Engenharia de células e tecidos- Ian Freshney, Culrure of animal cells

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Engenharia de células e tecidos ERE
O livro guia de cultivo celular pode ser acessado no link:
https://www.dropbox.com/s/kxo9ri06m8qzhqj/R.%20Ian%20Freshney%28auth.%29-Cult
ure%20of%20Animal%20Cells_%20A%20Manual%20of%20Basic%20Technique%20and%
20Specialized%20Applications%2C%20Sixth%20Edition-%20Wiley-Blackwell%20%282010
%29.pdf?dl=0
Ou baixado no Libgen
Ian Freshney, Culrure of animal cells
Semana 1
Capítulo 1
1- Quais são as vantagens do cultivo celular?
Uma das principais vantagens da cultura de células é a capacidade de manipular a pressão
físico-química (isto é, temperatura, pH, pressão osmótica, O2 e CO2) e o ambiente fisiológico (isto é,
concentrações hormonais e de nutrientes) em que as células se propagam
2- Quais são as limitações do cultivo celular?
Erros de identificação e eventos de contaminação cruzada podem ocorrer durante as atividades
laboratoriais.
3- Quais tipos de cultivo podem ser realizados?
Existem diversas formas de cultivo na prática da agricultura: plantio direto, rotação de culturas,
curvas de nível e afolhamento. Essa diversidade de técnicas existe em razão dos diferentes fins,
ora os agricultores priorizam a produtividade, ora priorizam a conservação dos solos.
Capítulo 2
4- Como as células se unem a outras células?
Através de receptores presentes na membrana celular específicos para moléculas da matriz
extracelular, a propagação é precedida pela secreção de proteínas da matriz extracelular e
proteoglicanos. A matriz se adere ao substrato carregado negativamente e as células se unem à
matriz pelos receptores.
Semana 2
1- Em que consiste a inativação do soro?
Originalmente, o aquecimento era usado para inativar o complemento para imunoensaios.
Frequentemente, o soro inativado pelo calor é usado porque da adoção de protocolo prévio, sem
qualquer evidência de que é benéfico. Afirma que a inativação por calor remove a micoplasma
são provavelmente infundados, embora o calor o tratamento pode reduzir o título de algumas
micoplasmas.
O soro é inativado por calor por incubação por 30 min a 56◦ C.
2- Defina meio condicionado.
É o meio que já produziu alguma célula, então apresenta moléculas secretoras que são especificas
para o cultivo. Uma combinação do substrato por constituintes da matriz extracelular, de
metabólitos e fatores de crescimento. O condicionamento do meio de cultura é necessário para o
crescimento e diferenciação liberado pelas células alimentadoras.
Capitulo 9
3- Quais são as desvantagens de utilizar soro nos cultivos celulares?
(1) Variabilidade fisiológica. O soro também contém uma ampla gama de componentes que
pode ter um efeito considerável no crescimento celular e resposta às substâncias de teste.
(2) Prazo de validade e consistência. O soro apresenta lotes de vencimento a pequeno prazo que
têm que ser substituídos e nem sempre são idênticos.
(3) Controle de qualidade. A questão da troca de soro necessita que haja muitos testes garantindo a
qualidade do material que vem substituir o lote anterior.
(4) Especificidade. Se mais de um tipo de célula for usado, cada tipo pode exigir um lote diferente de
soro, portanto, vários lotes devem ser mantidos na reserva simultaneamente. Co-cultura
diferentes tipos de células apresentarão um problema ainda maior.
(5) Disponibilidade. O soro apresenta oscilação na sua produção, já que depende de vários fatores.
Para utilizar o soro é necessário ter a consciência de sua oscilação de lotes e a possibilidade de
problemas na produção, podendo entrar em indisponibilidade.
(6) Processamento posterior. A presença de soro cria um grande obstáculo para a purificação do
produto e pode até limitar a aceitação farmacêutica do produto.
(7) Contaminação. O soro é frequentemente contaminado com vírus e bactérias podem afetar a
cultura de células
(8) Custo. Mais de 10 vezes o custo dos constituintes químicos
(9) Inibidores de crescimento. Bem como sua promoção de crescimento atividade, o soro contém
atividade inibidora do crescimento, e embora a estimulação geralmente predomine, a rede efeito
do soro é uma combinação imprevisível de inibição e estimulação da proliferação celular.
(10) Padronização. Padronização experimental e protocolos de produção é difícil, tanto em
momentos diferentes e entre diferentes laboratórios, devido às variações de lote para lote no
soro.
4- Quais são as vantagens dos meios livres de soro ou “sérum-free media”?
1 Definição de meio padrão; Por usar dados constituintes puros, o meio pode ser padronizado. Isso
não só permite uma validação mais fácil de processos industriais, como também possibilita que
os laboratórios de pesquisa possam replicar condições para repetir e confirmar os dados
experimentais.
2 Mídia Seletiva: Uma das principais vantagens do controle sobre a atividade de promoção do
crescimento proporcionada por meios isentos de soro é a capacidade para tornar um meio
seletivo para um determinado tipo de célula.
3 Regulação da Proliferação e Diferenciação: Com a capacidade de selecionar um tipo específico de
célula surge a possibilidade de mudar um meio que estimula o crescimento para propagação de um
meio indutor de diferenciação, alterando a concentração e os tipos de fatores de crescimento e
outros indutores.
5- Quais são as desvantagens de utilizar meios livres de soro nos cultivos celulares?
(1) Multiplicidade de mídia. Cada tipo de célula exige uma receita diferente. Embora este grau de
A especificidade pode ser uma vantagem para aqueles que isolam tipos de células, isso representa
um problema para os laboratórios que iniciam a manutenção de linhagens celulares de várias
origens diferentes.
(2) Seletividade. Algumas mídias podem selecionar uma sub-linhagem que não é típica de toda a
população, e mesmo em linhas celulares contínuas, algum grau de seleção ainda pode ser
necessário.
(3) Pureza do reagente. A remoção do soro também requer que o grau de pureza dos reagentes e da
água e o grau de limpeza de todos os aparelhos seja extremamente alto.
(4) Proliferação celular. O crescimento é frequentemente mais lento em produtos sem soro
mídia, e menos gerações são alcançadas com células finitas linhas.
Capitulo 10
6- Descreva um protocolo simples de esterilização de pipetas sorológicas de vidro?
Protocolo para esterilização
1. Coloque as pipetas nas latas de pipeta, etiquetadas com o tamanho das pipetas.
2. Encha cada lata com um tamanho de pipeta.
3. Encha algumas latas com uma variedade de pipetas de 1, 2, 10 e 25 mL
4. Prenda a fita indicadora de esterilização, ligando a tampa à lata e estampe a data na fita.
5. Esterilize com calor seco por 1 ha 160◦ C. Use a menor quantidade de fita possível ou substitua
por guias indicadoras de temperatura, que são pequenas e são feitas de material menos volátil. A
temperatura deve ser medida no centro da carga, para garantir que está, a parte mais difícil de
aquecer, atinja as condições mínimas de esterilização. Deixe espaços entre as latas ao carregar
o forno, para permitir a circulação de ar quente
. 6. Remova as latas de pipeta do forno, deixe esfriar e transfira para o laboratório de cultura de
tecidos. Se você prevê que as pipetas ficarão inativas por mais de 48 h, feche as latas em torno
da tampa com fita adesiva.
