêutica
Esse método é muito útil para separar substâncias muito polares, como açúcares e aminoácidos. 
O procedimento é utilizado, por exemplo, para a análise de peptídeos hidrolisados, na qual se utiliza 
como fase móvel uma mistura de butanol, ácido acético e água na proporção de 8:2:2, e uma solução 
reveladora de ninidrina em que a presença de manchas de cor púrpura revelará a migração do aminoácido 
presente na mistura, de acordo com o valor do fator de retenção (REMIÃO, 2003). Alguns desses valores 
estão indicados na tabela a seguir:
Tabela 6 – Valores de Rf para aminoácidos
Aminoácido Rf Aminoácido Rf
Ácido aspártico 0,24 Leucina 0,73
Ácido glutâmico 0,30 Lisina 0,14
Alanina 0,38 Metionina 0,55
Arginina 0,68 Prolina 0,43
Cisteína 0,07 Serina 0,27
Fenilalanina 0,68 Tirosina 0,45
Glicina 0,26 Treonina 0,35
Histidina 0,20 Triptofano 0,50
Fonte: Remião (2003, p. 141).
Exemplo de aplicação
Para a identificação da composição de um determinado peptídeo, foi realizado o procedimento 
descrito anteriormente. Suponha que tenham sido encontradas manchas púrpuras no papel, em 
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MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
diferentes posições. Após terem sido efetuados os cálculos, os valores de Rf foram 0,30; 0,45; 0,50; e 0,73. 
Quais os aminoácidos que deram origem ao peptídeo? Compare os valores obtidos experimentalmente 
com os valores de referência da tabela na sequência.
Tabela 7 – Resultados
Rf (obtido 
experimentalmente)
Nome do aminoácido 
 (encontrado na tabela anterior)
0,30 Ácido glutâmico
0,45 Tirosina
0,50 Triptofano
0,73 Leucina
5.3 Cromatografia em camada delgada
A cromatografia de camada delgada (CCD) ou camada fina é aplicada às separações que ocorrem 
entre a fase estacionária, que é um revestimento de um sólido de uma camada fina e uniforme de 
substância aderente, como sílica-gel ou alumina, a um suporte liso, podendo ser de vidro, metal ou 
plástico rígido. A fase móvel, por sua vez, pode ser um solvente puro, como água, álcool, ou uma mistura 
deles, ou outros, em diferentes proporções.
O processo de separação depende, principalmente, de fenômenos como adsorção, mas pode também 
depender de fenômenos como partição, troca iônica ou permeação. A técnica é semelhante à cromatografia 
em papel, com a diferença que na CCD existe a necessidade do prévio preparo da placa. De maneira 
geral, como é uma técnica rápida e com maior reprodutibilidade, é largamente utilizada não somente 
para a separação de mistura, como para identificação de substâncias, testes de pureza etc. Outra grande 
vantagem no uso da técnica está no baixo custo, quando comparada, por exemplo, à cromatografia líquida 
de alta eficiência ou à cromatografia gasosa. Por essas razões, é uma técnica utilizada em muitos estudos 
nas áreas farmacêuticas, bioquímicas e biológicas, tanto em laboratórios de pesquisa quanto em indústrias, 
o que justifica a importância dessa técnica de compreensão relativamente simples.
5.4 Características das fases móvel e estacionária
5.4.1 Fase móvel
A fase móvel deve ser escolhida de forma criteriosa, pois dessa escolha depende o sucesso da 
separação dos componentes da mistura. Ela pode ser constituída por um solvente puro ou uma mistura 
de solventes a partir do estudo da polaridade de seus constituintes e suas possíveis interações com os 
compostos que possam estar presentes no analito.
A capacidade de eluição do solvente está entre os fatores mais importantes que determinam a retenção 
dos solutos. Solventes com pouco poder de eluição são incapazes de mover os solutos, enquanto aqueles 
que são muito fortes empurram os compostos, junto com a frente da fase móvel. Isso significa dizer que as 
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Unidade II
fases móveis fracas não podem afetar significativamente as interações intermoleculares entre as moléculas 
de soluto e a fase estacionária; enquanto as fases fortes enfraquecem esses tipos de interação.
A força de eluição do hidrocarboneto alifático líquido mais simples, n-pentano, é igual a zero, e esse 
solvente em particular inicia o que é chamado de série eluotrópica. Os valores numéricos da força 
de eluição do solvente ε determinados para os eluentes cromatográficos mais comuns em alumina e 
sílica-gel estão indicados na tabela a seguir. O conceito de força de eluição do solvente ε é uma maneira 
de quantificar a polaridade do solvente.
Tabela 8 – Série eluotrópica de solventes e os valores 
empíricos da resistência à eluição de solventes
Solvente εalumina εsílica-gel
n-Pentano
n-Hexano
n-Heptano
Ciclo-hexano
Dissulfeto de carbono
Tetracloreto de carbono
Éter isopropílico
2-Cloropropano
Tolueno
Cloropropano
Clorobenzeno
Benzeno
Bromoetano
Éter dietílico
Clorofórmio
Diclorometano
1,2-Dicloroetano
Etilmetilcetona
Acetona
Dioxano
Acetato de etila
Acetato de metila
1-Pentanol
Dimetilsulfóxido
Anilina
Nitrometano
Acetonitrila
Piridina
2-Propanol
Etanol
Metanol
Etilenoglicol
Ácido acético
0,00
0,01
0,01
0,04
0,15
0,18
0,28
0,29
0,29
0,30
0,30
0,32
0,37
0,38
0,40
0,42
0,49
0,51
0,56
0,56
0,58
0,60
0,61
0,62
0,62
0,64
0,65
0,71
0,82
0,88
0,95
1,11
>> 1
0,00
0,01
0,01
0,03
0,11
0,13
0,20
0,20
0,20
0,21
0,21
0,22
0,26
0,27
0,28
0,29
0,34
0,36
0,39
0,39
0,41
0,42
0,43
0,43
0,43
0,45
0,46
0,50
0,57
0,62
0,67
0,78
>> 0,70
Fonte: Kowalska, Kaczmarski e Prus (2003, p. 29-30).
95
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
 Lembrete
A polaridade do solvente é um fator muito importante na escolha da 
fase móvel.
5.4.2 Fase estacionária
A fase estacionária é caracterizada essencialmente pela característica do material adsorvente. 
Alguns dos materiais mais utilizados serão apresentados a seguir:
• Sílica-gel (SiO2): é um material altamente poroso e apresenta caráter fracamente ácido. 
Sua separação ocorre por adsorção. Ela é utilizada em separação de compostos lipofílicos, tais 
como: aldeídos, cetonas, fenóis, ácidos graxos e aminoácidos. É o adsorvente mais usado 
nos laboratórios.
• Alumina (Al2O3): apresenta características predominantemente alcalinas, podendo ser preparada 
para exibir características neutras ou ácidas. Sua separação ocorre por adsorção. Ela é utilizada 
em separação de compostos lipofílicos, e demonstra bom desempenho na separação de 
hidrocarbonetos policíclicos, alcaloides, aminas e vitaminas lipossolúveis.
• Terra diatomácea: apresenta característica neutra e sua separação ocorre por partição. 
Comumente ela é utilizada em conjunto com a sílica-gel para diminuir seu poder adsorvente.
• Celulose: a separação ocorre por partição ou troca iônica. Ela é empregada na separação de 
ácidos carboxílicos, aminoácidos, carboidratos, cátions inorgânicos e fosfatos. Os diferentes tipos 
de celulose e suas combinações permitem sua utilização para a separação de nucleotídeos e 
nucleosídeos, de proteínas e ácidos nucleicos.
• Poliamida: a separação do soluto ocorre pela competição, por meio de ligações de hidrogênio entre 
a fase móvel e a fase estacionária. Ela é utilizada na separação de fenóis e de ácidos carboxílicos. 
Apresenta como desvantagem a baixa aderência às placas de vidro, quando comparada a outros 
tipos de adsorventes.
5.5 Instrumentação básica
Para a realização da cromatografia de coluna delgada, serão necessários, basicamente, os componentes 
descritos a seguir:
96
Unidade II
A)
C)
B)
D)
Figura 51 – Materiais necessários para a realização da CCD: A) placa; B) cuba de vidro; 
C) pulverizador acoplado ao erlenmeyer e à bomba de vácuo; e D) aplicador de amostras
A seguir, faremos o detalhamento da técnica e comodeverá ser feito o uso dos componentes 
tratados anteriormente.
5.6 Técnica de separação
Como é feita a separação dos componentes de uma mistura na cromatografia de camada delgada?
O método conhecido como cromatografia ascendente é o método mais comum. Iniciando-se a 
metodologia, com a fase móvel e estacionária, constituída por solventes e adsorventes puros, caso os 
resultados não sejam satisfatórios, começam a ser testados e modificados em cada uma das fases.
97
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
A fase móvel deverá cobrir o fundo da cuba, de forma a ficar abaixo das marcas do analito que 
serão representadas logo em seguida. As placas têm de ser colocadas inclinadas e apoiadas no fundo, 
tomando o cuidado de deixar as placas com uma determinada distância entre elas, para que não seja 
possível a fase móvel subir entre elas, por ação da capilaridade. Assim que a fase móvel atingir a parte 
superior das placas, elas poderão ser retiradas e secas, podendo secar ao ar livre, devendo-se, então, 
proceder com as devidas marcações.
