Anticorpos Monoclonais: Citometria de Fluxo

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Anticorpos Monoclonais
Citometria de Fluxo
Curso: Farmácia
Disciplina: Imunologia Clínica
Anderson Wilbur Lopes Andrade
TERESINA 
2013
ANTICORPOS MONOCLONAIS
Os bioquímicos, em busca de uma preparação homogênea de anticorpos (Ac), voltaram-se inicialmente a estudar as proteínas produzidas por pacientes com mielomas múltiplo (tumor comum de células plasmáticas) afim de analisar a estrutura química dos Ac.
 Já se sabia que os Ac eram normalmente produzidos por células plasmáticas e, como o miolema múltiplo está associada à presença de grandes quantidades de proteína do mieloma no soro dos pacientes, estas proteínas serviam como modelo para moléculas normais de Ac. 
INTRODUÇÃO
ANTICORPOS MONOCLONAIS
Esses estudos demonstraram que os Ac monoclonais poderiam ser obtidos de células plasmáticas, entretanto, a especificidade antigênica da maioria das proteínas do mieloma era desconhecida, o que limitava sua utilidade. 
INTRODUÇÃO
Este problema foi resolvido por Georges Kohler e Cesar Milstein, que desenvolveram uma técnica para produzir uma população homogênea de Ac com especificidade antigênica conhecida.
Georges Kohler 
Cesar Milstein
ANTICORPOS MONOCLONAIS
Isso foi possível com a fusão de células esplênicas de um camundongo imunizado com células de um mieloma, resultando em células híbridas, que tanto proliferam como secretam Ac específicos contra antígenos.
PRODUÇÃO
ANTICORPOS MONOCLONAIS
Após a fusão, as células híbridas são selecionadas com fármacos que matam a célula de mieloma, ao passo que as células esplências parenterais têm um tempo de vida limitado e logo morrem.
Como consequência, apenas as linhagens de células híbridas de mieloma sobrevivem - HIBRIDOMA
PRODUÇÃO
ANTICORPOS MONOCLONAIS
Hibridomas que produzem os Ac com especificidade desejada são identificados e clonados por novas culturas a partir de células isoladas.
Todas as moléculas de Ac produzidas são idênticas em estrutura inclusive seus sítios de ligação de antígeno (Ag) e isotipos.
Esses Ac são chamados de 
 ANTICORPOS MONOCLONAIS.
PRODUÇÃO
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ANTICORPOS MONOCLONAIS
Essa tecnologia revolucionou o uso de Ac ao permitir uma produção limitada de Ac com uma especificidade única e bem conhecida.
Entretanto, até hoje, apenas os Ac monoclonais de camundongos têm sido rotineiramente produzidos.
Tentativas para produzir Ac monoclonais humanos não tiveram muito sucesso até o momento.
PRODUÇÃO
ANTICORPOS MONOCLONAIS
COMPROENDEM:
Imunoensaios;
Diagnóstico de Neoplasias;
Tipagem Tissular;
Sorotipagem de Microorganismos;
Neutralização terapêutica de Citocinas Inflamatórias acoplados ao Ac antitumoral específico.
UTILIZAÇÕES:
ANTICORPOS MONOCLONAIS
Padronização única para todos os laboratórios no mundo;
Anti-soro utilizado em diferentes animais;
Superioridade sobre às estratégias convencionais na produção de Ac específicos para componentes individuais.
VANTAGENS COMO REAGENTE:
CITOMETRIA DE FLUXO
CITOMETRIA DE FLUXO
Os Ag da superfície celular podem ser detectados e localizados pela utilização de Ac marcados.
Como os Ac não conseguem penetrar prontamente nas células vivas, exceto por endocitose, o tratamento das células com Ac marcados a frio (minimiza a endocitose) leva à coloração apenas dos Ag de superfície.
INTRODUÇÃO
CITOMETRIA DE FLUXO
É uma técnica que permite medidas rápidas em partículas ou células enquanto elas passam uma a uma através de um sensor, sendo as medidas realizadas em uma partícula de cada vez e não como valores médios da população total.