7- Quais métodos de esterilização podem ser aplicados aos materiais utilizados no cultivo celular?
Como a maioria das culturas de células agora é realizada em plástico descartável,
os principais requisitos para a limpeza de vidros são:
(1)o detergente ser eficaz na remoção de resíduos do vidro
(2) nenhum resíduo tóxico deve ser deixado para trás para lixiviar para o meio ou outros reagentes
9- Descreva um protocolo simples para a preparação de meio de cultivo em pó.
Procedimento
1. Adicione o volume apropriado de água ultrapura para recipiente.
2. Adicione um seguidor magnético.
3. Coloque o recipiente no agitador magnético e ajuste para em torno de 200 rpm.
4. Abra o pacote de pó e adicione o conteúdo lentamente para o recipiente enquanto mistura.
5. Mexa até o pó estarcompletamente dissolvido.
6. Verifique o pH e a condutividade de uma amostra e insira em registro: (a) o pH deve estar dentro
de 0,1 unidade do esperado nível para determinado meio. (b) A condutividade deve estar dentro
de 2% de valor esperado para determinado meio. (c) Descarte a amostra; não adicione de volta
ao principal estoque.
7. Esterilize por filtração
8. Tampe e sele os frascos.
9. Armazene a 4◦ C.
10. Adicione soro e glutamina e corrija o pH para 7,4 conforme necessário, imediatamente antes do
uso.
Capitulo 11
10- Defina cultivo primário.
Uma cultura primária é o estágio da cultura do primeiro isolamento das células, mas antes da
primeira subcultura, a qual se torna uma linha celular. Estas células são obtidas através de
desagregação mecânica ou enzimática. Esta forma de cultivo é muito utilizada para estudar o
comportamento de determinada célula in vitro, pois mantém as características genotípicas e
fenotípicas das células.
11- Quais enzimas se utilizam na desagregação de tecidos?
As enzimas usadas com mais frequência para a desagregação de tecidos são preparações brutas de
tripsina, colagenase, elastase, pronase, Dispase, DNase e hialuronidase, sozinhas ou em várias
combinações. Existem outras enzimas não mamíferas, também disponível para desagregação
primária. As preparações cruas costumam ser mais com sucesso do que as preparações de
enzimas purificadas. Isto é porque os primeiros contêm outras proteases como contaminantes;
esta última são, no entanto, geralmente menos tóxicos e mais específicos em sua ação. A
tripsina e a pronase fornecem as mais completas desagregação, mas pode danificar as células.
Colagenase e Dispase, em contraste, dá desagregação incompleta, mas são menos prejudicial.
Deve-se ter cuidado ao combinar enzimas pois alguns podem inativar outros.
12- Defina explante e descreva como a técnica é aplicada ao cultivo?
Diversas técnicas foram desenvolvidas para a desagregação de tecido isolado para cultura primária.
Explantes primários são adequados para quantidades muito pequenas de tecido;
A técnica de explante primária inicia uma cultura de tecidos. Um fragmento de tecido foi incorporado
no plasma sanguíneo ou linfa, misturado com soro heterólogo e extrato de embrião, e colocado
em um lamela invertida sobre uma lâmina de concavidade. O coagulo plasma segurou o tecido
no lugar, e o explante poderia ser examinado com um microscópio convencional. O heterólogo
coagulação do plasma induzido por soro e o extrato de embrião e o soro, juntamente com o
plasma, fornecem nutrientes e fatores de crescimento e migração celular estimulada do explante.
13- Descreva a técnica de desagregação enzimática e defina as principais diferenças com o
explante.
A desagregação enzimática do tecido evita problemas de seleção por migração e produz um maior
número de células que são mais representativas do tecido inteiro em menos tempo. Matriz
intercelular e embasamento de membranas contêm outras glicoproteínas, que são sensíveis e
às vezes podem ser degradadas.
Na prática, um experimento de teste preliminar pode ser necessário para determinar o
grau ideal para produção de células viáveis, como o equilíbrio entre a sensibilidade aos efeitos
tóxicos e a capacidade de desagregação podem ser difícil de prever. A atividade residual deixada
após a lavagem é neutralizada por soro do meio de cultura, ou por um inibidor de tripsina quando
meio sem soro é usado.
14- Descreva em que consiste a desagregação mecânica.
Assim como na desagregação enzimática, a mecânica evita problemas de seleção por migração e
produz um maior número de células que são mais representativas do tecido inteiro em menos
tempo. Como existe o risco de danos proteolíticos às células durante a digestão enzimática,
muitas pessoas optaram por usar desagregação mecânica, que funciona bem com tecidos moles
e alguns tecidos mais firmes quando o tamanho do rendimento viável não é importante, ou
células fracamente aderentes são removidas de um estroma mais fibroso.
Este procedimento dá a uma célula suspensão mais rapidamente do que a digestão enzimática,
podendo causar danos mecânicos.
Semana 4
Capítulo 14
1- Descreva as características da separação celular por gradiente de densidade.
A separação de células por densidade pode ser realizada por centrifugação com equipamento
convencional. As células sedimentam em um gradiente de densidade a uma posição de equilíbrio
equivalente à sua própria densidade. O meio de densidade deve ser atóxico e não viscoso em altas
densidades e deve exercer pouca pressão osmótica.
2- Descreva como acontece a separação celular por “beads” magnéticas.
A classificação magnética usa um anticorpo específico, criado contra uma célula
epítopo de superfície, conjugado com grânulos de ferritina ou microesferas. Quando a suspensão de
células é misturada com essas esferas e, em seguida, colocadas em um campo magnético, as
células que foram anexados são desenhadas ao lado da câmara de separação, sendo liberadas
quando a corrente é desligada e elas ser podem separadas por tripsinização ou pipetagem vigorosa.
3- Descreva a técnica de citometria de fluxo associada à separação celular.
Fluxo celular em D-PBSA entra no topo, e o líquido da bainha é injetado em torno do fluxo de células
para gerar um fluxo laminar dentro da câmara de fluxo. Conforme o fluxo de células sai da câmara,
ele corta um feixe de laser, e o sinal gerado aciona o eletrodo de carga, carregando assim o fluxo de
células.o fluxo então se divide em gotas, induzidas pelo transdutor de vibração de 15 kHz ligado ao
fluxo câmara. As gotículas carregam a carga brevemente aplicada ao fluxo de células de saída e são
desviadas pelas placas de eletrodo abaixo da câmara de fluxo. A carga é aplicada às placas com
suficiente atraso para permitir o tempo de trânsito desde o corte da viga até a entrada no espaço
entre as placas.
Capítulo 15
4- Em que consiste a autenticação de linhagens celulares?
A caracterização de uma linha celular é vital, não apenas para determinar sua funcionalidade, mas
também em provar sua autenticidade; Isso evita também a possibilidade de que uma linha celular
contaminada ou identificada incorretamente devido a rotulagem incorreta ou confusão no manuseio
não seja usada. Um processo de autenticação que é vital para a validação dos dados derivados
dessas células.
Capitulo 16
6- Que entende por desdiferenciação?
