Combinação de Enxertos de Células de Schwann e Exercícios Aeróbicos Aumentam a Regeneração do Nervo Isquiático

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Combinação de Enxertos de Células de Schwann e Exercícios Aeróbico Aumenta Regeneração do Nervo Isquiático
Aluna: Paula Cumaru
Introdução
Potencial regenerativo do Sistema Nervoso Periférico
Tratamento mais comum: enxerto de nervo autólogo >> muitas desvantagens
Novas estratégias para estimular crescimento axonal periférico:
Células de Schwann exógena
Tubo biodegradável
Treinamento em esteiras
Quanto mais rápido ocorre a regeneração, maior chances de reenervação do órgão alvo
OBJETIVO: testar a eficácia terapêutica da combinação desses tratamentos no reparo do nervo isquiático de camundongos após transecção
Métodos e Resultados
Animais: 32 machos de camundongo C57BL/6 divididos em 4 grupos:
DMEM: enxertos acelulares e sem treinamento em esteira
SC: enxertos com células de Schwann e sem treinamento em esteira
TMT: enxertos acelulares e com treinamento em esteira
TMT + SC: enxertos com células de Schwann e com treinamento em esteira
Células de Schwann foram isoladas e purificadas de outros C57Bl/6
Procedimento cirúrgico 
Exposição do nervo isquiático esquerdo e transecção no meio da coxa
Suturação do tubo de PCL ou colágeno no coto proximal
Adição do respectivo enxerto em cada grupo e suturação do coto distal 
Após 8 semanas, eutanásia por perfusão cardíaca.
Retirada do nervo isquiático regenerado com o tubo, L4 da medula espinal, L4 gânglio da raíz dorsal e músculos gastrocnêmios com posterior processamento para imunohistoquímica ou miscroscopia 
Treinamento em esteira
Uma semana de familiarização anterior a lesão
Inicio do treinamento três dias após a transecção
Dois períodos de 30 minutos contínuos de exercício com intervalo de 10 minutos para descanso, 3 vezes por semana durante 8 semanas
Animais dos grupos DMEM e SC em esteiras sem movimento pelo mesmo período de tempo
Análise Estatística
Todas as análises foram realizadas pelo programa GraphPad Prism 5.01
Dados apresentados com seus corespondentes desvios 
Valores p <0,05 foram considerados significantes
Terapias combinadas melhoram regeneração do nervo funcionalmente e morfologicamente
Secções semifinas revelaram a melhor organização no grupo TMT + SC
(A–D) Secções transversais semi-finas de nervos isquiáticos em regeneração. 
(E-H) Micrografia Eletrônica de Transmissão de nervos em regeneração. 
Aglomeradas de fibras nervosas em regeneração/células perineurium-like: cabeças de seta
Fibras mielinizadas: setas largas
Vasos sanguíneos/fibras não mielinizadas: setas finas
Núcleos de células de Schwann: asteriscos
Terapias combinadas melhoram regeneração do nervo funcionalmente e morfologicamente
Quantificação dos parâmetros morfológicos nos nervos em regeneração por fotografias em microscópio óptico e contagem por software
Área da mielina
Área do axônio
Área da fibra
Número de vasos sanguíneos
Razão-G: razão entre diâmetro do axônio e diâmetro da fibra 
Terapias combinadas melhoram regeneração do nervo funcionalmente e morfologicamente
Avaliação da função motora pelo “Sciatic Functional Index” toda semana após a cirurgia
Oscila de 0 (função motora normal) a -100 (perda total de função motora)
Terapias combinadas melhoram regeneração do nervo funcionalmente e morfologicamente
Teste global de mobilidade (GMT)
Regeneração dos axônios formou junções neuromusculares
Resultados funcionais e morfológicos sugerem que houve reenervação dos músculos alvos
Análise qualitativa das junções musculares por imunomarcação 
Vermelho: receptores acetilcolina marcados com a-bungarotoxina 
Verde: terminal nervosos marcados com NF200 (anti-neurofilamento)
Grupo TMT + SC com posicionamento mais correto entre terminais nervosos e placa motora
Tubos de policaprolactona: substrato indicado para a regeneração do nervo e degradado progressivamente in vivo
Observação de características ultraestruturais do tubo antes e depois da implantação por miscroscopia eletrônica
Células de Schwann transplantadas se reintegraram funcionalmente ao tecido
Avaliação da sobrevivência das células de Schwann por marcação do segmento distal do nervo isquiático
Vermelho: células de Schwann marcados por S-100
Azul: núcleo das células marcados por DAPI
Verde: células de Schwann GFP+
Imunomarcação por ouro revelou contato direto das células de Schwann com fibras mielinizadas
Linha pontilhada: limite do axônio
Linha tracejada: limite externo da fibra nervosa mielinizada pelas células de Schwann GFP+
Asterisco: RER das células de Schwann
Combinação das terapias aumentou os níveis de fatores tróficos in vivo
Análise dos níveis de fatores tróficos por anticorpos e quantificação pela razão entre área marcada e total do campo
Marcação positiva in vitro para BNDF, NGF, NT-3 e NT-4 (vermelho)
Oito semanas após o transplante de células, o nervo isquiático, os gânglios da raíz dorsal e secções da medula espinal dos animais lesionados mostraram imunoreatividade para todos os fatores tróficos.
