DESENVOLVIMENTO DE UM CREME A BASE DO EXTRATO METANÓLICO DO PSEUDOFRUTO DA Anacardium occidentale L. COM AÇÃO CICATRIZANTE, ANALGÉSICA E ANTI-INFLAMATÓRIA

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PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DISCIPLINA: PRODUÇÃO DE FITOTERÁPICOS
Anderson Wilbur Lopes Andrade
TERESINA – PI
2015
DESENVOLVIMENTO DE UM CREME A BASE DO EXTRATO METANÓLICO DO PSEUDOFRUTO DA Anacardium occidentale L. COM AÇÃO CICATRIZANTE, ANALGÉSICA E ANTI-INFLAMATÓRIA
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 INTRODUÇÃO
Anacardium occidentale L.
Anacardium occidentale L. da família Anacardiaceae é uma planta nativa da África e tem uma grande importância sócio-econômica para a região Nordeste do Brasil.
Diferentes partes da planta Anacardium occidentale (folha, caule, fruto e pseudofrutos) tem sido empregada tradicionalmente pela população no tratamento de distúrbios do trato geniturinário, sistema nervoso central e do tecido musculoesquelético, lesões, envenenamento e outras doenças, tais como doenças infecciosas e parasitárias e diabetes.
Isto se deve a suas propriedades anti-inflamatória, analgésica, cicatrizante, antidiabética, diurética, expectorante, antimicrobiana, anti-hemorrágica, dentre outras.
Melo et al., 2011; Dionísio et al., 2015; Saraiva et al., 2015
 INTRODUÇÃO
O caju é composto do pedúnculo desenvolvido que está ligado à castanha (fruto real composto de casca e de miolo). 
O pedúnculo representa a parte comestível e é usado para preparar sucos, polpa e conserva
Além da presença habitual de açúcares, minerais e ácidos orgânicos, uma característica importante do caju é o seu elevado teor de fenóis, tais como os ácidos anacárdicos.
Estes compostos têm recebido grande atenção por pesquisadores e empresas farmacêuticas, devido a sua participação na prevenção de doenças importantes com dano tecidual e inflamação.
Melo et al., 2011; Dionísio et al., 2015; Saraiva et al., 2015
Levantamento científico de alguns propriedades biológicas da Anacardium occidentale nos Bancos de Dados: Science Direct, PubMed, Web of Science, Scopus e Periódicos CAPES
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Levantamento Tecnológico do Anacardium occidentale nos Bancos de Dados de Patentes:
INPI, EPO, WIPO e USPTO
Emulsão – fotoproteção
Gel – Para acne extrato alcoolico
Suplementos nutricionais
Hipertensao
Diabetes
Metodos de extração
Cajuina
Transgênico
antimicrobiana
Modulação genica 
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Cultura de células da glia retiradas do córtex cerebral de ratos neo-natos Sprague-Dawley 
Determinação de prostagladina E e citocinas pro-inflamatórias (IL -6 e TNF-α).
Todos os valores são médias ± E.P.M. (triplicata). Os dados foram analisados utilizando-se one-way ANOVA seguido do pós-teste Student Newman-Keuls. *p < 0,05 em comparação com controle positivo (LPS).
Caule metanol
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Cultura de células da glia retiradas do córtex cerebral de ratos neo-natos Sprague-Dawley 
Determinação indireta de óxido nítrico e Fator Nuclear - κB.
Todos os valores são médias ± E.P.M. (triplicata). Os dados foram analisados utilizando-se one-way ANOVA seguido do pós-teste Student Newman-Keuls. *,# p < 0,05 em comparação com controle positivo (LPS).
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Expressão genica 
SISTEMA IMUNOLÓGICO
LIBERAÇÃO DE MEDIADORES 
PRÓ-INFLAMATÓRIO 
Interleucina - IL-6 e Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), Prostaglandina E, Óxido nítrico (NO2).
FATOR NUCLEAR kapa β (NF-kβ) 
COX-2 
+
ÓXIDO NÍTRICO SINTASE INDUZIVÉL (iNOS)
Lipopolissacarídeo
(LPS) 
Anacardium occidentale
Anacardium occidentale
Anacardium occidentale
INFLAMAÇÃO
Ação anti-inflamatória
A inflamação é uma resposta protetora para uma variedade de fatores, tais como, danos físico-químicos, reações imunológicas, infecções microbianas, toxinas, hipóxia, e danos nos tecidos [23]. A resposta inflamatória é um processo complexo que inclui a ativação de células do sangue e a liberação de mediadores pró-inflamatório do sistema imunológico, dentre estas as citocinas interleucina - IL-1, IL-6, IL-12, IL-18, Fator de necrose tumoral (TNF), Interferon gama (IFN-γ) e fator estimulante de colônias granulócitos e macrófagos (GM-CSF).