A desdiferenciação tem sido usada para descrever a perda do propriedades diferenciadas de um
tecido quando se torna maligno ou quando é cultivado em cultura. Como a desdiferenciação
compreende processos complexos com vários fatores contribuintes, incluindo morte celular,
supercrescimento seletivo e respostas adaptativas, o termo deve ser usado com cautela. Quando
usado corretamente, significa a perda por uma célula do específico propriedades fenotípicas
associadas à célula madura. Quando ocorre desdiferenciação, pode ser um processo adaptativo,
implicando que o fenótipo diferenciado pode ser recuperado dados os indutores corretos ou um
processo, o que implica que uma célula precursora foi selecionada devido ao seu maior potencial
proliferativo. Em ambos os casos a célula precursora pode ser induzida a amadurecer na célula
totalmente diferenciada ou mesmo reverter para uma célula-tronco dado o estímulo certo.
7- Qual a relação entre proliferação e diferenciação?
Conforme a diferenciação progride, a divisão celular é reduzida eventualmente. Na maioria dos
sistemas celulares, a proliferação celular é incompatível com a expressão de propriedades
diferenciadas. Existem implicações graves para esta relação em
cultura, onde a expansão e propagação são muitas vezes os requisitos principais e, portanto, não é
surpreendente descobrir que a maioria das linhas de células não expressa totalmente propriedades
diferenciadas. A interação célula-célula tornou-se um recurso chave no estabelecimento de tecidos
de engenharia.
8- O que é o comprometimento?
Com o avanço dos estágios de progressão de umacélula-tronco para uma via particular de
diferenciação tradicionalmente implicou em um aumento na compromisso. Compromisso era
considerado o ponto entre a célula-tronco e um estágio precursor particular onde uma célula ou sua
progênie não pode mais ser transferida para uma linhagem separada. Se tal
compromisso irreversível existe, deve ocorrer muito mais tarde do que pensado anteriormente, como
algumas células precursoras podem reverter para tronco células com potencial multilinhagem e até
células totalmente maduras pode ser feito para reverter para o status de células-tronco com
manipulação genética ou epigenética.
9- O que é a plasticidade celular?
A teoria das células-tronco convencionais prevê que quanto mais primitiva uma célula-tronco, maior é
sua potência. Agora foi mostrado que amadurecer células de um compartimento diferenciado, como
fibroblastos da derme, pode ser reprogramado para produzir o que têm sido chamados de
células-tronco pluripotentes induzidas que são capazes de diferenciação em várias linhagens
diferentes resta saber se eles são genuinamente totipotentes.
Capítulo 17
10- O que é a transformação celular?
A transformação implica uma mudança no fenótipo que é dependente da absorção de novo material
genético. Embora este processo agora seja alcançável artificialmente em mamíferos células, é
chamada de transfecção ou transferência de DNA, neste caso para distingui-lo da transformação.
Transformação de células em cultura implica uma formação permanente espontânea ou induzida
mudança fenotípica resultante de uma mudança hereditária no DNA e expressão gênica.
11- Em que consiste a instabilidade genética?
As características de uma linha celular nem sempre permanecem estábulo. Além das alterações
fenotípicas já descrito as linhas celulares são propensas à instabilidade genética. As linhas de células
finitas humanas normais são geralmente geneticamente estáveis, mas as linhas de células de outras
espécies são geneticamente instáveis e se transformam prontamente. Linhas celulares contínuas,
particularmente de tumores de todas as espécies, são muito instáveis, permitindo as mutações
necessárias para a linha celular se tornar contínua, e exclusão ou alteração em
genes de vigilância de DNA
13- Que é a independência de ancoragem?
Muitas das propriedades associadas aos neoplásico transformação in vitro são o resultado da
superfície celular modificações como mudanças na ligação de lectinas vegetais, nas glicoproteínas
de superfície e em moléculas de adesão celular. As células transformadas podem não ter CAMs
específicos que, quando transfectada de volta para a célula, regenera o fenótipo normal não invasivo
e podem ser reconhecidos como supressores de tumor genes. A ancoragem atua alterando as
interações citoesqueléticas, a regulação do gene transcrição, a adesão do substrato das células, e o
relação entre a propagação celular, proliferação, a perda de reconhecimento célula-célula, um
produto de adesão célula-célula reduzida levando a um crescimento desorganizado padrão e a perda
de inibição de contato da motilidade celular e limitação de densidade da proliferação celular.
14- Que é a inibição por contato?
A perda de inibição de contato pode ser detectada morfologicamente pela formação de um
desorientado monocamada de células ou células arredondadas em focos dentro do padrão regular de
ambiente normal células. Culturas de humanos glioma mostra um padrão de crescimento
desorganizado e exibe limitação de densidade reduzida de crescimento, crescendo para uma
densidade de saturação mais alta do que a da célula glial normal. Com variações no tamanho da
célula influenciam a densidade de saturação, o aumento no índice de marcação na saturação
densidade é uma medida melhor da limitação de densidade reduzida de crescimento.
15- Que é a malignidade nas linhagens celulares?
A malignidade implica que as células desenvolveram a capacidade para gerar tumores invasivos se
implantados in vivo em um hospedeiro isólogo ou se transplantado como um xenoenxerto em um
animal privado de imunidade. Embora o desenvolvimento de
malignidade pode ser reconhecida como um evento fenotípico discreto, frequentemente acompanha
o desenvolvimento de crescimento aberrante sugerindo que algumas das lesões responsáveis pelo
controle de crescimento aberrante também causa malignidade.
Semana 5
Capitulo 18
1- Porque cultivos suspeitos devem ser mantidos em quarentena?
Qualquer cultura suspeita de estar contaminada e qualquer material importado que não foi testado,
deve ser mantido em quarentena. De preferência, a quarentena deve ocorrer em um sala separada
com seu próprio exaustor e incubadora, mas se este for
inviável, um dos exaustores de uso geral pode ser
empregado. Neste caso, o capô deve ser usado por último em ao dia e deve ser pulverizado e
esfregado com 70% álcool contendo desinfetante fenólico 2% após o uso. Então deve ser retirado de
serviço até o dia seguinte.
2- Quais os procedimentos para detectar visualmente a contaminação?
As características da contaminação microbiana são:
(1) Uma mudança repentina no pH, geralmente uma diminuição com a maioria das infecções
bacterianas (Placa 16a), muito pouca mudança com fermento (Placa 16c) até que a contaminação
seja pesado, e às vezes um aumento no pH com fungos contaminação.
(2) Nebulosidade no meio, às vezes com uma leve película ou espuma na superfície ou manchas
a superfície de crescimento que se dissipa quando o frasco é movido.
(3) Em uma objetiva de 10 ×, espaços entre as células aparecerão granular e pode cintilar com
contaminação bacteriana. As leveduras aparecem como redondas ou ovóides separadas
partículas que podem brotar partículas menores. Os fungos produzem micélios filamentosos finos, às
vezes, aglomerados mais densos de esporos que podem ser azuis ou verde. Com infecção tóxica,
alguma deterioração do
as células serão aparentes.
(4) Sob um objetivo de 100 ×, pode ser possível resolver
bactérias individuais e distinguir entre bastonetes e
cocos. Com esta ampliação, o brilho que é visível
em algumas infecções pode ser causada por mobilidade de bactérias. Algumas bactérias formam
aglomerados ou se associam com
as células cultivadas.