A separação é possível porque durante o processo a fase móvel sofre evaporação da camada de líquido 
e da superfície da placa, e, de forma concomitante, ocorre o processo de condensação. Esses processos 
devem ser reprodutíveis, por essa razão, a cuba deve estar perfeitamente vedada, para que ela esteja 
saturada com o vapor da fase móvel em toda a extensão, como representado a seguir:
Papel filtro
(opcional)
Fase 
estacionária
E: evaporação
C: condensaçãoFase móvel
E
E
C
Placa 
suporte
Fase móvel
Figura 52 – Representação de equilíbrio entre os componentes gasosos e líquidos 
da fase móvel em uma câmara cromatográfica com vapor saturado 
Durante o desenvolvimento, as moléculas se movem continuamente para frente e para trás, entre os 
estados livres e absorvidos O equilíbrio das forças intermoleculares determina a posição de equilíbrio e, 
portanto, a capacidade de o solvente mover o soluto para cima da placa.
Vista frontalVista lateral
Fase 
estacionária
Fase móvel
A) B)
Fl
ux
o 
da
 fa
se
 m
óv
el
Figura 53 – Diagrama representativo: A) mistura de A e B adsorvida na 
fase estacionária e livre na fase móvel e B) princípio da separação 
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Unidade II
O equilíbrio entre as fases depende de fatores como a polaridade do material do revestimento da 
placa, a polaridade do solvente e a polaridade das moléculas presentes na amostra. Por exemplo, em 
uma amostra constituída de dois compostos A e B, como ilustrado na figura anterior, podemos ter 
duas situações:
• Se as moléculas A passarem mais tempo na fase móvel, elas serão transportadas mais facilmente 
pela fase estacionária e irão avançar mais em um determinado tempo.
• Quando as moléculas B são absorvidas na fase móvel por mais tempo do que as moléculas A, as 
moléculas B passam menos tempo na fase móvel e, portanto, movem-se mais lentamente pela 
fase estacionária, não irão se mover para tão distante, no mesmo período.
Diante disso, a consequência é que as moléculas A serão gradualmente separadas das moléculas B, à 
medida que a fase móvel flui, de forma ascendente, na placa. Na cromatografia descendente, a fase 
móvel possui um fluxo voltado para baixo e conta com a ação da gravidade. Existem também os métodos 
horizontais, circulares e bidimensionais – semelhantes à cromatografia em papel –, que podem ser 
empregados, embora sejam utilizados com menor frequência.
 Lembrete
A cromatografia de camada delgada (CCD) pode também ser chamada 
de camada fina.
O emprego da CCD envolve algumas etapas fundamentais, apresentadas e detalhadas na sequência: 
Preparação da placa
Seleção da fase móvel
Aplicação das amostras
Revelação do cromatograma
Registro do cromatograma
Análise do cromatograma
Figura 54 – Etapas para a realização da técnica da cromatografia de camada delgada
5.6.1 Preparação da placa
Existem alguns cuidados a serem tomados antes da utilização da placa cromatográfica, podendo ser 
por métodos manuais ou espalhadores. Veja quais são:
99
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
• Limpeza: inicialmente, deverá ser feita a limpeza da placa com detergente, com o objetivo de 
eliminar possíveis traços de gordura que possam estar presentes na superfície do vidro.
• Superfície uniforme: garantir que a suspensão com o material adsorvente foi distribuída 
uniformemente pela superfície da placa, podendo ser com o uso de um aplicador ou com bastão 
de vidro. Após a aplicação, a placa deverá secar ao ar livre em posição horizontal, evitando-se, 
assim, que o material escorra para as extremidades. Em trabalhos analíticos, as placas podem ser 
preparadas pelo uso de espalhadores comerciais, que garantem maior uniformidade nas placas.
• Imersão em solvente orgânico: quando se deseja preparar placas de pequena dimensão, ocorre 
a imersão da placa em uma suspensão do adsorvente mantido em um frasco de boca larga. Nesse 
caso, a suspensão é preparada em um solvente orgânico. O solvente evapora em seguida, e a 
camada de adsorvente é exposta ao vapor de água, obtendo-se camadas mais finas e uniformes 
do adsorvente. É preciso deixar secar em temperatura ambiente.
• Ativação da placa: muitos exemplos de separação podem ser feitos sem a ativação das placas, 
mas, para algumas delas, existe a necessidade de passar por esse processo, que pode ser, por 
exemplo, com a exposição da placa à alta temperatura, dependendo do tipo de adsorvente.
Outros procedimentos garantem bons resultados para o momento da utilização da placa, conforme 
indicado na figura seguir:
(1
) F
az
er
 o
s r
isc
os
 g
ui
a
(3) Marcar amostras (4) Marcar solução padrão
(2
) I
nd
ic
ar
 o
 in
íc
io
 e
 o
 fi
m
 d
a 
co
rr
id
aFim
Início
Figura 55 – Esquema representativo para preparação de placas da CCD 
Para melhor interpretar a figura anterior, siga as seguintes indicações:
• Marcar a placa, delimitando o início e o fim da cromatografia. Atente-se à marca do 
fim, pois pode não coincidir com a distância percorrida pelo solvente, essa medida será 
determinada experimentalmente.
• Fazer riscas verticais na placa favorece identificar o caminho percorrido pela amostra.
100
Unidade II
• Incluir uma coluna para a adição de uma solução-padrão. Esse procedimento favorece a 
comparação quando a solução em estudo já é conhecida.
• Fazer a marcação com as soluções analíticas, identificando-as.
5.6.2 Seleção da fase móvel
O sucesso da separação por essa técnica depende, em grande parte, da escolha da fase móvel, pois 
existe uma competição entre as moléculas da fase móvel e da amostra pela superfície do adsorvente, 
devendo-se considerar, principalmente, a natureza química das espécies envolvidas no processo de 
separação e a polaridade da fase móvel.
A fase móvel pode ser um solvente puro ou uma mistura de solventes, uma vez que se sabe que 
pequenas variações na proporção de solventes provocam significativas alterações nas distâncias 
percorridas pelas substâncias em análise. 
Essa verificação pode ser feita facilmente, gotejando, com o auxílio de uma micropipeta, volumes 
iguais de diferentes solventes sobre as marcas das amostras de um determinado analito, observando-se, 
assim, diferentes afinidades entre o analito e o solvente analisado, podendo sugerir quais misturas serão 
mais favoráveis.
5.6.3 Revelação do cromatograma
Como sabemos, não são todas as substâncias que apresentam colorações visíveis, então, como proceder 
no caso de as substâncias de interesse analítico serem incolores? Para isso, é necessário proceder à fase 
da revelação do cromatograma utilizando recursos complementares, que podem ser de diferentes tipos.
Uso da fluorescência 
A fase estacionária em uma placa de camada fina geralmente possui uma substância adicionada, que 
é fluorescente quando exposta à luz UV-VIS. Isso significa que, ao ser submetido à luz, o cromatograma 
brilhará na posição correspondente aos pontos em que estão no cromatograma, mesmo que esses 
pontos sejam invisíveis aos olhos. Enquanto o UV aindabrilhar na placa, é necessário marcar as posições 
dos pontos, pois assim que a fonte de UV for desligada os pontos não serão visíveis novamente.
Veja a seguir um cromatograma revelado após excitação com a luz UV:
101
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
Figura 56 – Revelação de placa de CCD com uso de fonte de lâmpada UV 
Processo químico 
Em alguns casos, pode ser possível tornar as manchas visíveis reagindo-as com alguma substância 
que produza certo produto colorido. Um exemplo comum em compostos orgânicos é a exposição da 
placa a vapores de iodo. Frequentemente esse processo resulta em manchas na cor marrom-escura. 
A vantagem de utilizar iodo, se comparado a outros reagentes, é que, ao aquecer, ele se desprende 
facilmente da placa, exceto quando em presença de compostos insaturados, pois, dependendo das 
condições, o iodo pode se ligar à instauração (dupla-ligação). 
A figura a seguir apresenta um exemplo de cromatograma em que as manchas foram reveladas após 
contato com iodo.
EMEEME
Onde:
EME = franção extrato metanólico
EET = fração extrato etanólico
N = solução padrão nerol
G = solução padrão geraniol
EETEET NN GG
Figura 57 – Cromatograma em diferentes extratos metanoico e etanoico em presença de solução-padrão de cerol e gerânio
102
Unidade II
No esquema representativo do cromatograma, as bandas em verde-escuro, verde-claro e amarelo 
correspondem às bandas visíveis à luz natural; e as bandas coradas de laranja correspondem às bandas 
visíveis após o uso do iodo como revelador (MOREIRA et al. 2008).
Reveladores biológicos
Podem-se também empregar reveladores enzimáticos, dos quais utilizam-se as reações enzimáticas 
ou bacterianas para tornar as manchas visíveis. 
As soluções reveladoras podem ser aplicadas com o uso de pulverizados acoplados no erlenmeyer 
e em uma bomba a vácuo, conforme apresentado anteriormente. Dessa forma, a solução pode ser 
aplicada em pequenas quantidades e por toda a extensão da placa.
5.6.4 Registro do cromatograma
Os resultados obtidos por CCD podem ser registrados por meio de desenhos em papéis especiais, 
por registro fotográfico ou quando as manchas permanecerem um tempo maior, depois que estiverem 
secas, por fotocópia ou escaneamento simples da imagem.