Combinação das terapias aumentou os níveis de fatores tróficos in vivo
Análise dos níveis de fatores tróficos por anticorpos e quantificação pela razão entre área marcada e total do campo
Marcação positiva in vitro para BNDF, NGF, NT-3 e NT-4 (vermelho)
Oito semanas após o transplante de células, o nervo isquiático, os gânglios da raíz dorsal e secções da medula espinal dos animais lesionados mostraram imunoreatividade para todos os fatores tróficos.
Terapias influenciam a sobrevivência neuronal
Quantificação dos neurônios motores e sensoriais 8 semanas após a lesão
os tratamentos SC e TMT + SC protegem neurônios motores da morte celular
o tratamento com TMT foi mais efetivo na proteção de neurônios sensoriais que o tratamento com SC ou TMT + SC
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Discussão
Discussão
Necessidade de desenvolvimento de novas terapias e combinação de diferentes estratégias otimizam o processo de regeneração
A combinação feita pelo estudo resultou em:
Aceleramento do processo regenerativo do nervo isquiático
Aumento do número de fibras mielinizadas e da área de mielina 
Aumento da recuperação da função motora
Mais fibras na Razão-G apropriada (indica a mielinização apropriada para o potencial de ação)
Melhor organização estrutural dos terminais motores nervosos, sugerindo uma reenervação mais eficiente do músculo gastrocnêmio, confirmada pela análise qualitativa da morfologia das junções neuromusculares. 
Grupos DMEM, TMT e SC com junções expandidas e desorganizadas, além de deficiência em NF-200, que impede o correto endereçamento de vesículas pré-sinápticas para placa motora
Discussão
Tubos de policaprolactona ou colágeno como uma alternativa promissora ao enxerto de nervo autólogo:
Substratos adequados para a adesão e o crescimento das fibras
Taxa de biodegradação adequada e consistente com resultados prévios
Terapia com células de Schwann exógenas 
Principal célula de suporte e, em terapia, atua tanto no SNC quanto no SNP
Produção de fatores tróficos
Discussão
Células de Schwann exógenas podem ser reconhecidas como nativas ao tecido:
Mostrado pela primeira vez
Formam bainha de mielina ao redor do nervo em regeneração
Retículo Plasmático Rugoso proeminente, indicando que permaneceram ativas e provavelmente secretam proteínas
Reintegração traz vantagem sobre outras terapias com bases celulares
Primeiras evidências de que o treinamento em esteira tem efeito positivo direto, quando combinados com a terapia tubo – celular, na regeneração de nervo periférico após transecção completa.
Discussão
O que explica o sucesso das terapias combinadas:
Secreção de neurotrofinas como BNDF, NGF, NT-3 e NT-4 pela presença de células de Schwann e pelo estímulo do exercício (upregulation)
Promovem regeneração axonal e de neurites e reenervação dos órgãos alvos
Regulam a sobrevivência neuronal: grupo DMEM com redução substancial de neurônios motores e sensoriais 
O que precisa para passagem a estudos clínicos:
Desenvolvimento de protocolode expansão de células de Schwann em cultura
Desenvolvimento de protocolo individualizado e para cada tipo de lesão do treinamento em esteira
Estudo comprova que a combinação dessa terapia é uma estratégia promissora para promover a regeneração de nervos isquiáticos após lesão traumática em camundongos