(5) Com uma preparação de lâmina, a morfologia da bactéria pode ser resolvido com um objetivo 100
×, mas isso não é geralmente necessário. A infecção microbiana pode ser confundida com
precipitados de constituintes da mídia (particularmente proteína) ou com restos celulares, mas podem
ser distinguidos por
sua morfologia regular. Os precipitados podem ser cristalinos ou globulares e irregulares e
geralmente não são tão uniformes
no tamanho. Aglomerados de bactérias podem ser confundidos com proteína precipitada, mas,
particularmente se agitados, muitos
uma ou fileiras de bactérias serão vistas. Se você está em
dúvida, coloque uma amostra de meio em ágar nutriente
3- Porque e como se detectam micoplasmas?
Detecção de infecções micoplasmáticas não são óbvias por microscopia de rotina, exceto por sinais
de deterioração na cultura, e requer coloração fluorescente, PCR, ELISA ensaio, imunocoloração,
autorradiografia ou microbiológica ensaio. A coloração fluorescente de DNA é um dos métodos mais
fáceis e confiáveis que revela infecções micoplasmáticas como uma coloração de partículas finas ou
filamentosas sobre o citoplasma. Os núcleos das células cultivadas também são brilhantemente
coradas por este método e, portanto, atuam como um controle positivo para o procedimento de
coloração.
4- Como pode ser erradicada a contaminação? Qual é a melhor opção?
O método mais confiável para eliminar uma contaminação microbiana é descartar a cultura, o meio e
os reagentes usado com ele, pois o tratamento de uma cultura pode ser mal sucedido ou levar para o
desenvolvimento de um microrganismo resistente a antibióticos.
A descontaminação deve ser tentada apenas em casos extremos, em situações de quarentena e
com supervisão de especialistas. Se sem sucesso, a cultura e os reagentes associados devem ser
autoclavadoassim que a falha se tornar óbvia. A regra geral continua sendo que as culturas
contaminadas sejam descartadas e que a descontaminação não é tentada a menos que seja vital
reter a linhagem celular. Em qualquer evento,
descontaminação completa é difícil de conseguir, particularmente com fermento, e as tentativas de
fazê-lo podem produzir mais resistentes, cepas resistentes a antibióticos.
Capítulo 19
5- Como devem ser congeladas as células?
Congelamento ideal de células para recuperação viável máxima no descongelamento depende da
minimização do cristal de gelo intracelular
formação e redução de danos criogênicos de focos de solutos de alta concentração formados quando
a água intracelular congela.
Isso é obtido congelando lentamente para permitir que a água saia da célula, sem que o de gelo seja
encorajado. usando um crioprotetor hidrofílico para sequestrar água, armazenando as células na
temperatura mais baixa possível para
minimizar os efeitos de altas concentrações de sal na proteína desnaturação em micelas dentro do
gelo, e por descongelamento rapidamente para minimizar o crescimento do cristal de gelo e a
geração de
gradientes de soluto formados à medida que o gelo intracelular residual derrete.
Em certos casos, como congelamento de embriões e caule embrionário, o congelamento lento é
substituído por congelamento instantâneo em líquido
nitrogênio para minimizar a formação de cristais de gelo, criando um vidro em vez de remoção lenta
de água.
7- Como devem ser descongeladas as células?
Quando necessário, as células são descongeladas e semeadas novamente em um período
relativamente
alta concentração para otimizar a recuperação. A ampola deve ser descongelado o mais rápido
possível para minimizar crescimento intracelular de cristais de gelo durante o processo de
aquecimento.
Isso pode ser feito em água morna, em um balde ou em um banho-maria, mas se a ampola foi
submersa em líquido nitrogênio durante o armazenamento, o banho de aquecimento deve ser
coberto
caso a ampola tenha vazado e inspirado nitrogênio líquido,quando vai explodir violentamente com o
aquecimento. A suspensão de células deve ser diluída lentamente após o descongelamento
já que a diluição rápida reduz a viabilidade. A maioria das células não requer centrifugação, como
substituição, o meio no dia seguinte será suficiente para uma monocamada ou diluição para uma
suspensão. No entanto, algumas células são mais sensíveis a crioprotetores e devem ser
centrifugados após descongelamento, mas ainda precisa ser diluído lentamente no meio primeiro.
Capítulo 20
10- Como é calculado o número de células por ml?
Através da fórmula de contagem que envolve o número de células sobre o volume, determina a
concentração e achas o número de celular no hemocitômetro, padronizado vezes 10xa 4. A
contagem de células nos quatro quadrantes garante que a margem de erro seja menor, gerando uma
média mais confiável da concentração. A utilização de corante separa as células viáveis, que ficam
coloridas e vão ser utilizadas para determinação do fator de diluição.
Semana 6
Capítulo 24
1- Qual os problemas do cultivo de células tumorais?
Apresenta problemas semelhantes aos da cultura de células especializadas de tecido normal. As
células tumorais devem ser separadas das células normais do tecido conjuntivo, de preferência pelo
fornecimento de um meio seletivo que irá apoiar essas células mas não as normais. Embora o
desenvolvimento
de meios seletivos para células normais avançou consideravelmente, o progresso na cultura do
tumor foi limitado pela variação entre e dentro das amostras de tecido tumoral, mesmo do mesmo
tipo de tumor. É frequente descobrir que os tumores que crescem in vivo, principalmente como
resultado de sua aparente autonomia de regulação normal, não crescem in vitro.
Suas necessidades nutricionais podem ser diferentes das células normais equivalentes,
ou talvez as tentativas de remover o estroma podem, na verdade, privar as células tumorais de uma
matriz, nutrientes ou sinais necessários
para sobrevivência.
2- Como podem se cultivar e selecionar células tumorais aderidas, em suspensão ou por passagem
xerográfica?
As células em suspensão são cultivadas por cultivo primário e as tumorais aderidas precisam de
compostos celulares específicos para garantir o seu crescimento, identificando e selecionando
células.
3- Porque os cultivos primários de células são heterogêneos?
O isolamento de células de tumores pode dar origem a vários tipos diferentes de linha celular. Além
das células neoplásicas, fibroblastos do tecido conjuntivo, endoteliais vasculares e lisos
células musculares, infiltrando linfócitos, granulócitos e macrófagos, bem como elementos do tecido
normal em que a neoplasia surgiu, podem sobreviver ao explante. Macrófagos
e os granulócitos são tão fortemente aderentes e não proliferativos que geralmente se perdem na
subcultura. O Músculo liso não se propaga prontamente sem os fatores de crescimento apropriados e
meio seletivo, portanto, os principais contaminantes potenciais de culturas de tumor são fibroblastos,
células endoteliais e o
equivalentes normais das células neoplásicas.
4- Em que consiste a formação de esferóides?
As células estromais normais não formam esferóides ou mesmo se incorporam em esferóides
derivados de tumor. Portanto, as culturas de tumores permitidas para formar esferóides em
substratos não adesivos, como agarose, tenderá a crescer demais em seu estroma componente.
Algumas culturas de mama e pulmão de pequenas células
carcinoma pode gerar esferóides ou células irregulares organóides que flutuam e podem ser
coletados do meio sobrenadante, deixando o estroma para trás.
São uma tecnologia, possibilitando servir como apoio às células in vivo, alcançando sítios de ação e
tendo mais aderência.
5- Descreva as características do cultivo de células tumorais derivadas de mama.
O carcinoma da mama pode ser cultivado a partir da digestão da colagenase
de biópsias e propagado em camadas alimentadoras ou em MCDB 170.