O fator nuclear kapa β (NF-kβ) é um fator de transcrição e desempenha um papel importante na resposta inflamatória através da regulação das expressões de vários genes que codificam para as citocinas pró-inflamatórias, moléculas de adesão, quimiocinas, fatores de crescimento, enzimas indutoras, tais como a COX-2 e indutores da síntese do óxido nítrico (iNOS), que estimulam a produção dos mediadores pró-inflamatórios.
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Ratos Swiss foram divididos aleatoriamente em quatro grupos de 10 animais cada grupo.
Grupo 1 0,2 mL de água (controle negativo)
Grupo 2 0,2 mL de suplemento nutricional (Decubital®, Nuteral) (controle positivo)
Grupo 3 0,2 mL de suco de caju maduro (RCAJ)
Grupo 4 0,2 mL de suco de caju verde (UNCAJ)
uma única ferida foi feita através da excisão cirúrgica da pele de 1cm2 no região dorsal de cada rato (dia 0).
gavagem durante 21 dias
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UNCAJ - levou a um melhor equilíbrio antioxidante favorecendo o processo de cicatrização, possivelmente pelo aumento da angiogênese.
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EFEITO CICATRIZANTE DO SUCO DO CAJU
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AVALIAÇÃO DA PROPRIEDADES ANALGÉSICA EM RATOS APÓS A ADMINISTRAÇÃO ORAL 
Contorção induzida por ácido acético (0,2 mL a 3% ): Foi observado o n° de contorções (5 e 15min)
Teste de retirada da cauda: 5cm da cauda dos ratos foi imersa em água quente mantida a 55±10°C e o período de reflexo de retirada da cauda foi feita em 0, 15, 30, 60 e 90min.
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O efeito analgésico dos extratos está intimamente relacionado e semelhante ao observado – pentazocina e pode ser devido à presença de alcaloides presentes no extrato que atua através de receptores opióides. 
pentazocina é um analgésico opióide potente 30 mg
O efeito analgésico dos extractos está intimamente relacionado, e semelhante à observada em pentazocina, um análogo de morfina, e pode ser devido à presença de alcalóides presentes no extracto que actua através de receptores opióides 
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Na toxicidade aguda após os 14 dias de tratamentos os animais não apresentaram nenhum sinal de toxicidade. 
Na toxicidade crônica (30 dia de tratamento) os dados sugerem que doses inferiores a 300 mg / kg não causou efeitos adversos em ratinhos. Porém nas doses maiores (600 e 1000mg/Kg) observou-se alterações significativas no peso e nos resultados hematológicos dos animais.
Os cortes histológicos dos pulmões, coração, fígado, rim, baço e pâncreas não revelou anormalidades histológicas por microscópico analisa.
Foi realizada uma análise de mutagenicidade na dose inferior a 300 mg/kg. Os resultados mostram que o tratamento nas dose inferiores a 300mg/kg não aumentou a frequência de micronúcleos quando comparado com um controle positivo.
mutagenic effect by the
Salmonella/microsome 
(His-) 
Resolução nº 90 de 16/03/2004 / ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária:
"GUIA PARA A REALIZAÇÃO DE ESTUDOS DE TOXICIDADE PRÉ-CLÍNICA DE FITOTERÁPICOS"
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10g da castanha e a fibra do caju passaram por processo de extração duas vezes (3 h) com hexano em Soxhlet para remover lípidos. Após a secagem, foram ainda extraída (3x/3h) com metanol. Em seguida o extrato passou por um processo de liofilização.
Determinação Compostos fenólicos in vitro: no extrato metanólico do caju - 353,6g/kg
Caracterização por métodos espectroscópicos: Espectroscopia no Infravermelho (IV), Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa (CG-EM), Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). 
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Ácidos anacárdicos
Cardanol
Cardol
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1kg do extrato metanólico do pseudofruto de A. occidentale ----- 353,6g de compostos fenólicos
Formulação: extrato do pseudofruto da A. occidentale a 0,1% 
 100mg de extrato que equivale a 0,03536g de compostos fenólicos
Proposta: CREME O/A
Compostos presente no extrato são hidrofóbicos (logP = 7-9)
FORMULAÇÃO PROPOSTA
1 º A administração tópica é eficaz e com menores feitos sistêmicos. A escolha do creme deve-se pela consistência necessária à fixação do medicamento e consequentemente do fármaco por mais tempo nolocal de ação, além de permitir maior de penetração do ativo na pele. 