Pela reação com reativos especiais, como propionato de polivilina, é possível retirar a camada de 
adsorvente na forma de uma película, que foi utilizada como suporte da mancha. Essa metodologia é 
útil para análises quantitativas.
5.6.5 Análise do cromatograma
O cromatograma poderá ser utilizado: como método qualitativo de análise, comparando com 
substâncias-padrão e determinando a presença daquela substância na mistura; ou como método 
quantitativo, em que se determina a quantidade de substância presente na amostra por técnicas como 
a densitometria.
5.7 Relação entre a estrutura molecular e a separação na cromatografia de 
camada delgada (CCD)
Como ocorrem os processos de separação em CCD? As interações entre a fase estacionária e o 
analito dependem, e muito, de propriedades estruturais e físicas. Vejamos a seguir um exemplo da fase 
estacionária constituída pela sílica-gel. 
Os átomos de silício são unidos aos átomos de oxigênio por meio de ligações covalentes em uma 
macroestrutura. No entanto, na extremidade da sílica-gel, os átomos de silício estão ligados aos grupos 
hidroxilas (1) – OH. Dessa forma, você terá sítios disponíveis do tipo (2) Si – O – H, em vez de sítios (3) 
Si – O – Si, como pode ser observado:
103
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
OH
Si
Si
Si
Si
Si
SiSi
1
2
3
O
O
O
O
O
OO
O
O
O
O
OH
OH
HO
HO OH
SiO2
Figura 58 – Estrutura molecular da sílica-gel
A extremidade da sílica-gel é muito polar, e os grupos – OH estão presentes, o que favorece a 
formação de ligações de hidrogênio com compostos vizinhos, além das interações do tipo dipolo-dipolo 
e forças de dispersão (dipolo-dipolo induzido), que podem ocorrer dependendo da molécula vizinha. 
Então, podemos supor que compostos polares, que apresentam facilidade em realizar interações com os 
grupos hidroxilas, terão maior afinidade com a fase estacionária, composta da sílica-gel (ou alumina), e 
terão maior tempo de retenção, percorrendo menor distância na placa, representando assim um menor 
fator de retenção (Rf). Os grupos apolares, que terão menor afinidade com a fase estacionária, terão 
menor tempo de retenção e, por consequência, percorrerão maior distância na placa, representando um 
fator de retenção (Rf) maior.
Exemplo de aplicação
Segundo César et al. (2007), genisteína, daidzeína e gliciteína são as agliconas mais abundantes nos 
extratos de soja, ocorrendo também como glicosídeos. Suas estruturas químicas estão indicadas a seguir:
HOHOB)B)
OHOH
OO
OOHOHOA)A)
OHOH
OOOHOH
OO
HOHOC)C)
OHOH
OO
OO
OO
Figura 59 – Representação das estruturas moleculares: A) genisteína (GE); B) daidzeína (DA); C) gliciteína (GL) 
104
Unidade II
O estudo foi realizado em amostras que passaram pelo processo de hidrólise. O cromatograma da 
figura a seguir mostra o resultado comparativo entre amostras sem hidrólise e amostras hidrolisadas, 
em que a fase móvel foi preparada em uma solução de acetato de etila e clorofórmio na proporção de 
70:30 em uma placa de sílica-gel.
Considere:
MP1, MP2 e MP3: diferentes amostras analisadas.
Padrões adicionados: genisteína (GE); daidzeína (DA); gliciteína (Gl).
Rf
0,00
MP1 MP1MP2 MP2MP3 MP3
0,59
0,49
0,43
GE
DA
GL
Amostras sem hidrólise Padrões Amostras hidrolisadas
Figura 60 – Representação esquemática dos cromatogramas e valores de Rf de padrões de 
isoflavonas e amostras de extratos secos, antes e após hidrólise, obtidos por CCD em 
sílica-gel em eluente contendo acetato de etila e clorofórmio (70:30)
Após a análise e a interpretação do cromatograma, responda:
Exemplo 1
De acordo com o que foi estudado, qual análise do cromatograma pode ser sugerida? 
Resolução
Conforme o cromatograma, foi possível observar que, nas diferentes amostras analisadas antes da 
hidrólise, foram identificados os padrões genisteína (GE) e daidzeína (DA) percorrendo a mesma distância 
na placa que as soluções-padrão utilizadas. Por outro lado, após as amostras terem sido hidrolisadas, foi 
observado no mesmo cromatograma que, para a amostra MP3, a gliciteína (Gl) foi identificada.
Exemplo 2
Qual a sua sugestão para uma possível melhoria na separação dos componentes da mistura?
Resolução
Dada a baixa polaridade do sistema empregado, não foi possível fazer a separação dos 
componentes. Uma sugestão seria testar a fase móvel com mistura de solventes em diferentes 
105
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
proporções, aumentando a polaridade do meio, pois, embora as estruturas moleculares sejam 
semelhantes, existe uma diferença de polaridade entre as moléculas estudadas devido à presença de 
grupos hidroxilas e metoxi na molécula.
 Lembrete
O tempo de retenção e o fator de retenção são grandezas inversamente 
proporcionais, ou seja, quanto maior o tempo de retenção, menor será o Rf.
5.8 Aplicações farmacêuticas
A técnica da cromatografia de camada delgada pode ser utilizada em diversas áreas da indústria 
alimentícia, farmacêutica ou em análises clínicas. Vejamos alguns exemplos:
• Análise de alimentos: a CCD pode ser usada para identificar a presença de resíduos de 
medicamentos, como antibióticos, que possam estar presentes em alimentos que foram 
processados e industrializados a partir de aves, carne bovina ou suína, entre outros.
• Indústria farmacêutica: é muito utilizada para a verificação de teste de estabilidade de 
medicamentos após o tempo de armazenamento. A CCD pode ser especialmente útil para esse 
tipo de teste, pois vários lotes ou marcas distintas podem ser executados simultaneamente para 
comparar e contrastar com amostras-padrão. A presença de um número maior de manchas 
pode indicar alterações na natureza química e na estabilidade de um determinado fármaco.
• Análise clínica: a técnica é frequentementeusada para isolar, comparar e caracterizar os 
compostos e metabólitos de sangue, soro, fluidos corporais e urina.
• Toxicologia: a CCD pode ser empregada em análises toxicológicas, como o trabalho desenvolvido 
por Xavier et al. (2007) como método para a detecção do aldicarb – popularmente conhecido como 
chumbinho – com finalidades forenses, podendo servir como método qualitativo de triagem ou 
como ferramenta diagnóstica nos casos de intoxicação não fatais. Havendo a confirmação do 
diagnóstico, facilita a escolha do melhor tratamento.
A seguir os resultados publicados pelo Boletim Epidemiológico Paulista (Bepa) para soluções 
padrões, utilizados em CDD, com a finalidade de identificar fraudes em medicamentos manipulados e 
comercializados como naturais de plantas recomendadas no tratamento de dores de coluna, artrites 
e tendinites: 
106
Unidade II
Tabela 9 – Resultados de Rf dos padrões de corticoides nos três efluentes 
utilizados [A] e Rf de peroxidam [B], por cromatografia de camada delgada
A
Efluentes
Padrões A B C
Dexametasona 0,56 0,39 0,26
Acetato de 
Dexametasona 0,83 0,68 0,51
Acetato de Cortisona - 0,72 0,57
Hidrocortisona 0,57 0,37 0,27
Dipropionato de 
Betametasona 0,9 0,8 0,7
Valerato de 
Betametasona 0,77 0,65 0,46
Prednisona 0,65 0,49 0,36
Acetato de Prednisolona 0,79 0,62 0,43
Fludrocortisona 0,83 0,69 0,5
B
Eluentes
Padrão A B C
Piroxicam 0,5 0,46 0,16
Fonte: Yano et al. (2011, p. 8).
Os autores relatam que, em um conjunto de 25 amostras analisadas, somente o acetato de cortisona 
não foi identificado no eluente A. Em um conjunto de 25 amostras de medicamentos manipulados, 
indicados para o tratamento de dores, foram detectadas sete amostras com o acetato de dexametasona, 
correspondendo a 28% das amostras analisadas, sendo que em três destas (12%) o acetato de 
dexametasona estava associado ao piroxicam, não declarado em suas formulações, além da rotulagem 
dos produtos em desacordo com a legislação vigente (YANO et al. 2011). 
 Observação
Os corticoides são também conhecidos como corticosteroides ou 
cortisona, são hormônios produzidos pelas glândulas suprarrenais que 
possuem uma potente ação anti-inflamatória. O piroxicam é indicado para 
uma variedade de condições que requeiram atividade anti-inflamatória 
e/ou analgésica.
A presença desses corticoides e do piroxicam nas amostras analisadas comprovam a suspeita de 
fraude nos produtos comercializados, uma vez que no rótulo do produto não constavam, segundo os 
autores, as informações necessárias sobre esses componentes. 
107
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
 Saiba mais
Sugerimos a leitura do artigo a seguir, que emprega a técnica de CCD 
para separação e identificação de nimorazol em comprimidos.
VALLADÃO et al. Separação e identificação do fármaco nimorazol em 
comprimidos por cromatografia em camada delgada. Revista Brasileira de 
Farmácia, v. 95, n. 1, p. 486-498, 2014. Disponível em: http://www.seasinop.com.br/
revista/index.php?journal=SEA&page=article&op=view&path%5B%5D=173. 
