Aula_04_DNA_recombinante

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DNA recombinante 
Nilce M. Martinez Rossi 
Depto de Genética 
Descobertas marcantes 
1961 
Marmur e Doty 
Renaturação do DNA 
1966 
Niremberg, Ochoa e Khorana 
Elucidaram o código genético 
1962 
Arber, Nathans e Smith 
Enzimas de restrição 
1967 
Martin Gellert 
DNA ligase 
1972 
Boyer, Cohen e Berg 
Clonagem Molecular 
Descobertas marcantes 
1975-1977 
Sanger e Gilbert 
Sequenciamento de DNA 
1987 
Kary Mullis 
Reação em cadeia da 
polimerase (PCR) 
1990 
Lançamento do Projeto 
Genoma Humano 
2001 
 
2001 Conclusão do projeto genoma humano 
DNA recombinante: é um conjunto 
de técnicas moleculares 
 
• Possibilita a combinação de DNA de 
espécies diferentes (produção de 
produtos, sequenciamento de DNA) 
 
• Facilita diagnósticos, investigação de 
paternidade e a medicina forense. 
 
Biotecnologia 
Como estudar DNA de um 
organismos complexo como o 
humano? 
 
O DNA foi clivado em fragmentos 
menores através de enzimas de 
restrição 
 
 
Enzimas de restrição e seus sítios de clivagem 
Enzima de restrição EcoRI atuando 
num plasmídio (vetor) 
Enzima EcoRI 
atuando no DNA 
genômico de 
qualquer espécie 
Plasmídio quimera 
ou recombinante 
((Human) 
Biblioteca 
genômica 
Eletroforese dos plasmideos 
contendo os insertos de DNA 
Biblioteca genômica ou 
de DNA 
É o conjunto de bactérias, cada uma 
com um plasmídeo contendo parte do 
genoma de um organismo 
Exemplo: Biblioteca genômica humana 
Vetores para Clonagem 
Molecular 
Plasmídios 
 
Bacteriófagos 
 
Cosmídios (plasmídio + bacteriófago) 
 
Cromossomo artificial de levedura (YAC) 
Como identificar o clone de 
interesse numa biblioteca 
genômica? 
É necessário fazer uma triagem 
dos clones usando uma molécula 
sonda (se pareia com uma 
sequência alvo). 
Como obter estas sondas 
moleculares? 
• Sequência do mesmo gene clonado 
em outra espécie 
 
• Síntese de oligonucleotídeo a partir 
da sequência proteica 
Obtenção de uma sonda de DNA 
a partir da sequência proteica 
Sonda radioativa 
Hibridação 
com sonda 
molecular 
Qual o destino do DNA 
clonado? 
• Expressão para fins comerciais: vacinas, 
hormônios, insulina, etc. 
• Estudo de expressão gênica: em que 
condições ou tecidos o gene se expressa. 
• Sequenciamento, Projetos genoma. 
• Diagnóstico: comparação com o alelo 
responsável por uma doença genética. 
Insulina: É um hormônio que promove a 
entrada de glicose nas células. 
• A insulina pode ser 
extraída do pâncreas do 
boi ou do porco. Ou uma 
molécula idêntica a 
insulina humana pode ser 
obtida por biotecnologia 
(DNA recombinante). 
Exemplo de aplicação de DNA recombinante: 
Síntese de insulina 
humana por tecnologia 
do DNA 
recombinante. 
 
Primeira proteina 
humana sintetizada 
em bactéria que foi 
aprovada para uso 
humano 
Sequenciamento 
de DNA 
Ligação fosfodiester 
SEQUENCIAMENTO DE DNA 
 (Sanger 1977) 
3´ ----- GAATGCTAATCCG ---------- 5´ DNA A SER 
SEQUENCIADO 
5´ ----- CTTAC 
PRIMER DNA pol I 
dATP dTTP dCTP dGTP 
ddATP 
3´ ----- GAATGCTAATCCGT ---------- 5´ 
5´ ----- CTTACGATTA 
3´ ----- GAATGCTAATCCGT ---------- 5´ 
5´ ----- CTTACGA 
(Iniciador) 
DNA pol + 
A+T+C+G 
+ 
ddA 
DNA pol + 
A+T+C+G 
+ 
ddT 
DNA pol + 
A+T+C+G 
+ 
ddC 
DNA pol + 
A+T+C+G 
+ 
ddG 
A T C G 
CACAGTC ...... 
Gel de 
sequenciamento 
Sequenciamento automático 
Sequenciamento automático de DNA 
Reação em cadeia da polimerase 
 
PCR 
PCR: obter várias cópias de um fragmento 
de DNA de interesse 
Termociclador: para as reações de PCR 
Aplicação do PCR para investigação 
de paternidade 
 Identificação de mutações pontuais através 
da eliminação/criação de sítios de restrição 
Genética Médica 
Thompson & Thompson 
 
Capítulo: Ferramentas da 
Genética Molecular Humana 
 
Questões 
 
Quais os 2 métodos mais comuns para se obter 
um determinado DNA em larga escala? 
 
 
 
 
 
 
Faça um esquema de uma eletroforese separando os 
fragmentos obtidos após digestão do DNA acima com as 
enzimas PstI e BglII, separadamente e em conjunto. Os 
fragmentos acima tem a mesma sequência de DNA. 
A figura ao lado mostra a 
mutação que ocasiona a 
anemia falciforme e a 
consequente perda do sítio 
de restrição da enzima MstI. 
 
Baseado nestas informações 
como seria interpretado o 
resultado do gel para cada 
um dos membros da família? 
1,3 
1,1