2º Fornece um meio propício á incorporação de fármacos lipofílicos, inviável na forma farmacêutica gel. 
3º Possui boa aceitação do paciente, haja visto que este é evanescente e forma uma delgada camada oleosa na superfície da pele, diferente da pomada.
JUSTIFICATIVA:
Evanescente - desaparece
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1kg do extrato metanólico do pseudofruto de A. occidentale ----- 353,6g de compostos fenólicos
Formulação: extrato do pseudofruto da A. occidentale a 0,1% 
 100mg de extrato que equivale a 0,03536g de compostos fenólicos
Proposta: CREME O/A
Compostos presente no extrato são hidrofóbicos (logP = 7-9)
FORMULAÇÃO PROPOSTA
Principal Indicação:
Creme para recomposição cutânea, indicado no tratamento e cicatrização de feridas cutâneas abertas e queimaduras, independente da etiologia.
Evanescente - desaparece
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TUBO CONTENDO 100g - EMBALAGEM PLÁSTICA E OPACA
O creme do tipo O/A à ser preparado corresponde a uma diadermina. 
As diaderminas são um tipo de creme oleoso-aquoso, que pela sua fórmula se manifestam altamente penetrantes.
Método de preparo: direto (verter a fase interna na externa sob agitação constante, a uma mesma temperatura (65 – 75°C).
Sistema emulsionante
Constituído por moléculas com características anfifílicas, isto é com uma parte polar, atraída pela água ou outros líquidos polares, e uma parte apolar, preferencialmente atraída por componentes apolares ou oleosos.
Estes compostos reduzem a tensão interfacial, dando lugar a emulsões A/O ou O/A, consoante as suas tendências lipófila ou hidrófila. Esta tendência é dada pelo valor do Equilíbrio Hidrófilo-Lipófilo (EHL).
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TUBO CONTENDO 100g - EMBALAGEM PLÁSTICA E OPACA
Glicerina: com elevado poder umectante - evitar a perda de água da pele por evaporação conjunta com fase aquosa do creme (hidratação) além de aumentar o poder de penetração da substância ativa
Trietanolamina: agente emulsificante - reduzem a tensão interfacial das fases A e O – favorece a emulsão e impede a inversão das fases.
Ácido Esteárico (Fase oleosa): não deixa um resíduo macroscopicamente detectável e não são pegajosos nem gordurosos - estão relacionados com uma sensação agradável para o consumidor.
é mais indicada para fórmulas O/A com pH de aproximadamente 8, pois é um tensoativo aniônico, ou seja, precisa sofrer ionização (favorável em meio aquoso), e o pH tem que ser básico para que sofra ionização, formando o ânion.
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Sensibilização dérmica: se caracteriza por uma reação imunológica geralmente exacerbada.
2. Irritação cutânea (primária e cumulativa): Consiste na aplicação única do produto a ser testado no dorso do animal. 
AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA DE MEDICAMENTOS FITOTERÁPICOS DE USO TÓPICOS
Além testes de toxicidade in vitro e in vivo efetuados, segundo Resolução nº 90 de 16/03/2004 da ANVISA deve-se realizar os seguintes testes adicionais, com base na OCDE/404 de 2002:
DETECTAR SINAIS DE ERITEMA E EDEMA
Observar alterações cutâneas: 
detectar se uma determinada substância apresenta potencial de sensibilização, o que se caracteriza por uma reação imunológica geralmente exacerbada
. Teste realizado com doses/concentrações que não causam nenhum grau de irritação dérmica, quando a substância testada é irritante.
Irritação Ocular Primária
Consiste na aplicação única do produto no saco conjuntival de coelhos, com observações da evolução das lesões em 24, 48, 72 horas e 7 dias após a instilação. São graduadas as alterações de conjuntiva (secreção, hiperemia e quimose), íris (irite) e córnea (densidade e área de opacidade).