Muitas das condições usadas para derivar culturas da mama normal, como a suplementação de fator
de crescimentoe o colágeno revestimento pode não ser ideal para carcinoma mamário, portanto, uma
variedade de condições pode precisar ser testada nas tentativas preliminares e a identidade
neoplásica das células cultura confirmada.
Identificação de células tumorais de mama, distintas das normais células da mama, exigirá a
detecção de lesões genéticas específicas
A linhagem pode ser confirmado por citoqueratina, EMA, anti-HMFG 1 e 2 foi proposto que a
queratina 19 é mais provável de
ser expressa em células tumorais do que em células mamárias normais em
vitro.
6- Descreva as características do cultivo de células tumorais derivadas de pulmão.
Carcinoma pulmonar foram cultivados com sucesso com meio seletivo sem soro, o derramamento
mecânico e gradiente de densidade separam em Ficoll para isolar as células. Os efeitos da matriz
sobre oncogene e expressão de fator de crescimento também foram estudados e têm sido usados
 para facilitar a cultura de células de carcinoma pulmonar de micrometástases da medula óssea e
meios seletivos têm sido usados para examinar o potencial de angiogênese em cultura de curto
prazo. O ensaio de quimioterápicos drogas em metástases cerebrais de pulmão testadas in vitro
mostram considerável heterogeneidade de resposta. Vários marcadores estão disponíveis para a
identificação dessas células in vitro, incluindo atividade imunológica semelhante a bombesina,
DOPA-descarboxilase e superexpressão de isoenzima BB de creatina quinze. Foi demonstrado que o
câncer de pulmão de células escamosas superexpressão de outras linhas de células foram
mostradas para expressar propriedades anormais in vitro que se correlacionam com o em fenótipo
vivo do tumor do qual eles foram derivados.
7- Descreva as características do cultivo de células tumorais derivadas de cólon.
Condições sem soro para a cultura de alguns humanos Linhas celulares de câncer colorretal foram
descritas mas essascondições são
geralmente inadequadas para culturas de carcinoma isoladas recentemente,
que requerem soro.
Carcinoma colorretal foi cultivado
de biópsias que foram retiradas de ambos os tumores primários
e metástases e têm sido usados como modelo
para estudar o controle da transição epitelial-mesenquimal. Como no carcinoma de pulmão, alguns
colorretais
tumores ocorrem com propriedades neuroendócrinas, e alguns sucessos foram relatado no uso do
meio HITES
A Densidade de centrifugação em Percoll tem sido usada para purificar o cólon células de carcinoma
para cultura primária em meio convencional.
8- Descreva as características do cultivo de células tumorais derivadas de pâncreas.
Linhas celulares de tumores pancreáticos primários ou metástases têm sido isolados e propagados
em RPMI 1640 suplementado
com soro fetal bovino. As linhas celulares
foram adaptadas para meio sem proteína para o exame de produtos celulares. Linhas de células
pancreáticas foram geradas para estudos
no controle de crescimento autócrino por gastrina e nenhuma correlação foi detectada entre a
expressão de receptores de gastrina e colecistocinina, como normalmente acontece. KCI-MOH1.
Também foi usado para estudos sobre glicocorticóides receptore. Crescimento em xenoenxertos -
também como proliferação, migração, invasividade em revestido com Matrigel inserções de poços de
filtro e clonagem de ágar macio - é aprimorada por cocultura com células estromais de câncer
pancreático
9- Descreva as características do cultivo de células tumorais derivadas de melanoma.
Células de pigmento da pele podem ser cultivadas com os fatores de crescimento apropriados e as
culturas também podem ser obtidas de melanomas com um
grau razoável de sucesso. Os melanomas primários são frequentemente contaminados
com fibroblastos, mas clonando em camadas alimentadoras confluentes de células normais. Culturas
celulares derivadas de derramamento mecânico pode ser liberado de fibroblastos por tratamento com
Geneticina, insulina, rin de transferência, extrato de hipófise bovina, hidrocortisona, e 5% de soro e
outras substâncias específicas. Um sistema organotípico para estudar a interação de
melanoma com queratinócitos foi relatado.
10- Descreva as características do cultivo de células tumorais derivadas de glioma.
Culturas de glioma humano podem ser preparadas mecanicamente pela desagregação, tripsinização
ou digestão com colagenase. Culturas de passagem precoce de células de glioma humano irão
proliferar
quando plaqueado em monocamadas confluentes ou células gliais normais,
enquanto as células gliais normais não abrindo um possível método seletivo para excluir o normal
glia de culturas de glioma. No entanto, a maioria das culturas de glioma superará a glia normal,
especialmente se for cultivada até
eles se tornam linhas celulares contínuas que muitas vezes é alcançado sem qualquer aparente
crise. Culturas de glioma humano têm sido usadas na prevenção em teste de quimiossensibilidade,
glicocorticóide
sensibilidade e, mais recentemente, terapia mediada por retrovírus.
11- Descreva as características do cultivo de células tumorais derivadas de linfoma e leucemia.
Geração de rotina de linhas celulares de linfoma e leucemia tem sido difícil. Muitas das células
contínuas em linhas existentes foram derivadas de linfoma de Burkitt e mostrado para transportar
Genes virais de EB.
Semana 7
Capítulo 25
1- Explique os tipos de modelos para cultivos tridimensionais.
Efeito da densidade celular
A interação célula-célula se manifesta no nível mais simples quando uma cultura celular atinge a
confluência e as células constituintes interagindo mais fortemente uns com os outros por causa da
sinalização mediada por contato, formação de complexos juncionais e
potencial aumentado para troca de fatores homócrinosm
Interações Recíprocas
Populações que interagem de diferentes células têm um recíproco efeito em seus respectivos
fenótipos, e as mudanças fenotípicas resultantes levam a novas interações. A interação celular,
portanto, não é apenas um evento único, mas de forma similar sinais exógenos não iniciam um único
evento, como pode ser o caso com populações homogêneas,
2- Defina os pros e contras do cultivo de órgãos.
Uma grande deficiência na arquitetura de tecidos em cultura de órgãos é a ausência de um sistema
vascular, limitando o tamanho e potencialmente a polaridade das células dentro
a cultura do órgão. Quando as células são cultivadas como uma massa sólida
de tecido, difusão gasosa e troca de nutrientes
e os metabólitos vêm da periferia, e a taxa dessa difusão limita o tamanho do tecido.
Para aliviar este problema, órgão as culturas são geralmente colocadas na interface entre o líquido e
fases gasosas, para facilitar a troca gasosa enquanto retém acesso aos nutrientes.
3- Que tipos de matrizes podem ser usadas nos cultivos histotípicos?
Várias tentativas foram feitas para regenerar
arquitetura tipo tecido de culturas em monocamada dispersas.
Green e Thomas [1978] mostraram que na epiderme humana os queratinócitos formarão
dermatóglifos se forem mantidos por várias semanas sem transferência, e Folkman e Haudenschild
[1980] foram capazes de demonstrar a formação de túbulos capilares em culturas de vasos
cultivadas na presença de células endoteliais sendo fator de crescimento para meio condicionado por
células tumorais.
5- Defina cultivos organotipicos e determine os pros e contras destes cultivos.