Acesso em: 3 jul. 2020.
6 CROMATOGRAFIA GASOSA (CG)
Vamos estudar as propriedades da cromatografia gasosa e os temas relacionados à separação 
das moléculas empregando os diferentes tipos de fase estacionária característicos desse modelo de 
separação. Discutiremos, também, os fatores que interferem na análise por cromatografia gasosa, a 
instrumentação do cromatógrafo a gás e as características a serem observadas para a amostra que 
será submetida a esse tipo de separação, identificação e quantificação de moléculas. Por fim, serão 
abordados exemplos de aplicação dessa técnica na área da saúde e da farmácia.
6.1 Fundamentos
Conforme já foi visto, a cromatografia é um método físico-químico de separação de misturas que 
permite identificar e quantificar os componentes dessa mistura. Nessa técnica, os componentes da 
mistura são separados com base na sua interação diferencial entre uma fase estacionária (FE), que se 
mantém fixa, podendo ser líquida ou sólida, e uma fase móvel (FM), que transporta a amostra por meio 
da fase estacionária, podendo ser líquida ou gasosa.
Veja na figura a seguir uma ilustração eficiente do processo cromatográfico:
Correnteza do rio
Folhas
Pedras
Leito do rio
Figura 61 – Exemplo de diferentes interações
108
Unidade II
As folhas e as pedras podem ser interpretadas como a mistura de diferentes substâncias. Todas são 
jogadas no rio, sendo que o leito do rio ilustra a fase estacionária, e a correnteza, a fase móvel. Nesse 
exemplo, a força da gravidade faz com que haja maior interação de uma das substâncias – as pedras – 
com a fase estacionária, e assim as pedras terão menor velocidade de deslocamento pelo rio. Já a outra 
substância – simbolizada pelas folhas –, por ser mais leve, não tem tanta interação com o leito do rio, 
mas sim com a correnteza (fase móvel) e, por esse motivo, se desloca mais rapidamente pelo rio.
No caso da cromatografia, os componentes da mistura podem apresentar, com as fases móvel e 
estacionária, as seguintes interações:
• diferenças de solubilidade;
• diferenças de polaridade;
• diferenças de partição;
• diferenças de volatilidade;
• diferenças de capacidade de adsorção;
• diferenças de tamanho de partículas.
Dessa forma, de acordo com a força das interações entre a fase móvel, a fase estacionária e as 
substâncias da amostra, ocorrerá um espalhamento das moléculas das substâncias no interior da 
coluna, fazendo com que ocorra uma separação por afinidade química. A velocidade de escoamento das 
substâncias pela coluna variará, conforme se observa: menor interação, maior velocidade de escoamento; 
maior interação, menor velocidade de escoamento.
Fluxo da fase móvel
Fase estacionária
Substância com menor interação com a fase estacionária
Maior velocidade
Menor velocidade
Primeiro pico cromatográfico
Último pico cromatográfico
Substância com maior interação com a fase estacionária
Figura 62 – Separação cromatográfica
109
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
Como as substâncias escoarão com diferentes velocidades pela fase estacionária, elas serão separadas. 
Caso se utilize a fase estacionária acondicionada em uma coluna e um detector capaz de responder às 
concentrações das substâncias presentes na amostra for colocado ao final dessa coluna, será possível 
registrar o sinal do detector com o passar do tempo (ou com o volume de fase móvel escoado), e, 
assim, se poderá obter uma série de picos. O gráfico obtido é chamado de cromatograma. A seguir um 
cromatograma obtido a partir dos sinais do detector com a passagem da amostra pela coluna.
Amostra
A + B
Coluna 
recheada
B
A
B
A
B
A
A
t0
t0
(a)
(b) Tempo
Si
na
l d
o 
de
te
ct
or
t1
t1
t2
t2
t3
t3
t4
t4
B Detector
B
Fase móvel
Figura 63 – (a) diagrama descrevendo a separação dos componentes A e B de uma mistura por cromatografia 
em coluna; (b) o sinal do detector em vários estágios da eluição mostrados em (a) = cromatograma
Os princípios físico-químicos básicos que permitem a separação dessas misturas são, resumidamente: 
• Adsorção: o soluto fica retido pela superfície da fase estacionária por meio de interações químicas 
ou físicas.
• Partição: o soluto se dissolve na parte líquida que envolve a superfície do suporte sólido da fase 
estacionária ou da parede.
• Troca iônica: o íon da amostra se liga à carga fixa de um grupo funcional pertencente à 
fase estacionária.
110
Unidade II
• Exclusão molecular: as moléculas são separadas por tamanho, havendo retenção das maiores.
• Bioafinidade: ocorre uma ligação molecular específica e reversível entre o soluto e o ligante 
fixado à fase estacionária.
Como uma diferença de polaridade poderia afetar uma separação cromatográfica? Imagine uma 
amostra que contém éter, aldeído e fenol atravessando uma coluna cromatográfica de características 
polares. Conforme Dias et al. (2016), nesse caso, a primeira substância que sai da coluna é o éter, pois ele 
é menos polar e assim vai interagir menoscom a fase estacionária, ficando mais tempo na fase móvel; 
a segunda substância a deixar a coluna é o aldeído; o fenol será o último componente da mistura a sair 
da coluna, por apresentar característica mais polar entre os três componentes, ou seja, é o composto 
que interage mais com a fase estacionária. Pode-se dizer que o fenol tem maior retenção nessa coluna.
6.1.1 Cromatogramas
A figura a seguir apresenta um cromatograma com suas informações mais básicas:
In
te
ns
id
ad
e 
do
 si
na
l n
o 
de
te
ct
or
Tempo
Pico
h
A
tR
tR’
tO
tR’ = tR - tO
tR: Tempo de retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico 
cromatográfico)
tO: Tempo de retenção zero (tempo de retenção do composto não retido = tempo 
mínimo para que um composto que não interaja com a fase estacionária 
atravesse a coluna)
tR’: Tempo de retenção ajustado (tempo médio que as moléculas do analito 
passam sorvidas na fase estacionária)
A: Área do pico
h: Altura do pico
Figura 64 – Cromatograma
O cromatograma pode trazer muitas informações para o analista. De acordo com Skoog, West 
e Holler (1996), as posições dos picos do cromatograma no eixo do tempo podem ser usadas para 
identificação dos componentes da amostra. Já as áreas sob os picos estão relacionadas às quantidades 
das substâncias presentes na amostra.
Durante uma análise cromatográfica, é importante que:
111
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
• Cada uma das substâncias da mistura, que pode ser chamada de analito, apresente um único pico.
• O pico relativo ao analito deve ser estreito e não se sobrepor a nenhum outro pico.
• Estes picos devem ser o mais uniformes e estreitos possível.
A separação e definição adequada dos picos referentes aos analitos é chamada resolução. A seguir, 
dois exemplos de resolução dos picos:
Cromatograma com resolução ineficiente:
- Picos largos
- Picos sobreposto
- Um dos picos não tem simetria
Cromatograma com melhor resolução:
- Picos mais estreitos
- Picos sem sobreposição
- Picos simétricos
Figura 65 – Resolução dos picos cromatográficos
Collins, Braga e Bonatto (1997) apontam que, sendo a finalidade mais importante de qualquer 
separação cromatográfica resolver os componentes da amostra, devem-se considerar os parâmetros 
experimentais que influenciam a resolução. A figura a seguir mostra três cromatogramas, nos quais se 
podem comparar as contribuições da eficiência e seletividade na resolução. 
A)
B)
C)
Figura 66 – Eficiência e seletividade na resolução de uma separação cromatográfica
No cromatograma (a), indicado na figura, nota-se que a má eficiência e má seletividade resultam 
em má resolução, pois picos largos e pouco separados tendem a se sobrepor. No entanto, quando a 
112
Unidade II
seletividade é boa, conforme se observa no cromatograma (b), pode-se compensar a má eficiência, 
obtendo boa resolução. O ideal é o cromatograma (c), conseguido por meio de boa eficiência e boa 
seletividade. Os três parâmetros, eficiência, seletividade e resolução, podem ser quantificados.
6.1.2 Eficiência
A teoria da separação das substâncias na cromatografia pode ser explicada por meio de uma 
analogia com processos de destilação e extração em contracorrente. A eficiência da separação pode ser 
determinada a partir de alguns parâmetros, sendo o prato teórico o principal deles. Mas o que é um 
prato teórico?
Em um processo de destilação, os pratos existem realmente. A figura a seguir mostra um esquema 
de torre de destilação no qual se observam diversos patamares, que chamamos de pratos, e nos quais a 
mistura líquida a ser destilada está em equilíbrio com sua fase vapor. Nos pratos, o vapor atravessa uma 
fase líquida, e se pode medir a distância entre um prato e outro. Quando mais alto estiver o prato, mais 
rica será a mistura no seu componente mais volátil. Assim, de forma geral, espera-se que, quanto maior 
for o número de pratos, mais eficiente seja o processo de separação da mistura por destilação. 
Figura 67 – Torre de destilação mostrando pratos de separação
Em uma coluna cromatográfica, os pratos não podem ser observados fisicamente como se faz na 
coluna de destilação e, por essa razão, são chamados de pratos teóricos. No entanto, é possível calcular 
a altura equivalente a um prato teórico (HEPT) a partir do comprimento da coluna, e assim o conceito 
utilizado em destilação é estendido para explicar o processo da cromatografia. 