Sensibilização Dérmica
São realizadas aplicações tópicas da menor dose não irritante por um período de 3 semanas (fase de indução). Após um período de repouso, procede-se à aplicação tópica da maior dose não irritante (fase de desafio). As reações são graduadas segundo escala específica, com a finalidade de avaliar o potencial de sensibilização. Para ensaios de sensibilização dérmica maximizada, segue-se o mesmo procedimento, porém, com aplicações subcutâneas de adjuvante completo de Freund, para exacerbar a resposta imune
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AVALIAÇÃO CLÍNICA DE MEDICAMENTOS FITOTERÁPICOS DE USO TÓPICOS
Compreende ao primeiro estudo em seres humanos. Realizado em pequenos grupos de voluntários sadios. Avaliação preliminar da segurança e perfil farmacocinético e farmacodinâmico.
Estudo terapêutico piloto – objetiva demonstrar a atividade e estabelecer a segurança a curto prazo do ativo em pacientes e as relações dose-resposta
Estudo terapêutico ampliado – estudos em grande e variados grupos de pacientes – determinar o risco/benefício a curto e longo prazo. Observar o tipo e o perfil das reações adversas e fatores que interferem no efeito farmacológico ligados aos indivíduos.
Farmacovigilância – realização de pesquisas e registros de efeitos adversos após a comercialização de produtos.
FASE I
FASE II
FASE III
FASE IV
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MARCADORES: compostos fenólicos
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Cromatografia Gasosa Acoplada a Espectrometria de Massa (CG-EM)
Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Espectroscopia no Infravermelho (IV)
Ácido anacárdios 
Cardanol
Cardol
Determinação in vitro de compostos fenólicos
CONTROLE DE QUALIDADE
RDC Nº 210/2003 e Nº 17/2010 (ANVISA)
Testes de Pureza das partes da planta a ser utilizada:
Cinzas Totais
Conteúdo de Água
Metais pesados
Testes de Limites Residuais
Solventes residuais utilizados na extração - toxicidade e degradação. (RDC Nº 58, DE 20 DE DEZEMBRO DE 2013).
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Análise organoléptica
Os caracteres organolépticos - detectar alterações - odor, cor e homogeneidade.
Avaliação do pH
A pele tem normalmente um pH médio de 5,5, embora este valor possa variar ligeiramente consoante as diferentes zonas do corpo.
CONTROLE DE QUALIDADE
Ensaios reológicos
Investigar a consistência (viscosidade) - afeta diretamente a facilidade com que a preparação se remove do tubo em que se acondiciona, bem como a facilidade com que se espalha e adere à zona de aplicação.
Viscosímetro de Brookfield
pHmetro
CONTROLE DE QUALIDADE
Análise da textura e espalhabilidade
A textura e espalhabilidade - realiza-se o teste da penetração, no qual uma sonda penetra na amostra a uma determinada velocidade e a uma distância pré-definida, voltando depois para uma posição a uma distância pré-determinada acima da superfície da amostra.
Texturômetro
Análise microbiana
Doseamento
Perda de peso
Ensaio de estabilidade
CONTROLE DE QUALIDADE
RE n°1 de 29 de julho de 2005
Finalidade: Estipular o prazo de validade do produto, bem como verificar possível incompatibilidades entre os constituintes da formulação ou entre a formulação e a embalagem
Devido na literatura não dispor de dados sobre a sensibilidade a luz deve-se avaliar a possível degradação do produto mediante a exposição à luz ultravioleta. 
A centrifugação gera estresse na preparação porque são criadas condições que simulam um aumento da força da gravidade, o que permite antecipar possíveis alterações de estabilidade.
Estas alterações podem ser observadas sob a forma de precipitados, ocorrência de separação de fases, formação de sedimentos compactos (caking), coalescência, floculação entre outros.
As amostras são centrifugadas a temperatura, tempo e velocidade padronizados e depois são verificadas, visualmente.
Ensaio de estabilidade acelerada por centrifugação
CONTROLE DE QUALIDADE
centrifugação
observar
sedimentação
coalescência
separação
RE n°1 de 29 de julho de 2005
VALIDAÇÃO
Todas as metodologias analíticas referentes à qualidade do medicamento fitoterápico e destinadas ao registro sanitário desse produto deverão ser oficialmente ser reconhecida no país por meio de sua validação conforme disposto na RE n° 899/2003 (ANVISA), que dispõe sobre validação de métodos bioanalíticos, ou em suas atualizações.
Especificidade 
Curva de calibração/ LinearidadePrecisão
Exatidão
Robustez
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DOCUMENTAÇÃO NECESSÁRIA PARA SOLICITAR REGISTRO DE MF NA ANVISA - RDC nº 26/2014.
OBRIGADO!!!