Cultura tridimensional de alta densidade envolvendo o a recombinação de diferentes linhagens
celulares pode ser referida
como cultura organotípica, usado para distinguir essas técnicas de reconstrução de cultura de órgãos
onde as células originais não estão dissociadas. O evento chave
que distingue esses construtos da cultura histotípica é a introdução de interação celular heterotípica,
incluindo efeitos parácrinos difusíveis e sinalização implicando o
Matriz extracelular. A relação das células permite o geração de um microambiente estruturado,
polaridade celular, e diferenciação aprimorada. Normalmente a cultura organotípica exigirá uma
matriz estrutural com filtro tecnologia de poço sendo usada extensivamente
Capítulo 26
6- Descreva como podem ser cultivas células em suspensão em quantidades industriais. Quais
seriam suas aplicações?
O aumento da escala de culturas em suspensão envolve, principalmente, um aumento do volume do
meio de cultura. Agitação do meio é necessário para aumentar a troca gasosa e evitar que as células
formem um
sedimento denso, a pulverização com CO2 e ar é necessária para manter a troca gasosa adequada.
Na falta de de soro, pode ser necessário aumentar a viscosidade do
meio com carboximetilcelulose.
7- Descreva como podem ser cultivadas células aderentes em quantidades industriais. Quais
seriam suas aplicações?
As células dependentes de ancoragem não podem ser crescido em suspensão líquida, exceto em
microtransportadores, mas células transformadas podem. Essas células ainda são capazes de
fixação, os recipientes de cultura precisarão ser revestidos com um silicone repelente de água e o
cálcio pode ser necessário reduzir a concentração. O meio tem que ser específico sem cálcio na
formulação.
Semana 8
Artígo Biehl, Introduction to stem cell therapy (2009)
1- Defina Célula-tronco e seus tipos.
As células tronco são as primeiras células dentro do embrião. As células-tronco pluripotentes são
assim chamadas porque têm a capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células do corpo.
No desenvolvimento natural, as células-tronco pluripotentes estão presentes apenas por um período
muito curto de tempo no embrião antes de se diferenciarem nas células-tronco multipotentes mais
especializadas que eventualmente dão origem aos tecidos especializados do corpo. Essas
células-tronco multipotentes mais limitadas vêm em vários subtipos: algumas podem se tornar
apenas células de uma linha germinativa específica e outras, apenas células de um determinado
tecido.
2- Descreva a figura 2 em razão das possibilidades dediferenciação celular.
Podemos observar quatro resultados potenciais das células-tronco.
A) Quiescência em que uma célula-tronco não se divide, mas mantém o pool de células-tronco
B) Auto-renovação simétrica em que uma célula-tronco se divide em duas células-tronco filhas,
aumentando o pool de células-tronco
C) Auto-renovação assimétrica em que uma célula-tronco se divide em uma célula-filha diferenciada
e uma célula-tronco, mantendo o pool de células-tronco
D) Divisão simétrica sem auto-renovação, onde há uma perda no pool de células-tronco, mas resulta
em duas células-filhas diferenciadas (SC- célula-tronco, progênie diferenciada DP)
3- Descreva a origem das células-tronco pluripotentes.
As células-tronco pluripotentes usadas em pesquisas hoje vêm principalmente de embriões, daí o
nome “células-tronco embrionárias”. Embriões pré-implantação com alguns dias de idade contêm até
15% de células pluripotentes na “massa celular interna”.
4- Descreva a origem das células-tronco multipotentes.
As células-tronco multipotentes com o maior potencial de diferenciação são encontradas no embrião
em desenvolvimento durante a gastrulação (dias 14-15 em humanos, dias 6,5-7 em camundongos).
Essas células dão origem a todas as células de sua camada germinativa particular, portanto, ainda
possuem flexibilidade em sua capacidade de diferenciação. Elas perderam a capacidade de se tornar
células de todas as três camadas germinativas e são originadas pelo processo de divisão das
primeiras células do embrião, as pluripotentes.
5- Como são identificadas células-tronco pluri e multipotentes?
Os marcadores de superfície celular também são normalmente usados para identificar células-tronco
multipotentes. Por exemplo, as células-tronco mesenquimais podem ser purificadas de todo aspirado
de medula óssea eliminando células que expressam marcadores de tipos de células comprometidas,
uma etapa conhecida como enriquecimento de linhagem negativa e, em seguida, separando ainda
mais as células que expressam sca-1 e c- Marcadores de superfície do kit significando células-tronco
mesenquimais. Tanto a etapa de enriquecimento de linhagem negativa quanto o isolamento de sca-1
/ c-Kit podem ser obtidos usando citometria de fluxo e são discutidos em mais detalhes na revisão a
seguir. O marcador de superfície c-Kit também é usado para distinguir as células-tronco cardíacas
recentemente descobertas do resto do miocárdio. Muitos trabalhos recentes em pesquisa
cardiovascular têm se concentrado em tentar descobrir quais marcadores indicam células
multipotentes precoces que darão origem a miócitos pré-cardíacos. Células com o marcador
mesodérmico específico, Kdr, dão origem às células progenitoras do sistema cardiovascular,
incluindo miócitos cardíacos em contração, células endoteliais e células do músculo liso vascular e,
portanto, são consideradas as primeiras células com especificação para a linhagem
cardiovascular.17 Células em este estágio inicial ainda prolifera prontamente e ainda está destinado
a se tornar células do sistema cardiovascular e, portanto, pode ser de grande valor terapêutico.
6- Como são diferenciadas as células-tronco pluri e multipotentes?
As células multipotentes também têm sido usadas como ponto de partida para a terapia celular,
novamente com coquetéis de fatores de crescimento e / ou produtos químicos para induzir a
diferenciação em direção a uma linhagem específica desejada. Algumas receitas são simples, como
o uso de ácido retinóico para induzir células-tronco mesenquimais em células neuronais, 19 ou a
transformação do fator de crescimento-β para fazer as células-tronco derivadas da medula óssea
expressarem marcadores de miócitos cardíacos.20 Outros são complicados ou mal definidos como
como adição dos fatores desconhecidos secretados pelas células em cultura. Pistas físicas e
químicas causam a diferenciação das células-tronco. A simples alteração da rigidez do substrato no
qual as células são cultivadas pode direcionar as células-tronco para linhagens neuronais,
miogênicas ou osteogênicas.21 As células evoluem em ambientes físicos e químicos, portanto, uma
combinação de ambos provavelmente será necessária para a diferenciação ideal das células-tronco.
A importância das pistas físicas no ambiente da célula será discutida em maiores detalhes na revisão
final desta série. Idealmente, para que as células-tronco sejam usadas terapeuticamente, protocolos
eficientes e uniformes devem ser estabelecidos para que as células sejam uma entidade bem
controlada e bem definida.
7- Qual célula-tronco resulta melhor na terapia? As pluri ou as multipotentes?
As células-tronco pluripotentes e multipotentes têm suas respectivas vantagens e desvantagens. A
capacidade das células pluripotentes de se tornarem qualquer tipo de célula é uma vantagem
terapêutica óbvia sobre seus parentes multipotentes. Teoricamente, eles poderiam ser usados para
tratar tecidos doentes ou envelhecidos nos quais as células-tronco multipotentes são insuficientes.