Portanto, usa-se o cálculo dos pratos teóricos para estimar a eficiência do processo de separação 
cromatográfico. Mas como? Dentro da coluna considera-se que cada estágio de equilíbrio de distribuição 
do analito entre a fase estacionária e a fase móvel é um prato teórico. A partir do cromatograma, é 
possível fazer a determinação experimental do número de pratos teóricos de uma coluna (N) utilizando 
a seguinte relação matemática: 
113
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
tR = tempo de retenção
Wb = largura do pico
tR
Injeção
Tempo
Wb
Figura 68 – Parâmetros para cálculo do número de pratos teóricos (N) 
2
R
b
t
N 16.
W
 
=   
 
A análise da equação anterior mostra que quanto maior for o tempo de retenção tR, maior será o 
número de pratos teóricos (N) e mais eficiente será a separação. Por outro lado, quanto menor for a 
largura do pico Wb, maior será o número de pratos teóricos (N) e mais eficiente será a separação.
Na sequência uma comparação entre dois picos com diferentes números de pratos teóricos para o 
mesmo analito.
Onde N = número 
de pratos teóricos 
da coluna
N = 1000
N = 100
B
A
Figura 69 – Cromatogramas com diferentes números de pratos teóricos
6.1.3 Seletividade
O fator de seletividade (α) para dois analitos em uma coluna fornece uma medida de quão bem a 
coluna consegue separá-los. Também chamado de fator de separação, o fator de seletividade de 
uma coluna para dois analitos, X e Y, é definido conforme indicado na equação a seguir:
( )
( )
R 0X
R 0Y
t -t
a= 
t - t
 
114
Unidade II
X é o analito de maior tempo de retenção, ou seja, aquele mais fortemente retido pela coluna, e Y o 
analito de menor tempo de retenção, ou seja, aquele menos retido pela coluna cromatográfica.
 Lembrete
tR é o tempo decorrido desde a injeção da mistura até o ápice do pico 
cromatográfico, e t0 é o tempo mínimo necessário para que um composto 
que não interage com a fase estacionária atravesse a coluna.
6.1.4 Resolução
De acordo com Skoog, West e Holler (1996), a resolução (Rs) de uma coluna nos diz o quanto dois 
picos se distanciam um em relação ao outro em comparação com as suas larguras. A resolução fornece 
uma medida quantitativa da habilidade de a coluna separar dois analitos. O significado desse termo 
é ilustrado na figura a seguir, que mostra cromatogramas para as misturas de substâncias Y e X em 
três colunas com diferentes poderes de resolução. A resolução de cada coluna é definida conforme a 
seguinte equação:
( ) ( )R RX Y
S
Y X X Y
2. t - t2.nZ
R = = 
W +W W +W
  
Sendo que:
Rs = resolução
ΔZ = distância entre o ápice dos dois picos (de X e de Y)
WY = largura do pico referente à substância Y (aquela que apresenta menor interação com a fase estacionária)
WX = largura do pico referente à substância X (a que apresenta maior interação com a fase estacionária, 
ou seja, é mais retida pela coluna)
(tR)X = tempo de retenção da substância X
(tR)r = tempo de retenção da substância Y
115
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
RS = 0,75
Y
Y
Y
Y
O
Y
X
X
X
X
X
RS = 1,0
RS = 1,,5
W
t
0
0
(tR)
(tR) ∆Z
0
Si
na
l d
o 
de
te
ct
or
0 Tempo, min
W
Figura 70 – Cromatogramas para as espécies Y e X em três colunas com diferentes poderes de resolução
Enfim, as melhores condições para a obtenção de picos cromatográficos com alta resolução 
podem ser satisfeitas escolhendo adequadamente a fase estacionária, a fase móvel e os parâmetros 
experimentais, como, por exemplo, programação de temperatura, vazão, modo de injeção da amostra 
na coluna, diâmetro da coluna etc. Conformeo tipo de cromatografia selecionado, esses parâmetros 
podem ser muito diferentes.
Estamos nos atendo aqui apenas ao estudo da técnica da cromatografia gasosa. Mais adiante, você 
encontrará aplicações para a cromatografia gasosa.
Entre os diferentes tipos de cromatografia existentes, classificados na próxima figura, a cromatografia 
gasosa é caracterizada por utilizar fase estacionária líquida ou sólida, e fase móvel sempre gasosa. 
116
Unidade II
Injetor 
automático
Detector
Display e 
interface
Forno
Figura 71 – Cromatógrafo a gás
Conforme Skoog, West e Holler (1996), há dois tipos de cromatografia gasosa: a cromatografia 
gás-sólido (CGS) e a cromatografia gás-líquido (CGL). A cromatografia gás-sólido se baseia na 
utilização de uma fase estacionária sólida, e sua aplicação é limitada à separação de certas espécies 
gasosas de baixo peso molecular. A cromatografia gás-líquido é a mais utilizada em todas as áreas da 
ciência e, geralmente, é ela que recebe o nome cromatografia gasosa (CG). De acordo com Collins, 
Braga e Bonatto (1997), a cromatografia gasosa é uma técnica com um poder de resolução (separação 
das substâncias) excelente, o que pode possibilitar a análise de dezenas de substâncias em uma mesma 
amostra. Dependendo do tipo de substância analisada e do detector empregado, é possível encontrar 
cerca de 10-12 g. 
Por ser simples e apresentar grande sensibilidade e efetividade na separação dos componentes de 
uma mistura, a CG é uma das técnicas mais importantes em química e áreas afins. É amplamente 
usada para análises quantitativas e qualitativas de espécies químicas. Nela, a amostra é vaporizada e 
injetada na coluna cromatográfica. Uma fase gasosa inerte (fase móvel) transporta a amostra ao longo 
da coluna contendo a fase estacionária. Em contraste com outros tipos de cromatografia, a fase móvel 
não interage com as moléculas da amostra, ou do analito, sua única função é transportar as substâncias 
através da coluna.
A CG também pode ser acoplada a um espectrômetro de massas. Nesse caso, a CG separa os 
constituintes da amostra, que são diretamente enviados ao espectrômetro de massas utilizado para 
sua identificação.
Segundo Wilson e Walker (2010), espectrometria de massas (MS – do inglês mass spectrometry) 
é uma técnica analítica muito valiosa, na qual moléculas em uma amostra são convertidas em íons 
em fase gasosa, e esses íons serão depois separados no espectrômetro de massas de acordo com a 
razão massa (m) sobre carga (z), m/z. Por sua vez, Santos et al. (2016) descrevem simplificadamente o 
funcionamento do método: um feixe de elétrons de alta energia bombardeia a amostra em fase gasosa, 
117
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
e o aparelho detecta e registra os fragmentos gerados pelo impacto dos elétrons. A partir do valor da 
massa molecular de cada um dos fragmentos, monta-se a molécula, como um quebra-cabeças.
Quando a cromatografia gasosa é indicada como método analítico? Quais tipos de misturas podem 
ser separadas por cromatografia gasosa? Como a fase móvel é gasosa, a mistura a ser separada por 
CG deve ter seus compostos constituintes voláteis. Isso significa que eles precisam se dissolver, pelo 
menos parcialmente, no gás de arraste. De modo geral, a CG pode ser utilizada na separação e na 
análise de misturas cujos constituintes tenham pontos de ebulição de até 300 ºC e que sejam estáveis 
termicamente, ou seja, não sofram degradação na faixa de temperatura que será utilizada na análise.
6.2 Vantagens e desvantagens da CG
Vantagens: 
• Alto poder de resolução, analisa muitos componentes de uma única amostra. 
• Alta sensibilidade, podendo alcançar 10-12 g.
• Pequenas quantidades de amostra utilizada.
• Adequada para análise quantitativa (picogramas a miligramas).
Desvantagens:
• Podem ser analisadas somente substâncias voláteis e estáveis termicamente, ou seus derivados.
• Pode requerer preparo da amostra devido à possível presença de interferências e contaminações.
• Tem custo elevado.
• Apresenta eficiência qualitativa limitada.
6.3 Instrumentação
Em um cromatógrafo a gás, a amostra líquida volátil (ou gasosa) é injetada por meio de um septo (disco 
de borracha de silicone autosselante) com uma microsseringa ou por um sistema automático. A agulha 
deposita a amostra em um bloco de metal aquecido (injetor) que está na entrada da coluna, e a amostra 
é imediatamente vaporizada. O vapor é conduzido através da coluna por meio de um gás de arraste, e 
os analitos separados chegam ao detector, cuja resposta é observada em um computador. O detector é 
mantido em uma temperatura maior do que a da coluna, de modo que todos os analitos permaneçam 
na forma gasosa.
A figura a seguir mostra de forma esquemática um cromatógrafo a gás:
118
Unidade II
Gás de 
arraste
Controle de 
pressão/fluxo
Software
Coluna
Forno da coluna
Injetor
Detector
Figura 72 – Instrumentação do cromatógrafo a gás
Sistema de gás de arraste
A fase móvel utilizada em CG deve ser quimicamente inerte, ou seja, não pode reagir com a 
amostra injetada nem com a fase estacionária ou com superfícies do instrumento. É importante 
ainda que a fase móvel selecionada seja compatível com o detector que será utilizado. Cada detector 
demanda um gás de arraste específico para seu melhor funcionamento. O gás de arraste também 
deve ser isento de impurezas. Algumas impurezas podem até mesmo degradar a fase estacionária. 