DEFINIÇÃO
CITOMETRIA DE FLUXO
É possível corar células isoladas com vários fluorocromos diferentes e analisar as células em gotículas individuais, à medida que elas fluem através da seção de monitorização de um CITÔMERO DE FLUXO.
CITOFLUORIMETRIA DE FLUXO
CITOMETRIA DE FLUXO
Este equipamento é essencialmente, um FACS sem a capacidade de selecionar células.
Registra dados quantitativos relativos ao conteúdo do Ag de superfície e à natureza física de cada célula individual, com múltiplos parâmetros sendo avaliado por células para fornecer uma análise fenotípica em uma única célula em lugar de uma medida da população.
Não é um aparelho simples, sendo necessário uma conhecimento básico dos princípios de operação afim de se obter resultados precisos.
CITÔMERO DE FLUXO
CITOMETRIA DE FLUXO
Analisa eletronicamente os sinais gerados pelas células em suspensão, quando elas são interceptadas por uma feixe de luz que pode ser um laser ou uma lâmpada de arco voltaico, que forneça comprimento de onda específicos. 
CITÔMERO DE FLUXO
CITOMETRIA DE FLUXO
Conforme as células passam através do feixe de luz, promovem o espalhamento da luz em todas as direções, em um padrão que depende do seu tamanho, forma e estrutura.
As moléculas marcadas com fluorocromo são excitadas e fluorescem.
Essa interação entre as células e uma luz intensa permite realizar várias medidas de significado biológico.
CITÔMERO DE FLUXO
CITOMETRIA DE FLUXO
Permite medir vários parâmetros celulares simultaneamente e separar sub populações de células, por exemplo:
Podem-se empregar dois parâmetros de espalhamento de luz e três de imunofluorescência em cada célula, tornando possível avaliar determinadas populações celulares em misturas complexa.
CITÔMERO DE FLUXO
CITOMETRIA DE FLUXO
Têm sido cada vez mais numerosa. 
A conjugação de fluorocromos a ligantes e a Ac monoclonaise policlonais tem permitido o estudo da distribuição de determinantes antigênicos e receptores de células;
Permite também a identificação e separação de subpopulações celulares.
APLICAÇÃO E UTILIZAÇÃO
CITOMETRIA DE FLUXO
Os lasers utilizados na citometria de fluxo podem ser:
Atômicos (hélio-neônio);
Iônicos (Íon argônio ou criptônio);
Moleculares (hélio-cádmio);
Líquidos ou Sólidos;
Lâmpada de Mercúrio (menos utilizado).
FONTE DE LUZ 
CITOMETRIA DE FLUXO
Há um grande número de moléculas fluorescentes que podem ser empregadas para marcar as proteínas (Ac, Lectina, Avidina).
O fluoróforo mais comumente utilizado é o Isotiocianato de Fluoresceína 
MARCADORES – MOLÉCULAS FLUORESCENTES
Isotiocianato 
de Fluoresceína 
VANTAGENS: 
Alto coeficiente de absorção e emissão;
Encontra-se disponível conjugado a uma série de Ac;
Pico máximo de absorção próximo às linhas de emissão do laser.
CITOMETRIA DE FLUXO
Com Ac monoclonais e fluorocromos à mão, atualmente são possíveis análises extremamente detalhadas, com uma notável contribuição diagnóstica.
A penetração do Ac fluorescente no interior da célula permite a visualização das citocinas e de outras proteínas intracelulares.
Permite também, uma analise do ciclo celular pode com fixadores de DNA, como o Iodeto de Propídio – determina o conteúdo de DNA.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
REFERÊNCIAS
MURPHEY, K. et al. Imunobiologia 7º ed. Editora Artmed, Porto Alegre, 2010.
ROITT, I. M.; DELVES, P.J. Fundamentos de Imunologia 10º ed. Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2004.
FERREIRA, A.W.; ÁVILA, S. L. M. Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Auto-Imune 2ºed. Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2001. 
Obrigado!!!