Além disso, as células-tronco pluripotentes proliferam mais rapidamente, portanto, podem produzir
um número maior de células úteis. No entanto, o uso de células-tronco pluripotentes de doadores
exigiria drogas imunossupressoras durante o enxerto28, enquanto o uso de células-tronco
multipotentes autólogas (células-tronco próprias) não. Essa capacidade de usar as próprias células é
uma grande vantagem das células-tronco multipotentes. O sistema imunológico reconhece proteínas
de superfície específicas em células / objetos que lhes dizem se a célula é do hospedeiro e é
saudável. As células-tronco autólogas multipotentes têm proteínas de superfície específicas do
paciente que permitem que sejam aceitas pelo sistema imunológico do hospedeiro e evitam uma
reação imunológica As células-tronco pluripotentes, por outro lado, não são do hospedeiro e,
portanto, não possuem os sinais adequados necessários para evitar a rejeição do sistema
imunológico. A pesquisa está em andamento tentando limitar a resposta imunológica causada por
células pluripotentes e é uma possível vantagem que as células iPS podem ter.
Livro (Nos materiais da aula de células-tronco) Peterson, Human Stem Cell Manual Capítulo 1
Culturing Human Pluripotent Stem Cells on a Feeder Layer
8- Descreva como monitorar os cultivos de células-tronco pluripotentes.
Monitoramento de hPSCs na cultura Para manter com sucesso hPSCs em uma camada de
alimentação ao longo do tempo na cultura, é crucial ter um bom entendimento de suas características
morfológicas e manter uma boa técnica durante a cultura (Figura 1.1). Os hPSCs têm uma morfologia
única quando cultivados em uma camada de alimentação. Eles crescem em colônias compactas com
bordas bem definidas que distinguem a colônia da camada alimentadora. Os hPSCs geralmente se
diferenciam nas bordas ou no centro das colônias. No entanto, a diferenciação pode ocorrer em
qualquer lugar da colônia. As células da colônia devem ser pequenas, compactadas e ter aparência
uniforme (Figura 1.1A). Áreas diferenciadas devem ser removidas diariamente (se necessário).
9- Descreva como são reconhecidas as colônias de hPSC.
Reconhecendo a morfologia da colônia hPSC Ser capaz de identificar e discernir a diferença entre
colônias com morfologia indiferenciada e aquelas que são ou estão se tornando diferenciadas é uma
habilidade fundamental necessária para cultivar hPSCs (Figura 1.1). Recomenda-se que, para a
expansão de rotina, as células sejam cultivadas em densidade média para que a morfologia da
colônia seja mais facilmente discernida. Embora as hPSCs possam ser cultivadas em alta densidade
(Figura 1.2), isso pode aumentar a taxa de diferenciação espontânea. Culturas de baixa densidade
podem não sobreviver bem e também podem ter problemas com diferenciação espontânea.
10- Descreva como se realiza a passagem normalmente de hPSC.
Passando hPSCs Para hPSCs derivados em camadas alimentadoras e cultivados rotineiramente em
camadas alimentadoras, é importante evitar dissocia-losem uma única suspensão de células em
qualquer ponto durante a cultura, para evitar a diferenciação e a morte celular. Por esta razão, a
passagem manual ou “mecânica” das células é o padrão atual e uma das técnicas de cultura de
hPSC por excelência. Embora esse método leve tempo para aqueles com várias culturas
acontecendo ao mesmo tempo, o método em si é extremamente confiável e é pensado para gerar a
menor quantidade de instabilidade genética em hPSCs ao longo do tempo em cultura. Por manter as
populações estáveis, usamos esse método para gerar estoques iniciais de células criopreservadas.
Existem meios alternativos de passar as células em uma camada de alimentação, que serão
abordados na seção de métodos alternativos.
Capítulo 2 Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Feeder Cells
11- Descreva a utilidade e o isolamento de fibroblasto para a camada alimentadora.
Isolamento de fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) Você precisará se preparar com
antecedência para preparar seu próprio lote de fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs). É
importante seguir os regulamentos institucionais, locais, estaduais e federais com relação ao uso de
ratos de laboratório. Essas diretrizes são regidas pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidado de
Animais (IACUC), que analisa o uso proposto de animais vertebrados. Obtenha a aprovação do
IACUC e, em seguida, obtenha a cepa de camundongo desejada e configure os acasalamentos
conforme aprovado pelo IACUC. Alternativamente, camundongos grávidas cronometradas podem ser
encomendados de muitos fornecedores de camundongos para que você não tenha que manter uma
colônia ou configurar os acasalamentos por conta própria.
Capítulo 3 Culture of Human Pluripotent Stem Cells in Feeder-Free Conditions
12- Descreva como acontece o cultivo e a passagem de hPSC em condições livres de camada
alimentadora.
1. Observe as culturas diariamente. As hPSCs cultivadas em Geltrex / Matrigel têm uma morfologia
diferente das células cultivadas em camadas de alimentação. Os hPSCs sem alimentador não
crescem como colônias arredondadas características com bordas definidas, como células em
camadas alimentadoras. Em vez disso, eles crescem como uma monocamada até atingirem a
confluência
2. Troque o meio diariamente com StemPro suplementado com 12 ng / mL de bFGF. Concentrações
mais baixas de bFGF podem ser usadas, mas concentrações menores que 8 ng / mL podem fazer
com que a cultura de hPSC se diferencie.
3. Quando as células estão confluentes, passe as células.
4. Aspire o meio e lave as células com DPBS
5. Aspire o DPBS e adicione 2 mL de Accutase por poço de uma placa de seis poços
6. Incube as células com Accutase a 37 ° C por 2 a 5 minutos. Monitorar o cultura e parar a
incubação quando as células começam a arredondar
7. Enxágue suavemente para remover as células da placa e transfira a célula suspensão em um tubo
cônico de 15 mL
8. Adicione 2 mL de meio para enxaguar quaisquer células remanescentes da superfície do prato e
transferir para um tubo cônico de 15 mL
9. Centrifugue o tubo cônico contendo suspensão de células a 200 g por 2 a 3 minutos
10. Aspire o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em StemPro pipetando suavemente as
células para quebrar os aglomerados. Conte as células e determine a viabilidade celular
11. Coloque a densidade celular desejada em placas revestidas com Geltrex e incube em uma
atmosfera umidificada de 5% de CO2 no ar a 37 ° C. Recomendamos a passagem das células a uma
densidade de cerca de 20.000 células / cm2, mas isso requer otimização para sua linha celular
específica. Algumas linhas de células podem exigir densidades de semeadura muito maiores
12. Troque o meio no dia seguinte e observe as culturas.
Semana 9
Livro Peterson, Human Stem Cell Manual Capítulo 1 Culturing Human Pluripotent Stem Cells on a
Feeder Layer.
Capítulo 9
1- Descreva o cultivo de biópsia de pele.
O isolamento das fibroblastos dérmicos humanos HDFs começa com a realização de uma biópsia
por punção de 3 mm com anestesia local, geralmente na parte interna do antebraço ou ombro do
doador. Antes do isolamento das células, é importante manter a amostra da biópsia submersa em
meio de fibroblasto gelado contendo um antibiótico e antimicótico. Isso é crítico porque a pele abriga
naturalmente uma variedade de bactérias e microorganismos nativos em sua superfície que podem
levar à contaminação. A amostra de tecido é então cortada em pedaços e digerida enzimaticamente.
As células e o tecido picado são colocados em placas de cultura de tecidos revestidos com
fibronectina e deixados para sedimentar e crescer. Uma vez que os fibroblastos se tornaram
confluentes, eles são tripsinizados e passados para frascos maiores para expansão, criação de um
banco transgênico e experimentação. Essas células são importantes, no geral porque elas modificam
células que já tem alguma característica boa.