Por exemplo:
• Água e oxigênio: hidrolisam ou oxidam algumas fases estacionárias; podem ser incompatíveis 
com alguns tipos de detectores.
• Hidrocarbonetos: podem causar ruídos em alguns tipos de detectores. 
O gás hélio (He) é a fase móvel mais utilizada, embora os gases argônio, nitrogênio e hidrogênio 
também possam ser utilizados. Todos estão disponíveis em cilindros pressurizados e é necessário 
dispor de reguladores de pressão, manômetros e medidores da vazão para que se possa controlar a 
vazão do gás. 
A seleção adequada do gás de arraste e de seus parâmetros de utilização, como a vazão, interfere 
muito na resolução dos picos cromatográficos, como mostra a figura a seguir:
119
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
Tempo (min)
Gás de arraste N2
10 cm/s
R = 0,87
Gás de arraste He
22 cm/s
R = 1,44
Gás de arraste H2
60 cm/s
R = 1,78
Re
sp
os
ta
 d
o 
de
te
ct
or
 →
14 9,5 7,515 10,0 8,016 10,5 8,5
Figura 73 – Influência do gás de arraste e vazão na resolução de picos (R = resolução)
A figura mostra também que a resolução (R) aumenta, e o tempo de análise diminui conforme se 
troca o gás de arraste de N2 para He e depois para H2.
Sistema de injeção
A injeção da amostra pode ser feita por meio de sistemas automáticos pressurizados ou com a utilização 
de microsseringas.
Corpo de vidro da seringa
Ar Amostra
Figura 74 – Microsseringa
Figura 75 – Microsseringa para cromatografia
120
Unidade II
A porta de admissão da amostra geralmente é mantida cerca de 50 °C acima do ponto de ebulição 
do componente de menor volatilidade da amostra para garantir que toda ela seja vaporizada após a 
injeção. De acordo com Skoog, West e Holler (1996), a amostra deve ser injetada em volume e velocidade 
adequados. Os dispositivos para injeção, como microsseringa, injetores ou vaporizadores, devem prover 
meios de introdução instantânea da amostra na coluna cromatográfica. Isto é importante pois injeções mais 
lentas ou de amostras muito volumosas causam espalhamento dos picos, piorando a resolução, como se 
observa na figura:
Injeção instantânea:
Injeção lenta:
tempo = 0
tempo = 0
tempo = x
tempo = x
Figura 76 – Dispersão dos analitos na coluna devido à injeção. Comparação 
da dispersão dos analitos: injeção instantânea/injeção lenta 
De acordo com Harris e Lucy (2017), volumes de líquidos de cerca de 1 mL são injetados através do 
septo de borracha em uma entrada de vidro aquecida, e volumes de gases de cerca de 10 µL (microlitros) 
até 5 mL podem ser injetados através de uma seringa especial, à prova de vazamentos de gases.No entanto, a quantidade de amostra deve ser adaptada ao método utilizado e ao tipo e diâmetro de 
coluna escolhida, de forma a obter melhor resolução. Skoog, West e Holler (1996) indicam que, para as 
colunas analíticas empacotadas normais, o tamanho da amostra pode variar de poucos décimos de µL 
até 20 µL. Já para colunas do tipo capilar, são necessárias amostras menores por um fator de 100 ou maior.
Injetor é o dispositivo no qual a amostra é injetada no cromatógrafo. Há diversos tipos de injetores, 
mas dois tipos são mais utilizados: 
A
B
C
D
F
E
Figura 77 – Injetores split/splitless: A) porca do septo; B) purga do septo; C) entrada de gás de arraste; 
D) corpo do injetor; E) conexão para coluna capilar; F) tomadas divididas (design de divisão dupla)
121
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
Injetores on column colocam a amostra direto na coluna, sendo a amostra vaporizada conduzida 
pela coluna por meio da ação do gás de arraste. De acordo com Mendham et al. (2002), esse tipo de 
injetor é muito utilizado para colunas empacotadas, também chamadas de colunas recheadas. Tendo a 
coluna empacotada um diâmetro maior, praticamente não há dificuldade de colocar toda a amostra 
na coluna. Harris e Lucy (2017) indicam que esse sistema é mais indicado para análise quantitativa e 
para compostos termicamente sensíveis. As figuras a seguir trazem um esquema do injetor on column 
e de seu funcionamento:
Silicone
Bloco metálico
Ponta da 
coluna
Gás de arraste
Figura 78 – Esquema do injetor on column
Para esse tipo de injetor, a ponta da agulha da microsseringa deve ser introduzida na área do 
septo de silicone até atingir a ponta da coluna. Em seguida, a amostra será injetada e vaporizada 
instantaneamente, ao entrar em contato com a elevada temperada da ponta da coluna. O vapor da 
amostra será conduzido pelo gás de arraste pelo interior da coluna como forma de garantir a interação 
com a fase estacionária e a separação de seus componentes.
Injetores split/splitless funcionam com/sem divisão de fluxo. Geralmente são indicados para colunas 
capilares, que, por sua baixa capacidade de processamento de amostra (submicrolitro), requerem um 
volume muito menor de amostra injetada. Para injeções split, ou seja, com divisão de fluxo, conforme 
Mendham et al. (2002), o injetor aquecido tem uma superfície recoberta com um dispositivo de vidro, 
e a amostra se vaporiza e se mistura com o gás de arraste. Uma proporção predeterminada, geralmente 
entre 1 e 10%, passa para a coluna, e o restante é descartado. Esse recurso evita um problema frequente 
nas colunas capilares, que é a saturação da coluna, mas só funciona se a concentração do analito na 
amostra for alta (maior que 0,01% em volume). Harris e Lucy (2017) indicam que esse é um tipo de 
injetor adequado para grandes concentrações de analito ou para análise de gases. No entanto, seus 
resultados para análise quantitativa não são muito bons, pois os analitos menos voláteis tendem a se 
perder durante a injeção. 
Ainda de acordo com Harris e Lucy (2017), a injeção com divisão de fluxo oferece alta resolução e 
auxilia no processamento de amostras contaminadas. Para injeções splitless, ou seja, sem divisão de 
fluxo, é usada a mesma entrada de injeção, porém a região revestida de vidro é um tubo reto, vazio, sem 
nenhuma câmara de mistura.
122
Unidade II
Seringa
Septo
102 mL/min
100 mL/min 0 mL/min
1 mL/min 1 mL/min2 mL/min
1 mL/min 1 mL/min
Injetor com 
divisão de fluxo
Injetor sem 
divisão de fluxo
Purga 
do septo
Abertura 
de divisão
350 °C 220 °C
Coluna
Figura 79 – Esquema de injetores split/splitless
Esse tipo de injetor é adequado para trabalhar com soluções muito diluídas, oferecendo alta 
resolução. Ela é melhor que a injeção com divisão de fluxo para compostos com estabilidade 
térmica moderada, pois a temperatura de injeção é menor. A amostra é introduzida lentamente 
na coluna. 
Forno
Além da interação com a fase estacionária, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna 
depende de sua pressão de vapor (po). A pressão de vapor do analito e a sua retenção dependem 
de parâmetros termodinâmicos, o que significa que a temperatura da coluna controla a retenção do 
analito. Quanto maior for a temperatura, maior será a pressão de vapor do analito e maior será sua 
velocidade de migração através da coluna, ou seja, a eluição do analito será mais rápida. Dessa forma, o 
tempo de retenção será menor.
 Observação
Eluição é um processo por meio do qual os solutos são transportados 
através da fase estacionária pelo movimento de uma fase móvel. A fase 
móvel que sai da coluna é chamada eluato. O termo eluente se refere ao 
solvente usado para transportar os componentes de uma mistura através 
de uma fase estacionária.
Portanto, a temperatura deve ser controlada dentro de poucos décimos de grau para obter boa 
precisão. As principais características de um forno têm de ser:
123
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
• Ampla faixa de temperatura de uso (ao menos da temperatura ambiente até 400 °C). Em casos 
especiais, quando é preciso trabalhar em temperaturas inferiores à ambiente, são necessários 
sistemas criogênicos. 
• Temperatura independente, ou seja, não pode afetar os outros módulos do cromatógrafo e nem 
ser afetada pelas temperaturas do injetor e do detector. 
• Temperatura uniforme em todo interior do forno. Isso pode ser garantido pela presença de 
sistemas de ventilação.
• Fácil acesso à coluna, para facilitar a sua troca quando necessário. 
• Aquecimento e resfriamento rápidos.
• Temperatura estável e reprodutível, mantida com exatidão e precisão de ± 0,1 °C.
Ao longo da análise, a temperatura do forno em que se encontra a coluna pode permanecer 
constante (cromatografia gasosa isotérmica) ou sofrer uma variação, linear ou não (cromatografia 
gasosa com temperatura programada ou cromatografia gasosa com gradiente de temperatura). 
A programação de temperatura é muito importante em cromatografia gasosa, já que melhora a separação 
e diminui o tempo da análise.
De acordo com Skoog, West e Holler (1996), ao trabalhar com amostras que apresentam substâncias 
com diferentes pontos de ebulição, é desejável que se empregue uma programação de temperatura 
por meio da qual a temperatura da coluna é aumentada, continuamente ou em etapas, conforme a 
separação se processa. Segundo Collins, Braga e Bonatto (1997), uma programação de temperatura 
geralmente consiste em iniciar a análise da coluna em uma temperatura mais baixa. Dessa forma, 
analitos de baixo ponto de ebulição podem eluir com picos separados. Em seguida, durante a análise, a 
temperatura da coluna é aumentada com a finalidade de diminuir a retenção de substâncias de maior 
ponto de ebulição. 
Além das vantagens citadas, a programação de temperatura faz com que haja maior simetria nos 
picos e melhor detectabilidade para aqueles picos com tempos de retenção excessivamente longos sob 
condições isotérmicas. A figura a seguir mostra a possível melhoria em um cromatograma por meio da 
programação de temperatura:
124
Unidade II
30
30
30
Tempo, min
Tempo, min
Tempo, min
Temperatura, °C
180°150°120°90°60°30°
Caso “a“
Separação isotérmica 
a 45 °C
Caso “b“
Separação isotérmica 
a 145 °C
Caso “c“
Separação com programação 
de temperatura variando de 
30 °C a 180 °C
5
4
87
1 2 3
4
5 6
7 8 9
6
5
x4
(a)
(b)
(c)
3
2
1
20
20
20
10
10
10
0
0
0
Figura 80 – Otimização da separação cromatográfica com a utilização de programação de temperaturas
Analisando a figura, temos que:
• Caso “a”: quando a temperatura da coluna é baixa e constante, os componentes mais voláteis, 
identificados como 1, 2 e 3 na figura, são bem separados; já os componentes menos voláteis, identificados 
na figura com os números de 4 a 9, demoram a eluir, apresentando picos mal definidos.
• Caso “b”: quando a temperatura da coluna é mais alta e constante, os componentes mais voláteis, 
identificados com os números 1, 2 e 3 na figura, praticamentenão se separam; os componentes 
menos voláteis eluem mais rapidamente.
• Caso “c”: quando se utiliza a programação de temperatura, para que varie em função do tempo, 
há boa separação dos analitos em menor tempo.
Colunas
As colunas servem para suportar a fase estacionária. Há dois tipos de colunas utilizadas na 
cromatografia gasosa: a coluna recheada (ou empacotada) e a coluna capilar. Diâmetro e comprimento 
são diferentes em cada um desses tipos: 
125
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
• Coluna recheada: diâmetro de 3 a 6 mm; comprimento de 0,5 a 5 m.
• Coluna capilar: diâmetro de 0,1 a 0,5 mm; comprimento de 5 a 100 m. 
A) B) C)
Figura 81 – A e B) colunas recheadas de inox; C) coluna recheada de vidro 
Figura 82 – Colunas capilares
A figura a seguir traz um esquema que permite comparar os tipos de coluna internamente: 
Parede da coluna
r
Coluna empacotada Coluna capilar
Coluna capilar com 
parede recoberta
Suporte sólido 
recoberto com fase 
estacionária líquida
Fase estacionária líquida 
recobrindo a parede 
interna do tubo (TAPR)
Partículas sólidas da 
fase estacionária (TARS)
Coluna capilar com 
camada porosa
Figura 83 – Colunas empacotada e capilar
126
Unidade II
Colunas recheadas
As colunas recheadas (ou empacotadas), de acordo com Harris e Lucy (2017), contêm partículas 
muito pequenas de um suporte sólido que é recoberto por uma fase estacionária líquida não volátil. 
Às vezes, o próprio sólido atua como fase estacionária. Geralmente essas colunas são feitas de aço 
inoxidável ou vidro e apresentam entre 3 e 6 mm de diâmetro, podendo possuir comprimento que 
varia de 0,5 m a 5 m de comprimento. O recheio tem a finalidade de fixar a fase estacionária líquida 
de modo que a maior área superficial possível esteja exposta à fase móvel. O material deve ser inerte a 
temperaturas elevadas e ter resistência mecânica. 
O suporte sólido é frequentemente constituído por sílica, por terras diatomáceas de ocorrência 
natural ou por zeólitas. Quanto menor for o tamanho da partícula, maior será a área de superfície 
e maior será a eficiência da coluna. Entretanto, quanto menor for o tamanho da partícula, menor 
será o espaço entre elas, e, por isso, será necessária uma pressão maior para forçar a fase móvel a 
passar através da coluna. Nomes comerciais para suporte sólido bastante utilizados são Chromosorb, 
Anachrom, Supelcoport, entre outros.
 Saiba mais
A terra diatomácea, também chamada de diatomito, é uma rocha 
sedimentar biogênica, ou seja, proveniente de organismos vivos. Ela se forma 
por meio da decomposição dos restos microscópicos das carapaças (pequenos 
esqueletos) de algas diatomáceas em mares, lagos e pântanos, o que dá origem 
a depósitos estratificados ou maciços. Para mais informações sobre o tema, leia:
BRANCO, P. M. Os muitos usos do diatomito. Serviço Geológico do Brasil 
(CPRM), 2014. Disponível em: http://www.cprm.gov.br/publique/Redes-
Institucionais/Rede-de-Bibliotecas---Rede-Ametista/Os-Muitos-Usos-do-
Diatomito-1296.html. Acesso em: 6 jul. 2020.
A) B)
Figura 84 – Dois exemplos de terras diatomáceas
127
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
Quando comparadas às colunas capilares, Harris e Lucy (2017) reportam que as colunas recheadas 
possuem maior capacidade de amostra, mas produzem picos mais largos, apresentam tempos de 
retenção maiores e têm menor resolução. No entanto, elas são muito usadas em separações 
preparativas, as quais necessitam de uma grande quantidade de fase estacionária, ou para separar 
gases que têm baixa retenção.
Utiliza-se um grande número de fases estacionárias líquidas para rechear colunas. Em sua maioria, 
elas podem ser agrupadas em não polares, de polaridade média e polares.
As colunas recheadas apresentam a vantagem de poderem ser preparadas no laboratório pelo próprio 
analista. Seu preparo se inicia, de acordo com Collins, Braga e Bonatto (1997), dissolvendo-se a fase líquida 
em um solvente adequado e, em seguida, adicionando o suporte a essa mistura. Sob agitação lenta e 
contínua, o solvente é removido por evaporação, de modo que as partículas do suporte não se quebrem 
e o recobrimento do suporte pela fase líquida seja homogêneo. Esse procedimento é satisfatório para 
preparação de recheios com porcentagens de fase líquida entre 10 e 30%. Os autores apresentam outras 
técnicas para menores porcentagens de fase líquida.
Depois de pronto, o recheio é introduzido na coluna. Especialmente as colunas metálicas 
necessitam de um processo prolongado de limpeza, envolvendo a passagem de uma série de 
solventes e soluções: diclorometano, acetona, água, ácido nítrico ou ácido clorídrico concentrados, 
hidróxido de amônio, N-metilpirrolidona, acetona e, finalmente, o solvente empregado no preparo 
do recheio. Tubos de vidro devem ser silanizados após o processo de limpeza para recobrimento dos 
sítios ativos remanescentes. 
Sítios em que o analito se liga fortemente levam ao aparecimento de cauda no respectivo pico, 
diminuindo sua simetria. As superfícies das colunas de sílica e as partículas da fase estacionária contêm 
grupos silanóis (—SiOH) que formam ligações de hidrogênio com solutos polares, o que conduz a uma 
intensa formação de cauda. Conforme Harris e Lucy (2017), a técnica de silanização reduz a formação 
de cauda por meio do bloqueio dos grupos hidroxila com grupos apolares trimetilsilil. Esse processo está 
esquematizado na figura a seguir: 
(CH3)3SiO
Si Si Si Si ++ → NH3O(CH3)3SiNHSi(CH3)3O
OHOH OSi(CH3)3
Superfície protegidaHexametildisilazinaFase sólida
com grupo — OH expostos
Figura 85 – Reação de silanização da superfície da sílica
O processo de silanização desativa os sítios SiOH (silánois) carregados sobre a superfície do vidro, 
aumentando a recuperação de compostos polares ou lábeis. 
128
Unidade II
Como se faz o “enchimento” de uma coluna cromatográfica? Para o enchimento da coluna, uma 
das suas extremidades recebe um tampão de lã de vidro, e depois é conectada a uma bomba de 
vácuo. Com o auxílio de um pequeno funil, a fase estacionária já recoberta é adicionada ao tubo. 
Frequentemente utiliza-se um vibrador para que o empacotamento do recheio seja mais homogêneo, 
minimizando espaços vazios dentro da coluna. 
Quando a coluna estiver completamente recheada, outro tampão de lã de vidro é adicionado na 
outra extremidade do tubo. Agora, a coluna deve passar por uma etapa de condicionamento, que tem a 
finalidade de retirar impurezas voláteis e o restante de solvente que possa ter ficado devido ao preparo 
da fase estacionária. Para proceder com o condicionamento, a coluna é posicionada no cromatógrafo 
tendo a saída do detector desligada. Com o gás de arraste já atravessando a coluna, a temperatura do 
forno é aumentada lentamente até cerca de 20 °C acima da temperatura máxima em que a coluna será 
trabalhada, com o cuidado de não exceder a temperatura limite de uso da fase estacionária. Conforme 
a natureza da fase estacionária, o tempo de condicionamento pode variar bastante, de algumas 
horas a até mesmo dias. 
Colunas capilares
Skoog, West e Holler (1996) e Mendham et al. (2002) apresentam três tipos básicos de colunas capilares: 
• Colunas tubulares abertas de parede recoberta (TAPR): em inglês, wall-coated open 
tubular (WCOT). Trata-se de tubos capilares recobertos internamente com uma fina camada de 
fase estacionária.
• Colunas tubulares abertas revestidas com suporte (TARS): em inglês, support-coated 
open tubular (SCOT). Trata-se de colunas revestidas internamente com um filme fino de 
suporte (tipo terra diatomácea). Esse tipo de coluna retém uma quantidade de fase 
estacionária muitas vezes maior que uma coluna de parede recoberta, apresentando assim 
maior capacidade de amostra. 
• Colunas abertas tubulares com camada porosa: em inglês, porous layer open tube (PLOT). 
Uma camada muito fina (5 a 50 µm) de adsorvente sólido, do mesmo tipo que os adsorventes 
usados nas colunas empacotadas, é depositada de forma homogênea na parede interna 
da coluna. Essesadsorventes sólidos são os mesmos utilizados nas colunas empacotadas da 
cromatografia de adsorção, porém, o diâmetro das partículas é muito menor. 
A figura a seguir apresenta um esquema que permite comparar os tipos apresentados de colunas capilares:
129
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
Tudo aberto de 
parede recoberta
Tudo aberto de 
camada porosa
Tudo aberto de 
suporte recoberto
WCOT
Wall Coatec 
Open Tube
PLOT
Porous Layer 
Open Tube
SCOT
Support Coated 
Open Tube
Fase estacionária
Colunas capilares Fase estacionária
Capilar de 
sílica fundida
Recobrimento 
de polimida
Figura 86 – Colunas capilares
As colunas capilares são muito eficientes na separação e, por isso, são utilizadas na separação de 
misturas extremamente complexas: amostras biológicas, essências, frações de petróleo, poluentes na 
água e no ar, por exemplo.
Dois fatores importantes, diretamente relacionados à eficiência da coluna capilar, são: seu diâmetro 
e seu comprimento. Em relação ao diâmetro, Harris e Lucy (2017) indicam que as colunas estreitas 
proporcionam maior resolução que as colunas mais largas, mas exigem maior pressão de operação e 
possuem menor capacidade de amostra. Isso pode ser verificado na figura a seguir, na qual se percebe 
claramente uma melhor resolução dos picos 1 e 2 quando se utiliza uma coluna de menor diâmetro.
Tempo (min)
Diâmetro 
interno 
0,32 mm
1. 1,3-Diclorobenzeno
2. 1,4-Diclorobenzeno
3. sec-Butilbenzeno
4. 1,2-Diclorobenzeno
Re
sp
os
ta
 d
o 
de
te
ct
or
 →
Diâmetro 
interno 
0,25 mm
2,52,5 2,02,0 1,51,5
1
4
4
2
2
1
3
3
Figura 87 – Variação na resolução dos picos devido à diminuição no diâmetro da coluna
130
Unidade II
Em relação ao comprimento da coluna, Harris e Lucy (2017) apresentam a figura que segue, 
mostrando que o aumento no comprimento da coluna também favorece a melhor separação dos picos. 
Tempo (min)
2,0
60 m30 m15 m
2
2
2
1 1
1
3 3
3
4 4
4
Re
sp
os
ta
 d
p 
de
te
ct
or
 →
4,0 7,51,5 3,5 7,03,0 6,5
Tempo (min) Tempo (min)
Figura 88 – Variação na resolução dos picos devido ao aumento no comprimento da coluna
A alta eficiência (grande número de pratos teóricos, N) das colunas capilares permite picos “muito 
finos”, além de eliminação no alargamento de picos devido a irregularidades do recheio. Como exemplo, 
a figura a seguir apresenta um cromatograma da separação de uma mistura contendo diversos alcoóis 
em coluna capilar recoberta com polidimetilsiloxano.
min14
14
15
16
8
8
2
2
13
13
Alcoóis
7
7
1
1
12
12
6
6
0 11
11
5
5
10
10
4
4
9
9
3
3
Figura 89 – Cromatograma de separação de mistura de alcoóis em coluna capilar recoberta com polidimetilsiloxano
As colunas capilares podem ser feitas de níquel, sílica fundida, vidro Pirex®, aço inox, Nylon® ou 
quartzo. Podem apresentar diâmetros internos como 0,15, 0,32, 0,53 e 0,75 mm e comprimentos de 1 a 100 m. 
Enquanto as colunas recheadas podem ser preenchidas em laboratório, esvaziadas e reaproveitadas, as 
131
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
colunas capilares devem ser compradas prontas no comércio. Seu custo é relativamente elevado quando 
comparado ao custo das colunas empacotadas e precisam ser escolhidas cuidadosamente. 
Comparadas com as colunas empacotadas, as colunas capilares oferecem: maior resolução; menor 
tempo de análise; maior sensibilidade; e menor capacidade de amostra.
As colunas capilares evoluíram e se diversificaram, e hoje um grande número de colunas está 
disponível. Com o desenvolvimento dessas colunas e seu uso generalizado, um número maior de colunas 
pode ser encontrado, o que gera dúvidas em relação à escolha, que deve ser regida pelo tipo de análise, 
fase estacionária, tipo e propriedades da amostra, entre outros parâmetros. 
Mendham et al. (2002) dão as seguintes indicações para auxiliar na escolha da coluna capilar:
• Semelhantes separam semelhantes: esse conceito é adequado para as colunas capilares, mas 
como sua resolução é muito grande, a fase correta é de escolha menos crítica. Muitos materiais 
não polares podem ser separados em fases não polares, e diversos materiais polares em uma fase 
polar geral.
• Colunas longas têm tempos longos de eluição e alta resolução: mas o tempo de eluição e o 
custo também crescem. 
• Menor diâmetro leva a maior eficiência: a eficiência das colunas aumenta consideravelmente 
quando o diâmetro interno da coluna diminui. 
• Espessura do filme da fase estacionária: inicialmente a espessura do filme era da ordem de 
1 µm porque espessuras maiores tornam instável o filme, dando origem a pequenas poças 
de líquido e perda de fase estacionária por arrasto (sangria) quando a coluna está em uso. Nas colunas 
mais modernas, se pode ligar quimicamente a fase estacionária ao suporte e utilizar variadas 
espessuras de filme.
Fases estacionárias
Na cromatografia gasosa, conhecida como cromatografia gás-líquido, as fases estacionárias (FE) 
são líquidos depositados sobre a superfície de sólidos porosos inertes (suportes) ou de tubos finos de 
materiais inertes (colunas capilares). As fases estacionárias interagem com o analito, sendo as principais 
responsáveis pela sua separação dentro da coluna.
O fenômeno físico-químico responsável pela interação entre o analito e a fase estacionária líquida 
é a absorção (partição). A absorção acontece no interior do filme de FE líquida e é um fenômeno 
intrafacial. O aumento da absorção ocorre com:
• filmes espessos de FE líquida; 
• interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade); 
132
Unidade II
• grande superfície líquida exposta ao gás de arraste.
Normalmente, a FE líquida é ligada quimicamente ao suporte sólido ou apresenta ligações cruzadas 
para minimizar a sua perda por volatilização. Às vezes, a FE líquida apresenta tanto as ligações 
entrecruzadas como a ligação química com o suporte. 
A) 
B) 
Figura 90 – Cadeias poliméricas entrecruzadas da fase estacionária (A) 
e cadeias poliméricas de fase estacionária quimicamente ligadas (B)
A ligação e o entrecruzamento são importantes pois permitem aumentar a durabilidade da fase 
estacionária, que poderia se perder por arrasto (“sangria”) durante o uso da coluna. 
A fase estacionária escolhida deve ser seletiva, e ter características tanto quanto possível próximas 
daquelas dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático etc.). Além disso, as seguintes 
características são desejáveis para uma fase estacionária ideal:
• Ampla faixa de temperaturas de uso: proporciona maior flexibilidade na otimização da separação.
• Boa estabilidade química e térmica: fase estacionária não reage com os componentes da 
amostra e proporciona à coluna maior durabilidade.
• Pouco viscosa: baixa viscosidade permite melhor transferência do analito entre as fases. 
• Disponível em elevado grau de pureza: importante para permitir a reprodutibilidade do 
desempenho da coluna; não haverá a presença de “picos fantasmas” cromatogramas. 
Mendham et al. (2002) reportam que, em grande parte, as fases estacionárias líquidas podem ser 
grupadas em não polares, de polaridade média e polares. Harris e Lucy (2017) indicam que a escolha da 
fase estacionária líquida é baseada na regra “semelhante dissolve semelhante”. Ou seja, pode-se dizer 
que as colunas apolares são melhores para os solutos apolares. Colunas de polaridade intermediária 
são melhores para solutos de polaridade intermediária. Colunas fortemente polares são melhores para 
solutos fortemente polares. Fases estacionárias ligadas quirais (opticamente ativas) são utilizadas 
para a separação de isômeros ópticos.
De acordo com Skoog, West e Holler (1996), as fases estacionárias polares apresentam grupos 
como —CN, —CO e —OH. As fases estacionárias do tipo hidrocarbonetos e os dialquil siloxanos são 
apolares, e as fases de poliésteres são altamente polares. Os analitos polares incluem os alcoóis, ácidos 
133
MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE ANÁLISES
e aminas; os de polaridade intermediária englobam os éteres,