É importante usar uma técnica estéril ao longo deste protocolo. Para obter melhores resultados,
processe a biópsia imediatamente após ser feita. Como alternativa, as biópsias podem durar alguns
dias se forem mantidas em meio de fibroblasto em gelo. Se as biópsias forem enviadas de um local
remoto, certifique-se de que sejam mantidas no gelo continuamente.
Capítulo 10
2- Como foram desenvolvidas as iPSC?
Em 2006, foi relatado pela primeira vez que fibroblastos embrionários e adultos de camundongos
poderiam obter propriedades semelhantes às de células-tronco embrionárias chamadas de
“células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)”. As iPSCs de camundongo eram semelhantes às
células ES em morfologia, proliferação, expressão de genes marcadores de células ES e capacidade
de formar teratomas em camundongos imunocomprometidos. As iPSCs específicas da doença
também são úteis para a triagem de toxicidade de drogas causada por mutações genéticas.
O método de geração de iPSCs humanos descrito abaixo é altamente reprodutível usando técnicas
básicas de biologia molecular e celular, sem a necessidade de qualquer equipamento especializado.
Recomendamos a transdução retroviral dos quatro fatores de reprogramação como um método
convencional e robusto para a geração de linhas iPSC humanas que podem ser usadas para vários
caminhos de pesquisa.
3- Descreva o protocolo de reprogramação baseado em vetor viral para criar iPSCs.
O protocolo passa pela Preparação de células PLAT-E retirando os estoques congelados do tanque
de nitrogênio líquido e coloquando o
frascos em banho-maria a 37 ° C até que a maioria (mas não todas) as células sejam
descongeladas. Elas devem ser centrifugadas e ressuspendidas. No dia seguinte, é necessário
substituir o meio por um novo meio suplementado com e colocar as células em uma incubadora até
que estejam 90% confluentes.
Logo, a Produção e transfecção de retrovírus em células PLAT-E Transfectando um plasmídeo em
cada placas separadas, transferência OPTI-MEM I para cada tubo e transferência de reagente de
transfecção misturando suavemente e incubando os tubos por 5 minutos à temperatura ambiente.
Adicionar então o DNA de plasmídeo apropriado a cada tubo e um plasmídeo por tubo. Misturar
tocando com o dedo e incubar os tubos para 15 minutos à temperatura ambiente. Adicionar a mistura
de DNA / Fugene a uma das cinco culturas separadas de PLAT-E
células. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C em uma incubadora de 5% de CO2. No dia
seguinte, substituir o meio contendo DNA e Fugene 6
com meio FP fresco sem puromicina ou Blasticidin S, e coloque os pratos de volta na incubadora.
O protocolo também conta com a Preparação de Fibroblastos Humanos que Expressam Receptor
Ectópico, Quando fibroblastos humanos expressando o gene do camundongo atingir 80–90% de
confluência, aspirar o meio e lavar as células uma vez com DPBS que deve ser Descartado.
adicionar tripsina, solução de EDTA e incubar o prato por 3 minutos em temperatura ambiente.
Adicionar 4,5 mL de meio FP por placa e gerar uma suspensão de célula única por pipetagem. Logo,
tranferir as células para um tubo cônico de 50mL. Conte as células, com um rendimento esperado de
2 106 células / placa. Ajuste a concentração para 8 104 células / mL com meio FP. Transfira 10 mL
da suspensão de células para placas de 100 mm. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C em uma
incubadora de 5% de CO2.
Até que o protocolo acaba na Infecção por retrovírus
coletando o meio de cada placa PLAT-E com uma seringa descartável estéril, filtrando através de um
filtro de acetato de celulose e transfirondo para um tubo cônico de 15 mL. Adicionar então solução de
polibreno ao meio filtrado que contém o vírus e misture suavemente pipetando para cima e para
baixo. Fazer uma mistura de partes iguais do meio contendo retrovírus. Aspirar o meio das placas de
fibroblasto e adicionar 10 mL por placa do meio contendo polibreno / vírus. Incubar as células de 4
horas a durante a noite a 37 ° C em uma incubadora de 5% de CO2. Após o período de cultura,
aspire o meio dos fibroblastos transduzidos e adicione 10 mL por placa de meio FP fresco. Troque o
meio a cada dois dias até a nova semeadura.
Capítulo 11
4- Descreva o protocolo de reprogramação não integrativo para criar iPSCs.
O processo de reprogramação não integrativo para criar iPSCs é feito em 4 etapas. (1) Preparar o
material de células somáticas; Deixe os reagentes em temperatura ambiente; Adicione meio FP sem
antibiótico em cada poço e estabilizar a placa; Aspire o meio da cultura de fibroblasto humano; Lave
as células com DPBS; Aspire o DPBS, adicione tripsina, EDTA e incubar o prato por 2-3 minutos;
Adicione meio a cada poço e faça suspensões de células únicas por pipetagem; Transfira a
suspensão de células para um tubo cônico; (2) Introduzir os fatores de reprogramação em células
humanas por fatores epissomais usando um miroporador; Conte o número de células e transfira as
suspensões de células em novos tubos cônicos; Ajuste o volume com PBS e centrifugue; Enquanto a
amostra está sendo centrifugada, encha o tubo Neon com tampão eletrolítico e insira o tubo de neon
na estação de pipeta de neon e transfira mistura de DNA de plasmídeo para um novo tubo; Após a
centrifugação, aspire o sobrenadante completamente usando um aspirador e pipetador; Insira uma
ponta de neon na pipeta de neon e aplique a solução E; Suspenda as células com solução R e
transfira-as para uma unidade contendo mistura de plasmídeo; Puxe 100 microlitro da amostra para a
ponta neon; Insira a pipeta de neon com a amostra verticalmente no tubo de neon colocado na
estação de pipeta de neom; Selecione o protocolo de eletroporação apropriado e pressione iniciar na
tela sensível ao toque; Transfira a amostra para a aplaca de cultura preparada contendo meio
pré-aquecido; Após 24 horas, aspire o meio e adicione meio fresco, troque o meio a cada 2 dias (3)
Organizar células eletroporadas em uma camada de alimentação; . Aspire o meio e lave as células
com PBS. Descarte o PBS, adicione 0,3mL por poço de tripsina, EDTA solução. Incube. Adicione
meio de crescimento de fibroblastos fresco e pipete as células para formar uma suspensão de célula
única. Transfira a suspensão de células para um tubo cônico. Conte o número de células e ajuste a
concentração. Transfira a suspensão de células (para placas com células alimentadoras de SNL
tratadas com mitomicina C. Incube as placas durante a noite. Aspire o meio e adicione meio de
células ES humano fresco. Mude o meio a cada dois dias até que as colônias se tornem grandes o
suficiente para ser recolhido. (4) Escolher colônias semelhantes as células ES e expandir cada
clone;
Semana 10
Os arquivos estarám nos materiais da aula.
Do artigo Dominici et al., Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The
International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-7. doi:
10.1080/14653240600855905.
1- Detalhe quais critérios definem células-tronco mesenquimais (MSC)?
Para resolver este problema, o Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee do ISCT propõe um
conjunto de padrões para definir as MSC humanas tanto para investigações científicas baseadas em
laboratório como para estudos pré-clínicos. O objetivo desta declaração de posição é fornecer à
comunidade científica um conjunto padrão de critérios, com base nos melhores dados disponíveis
atualmente, para definir a identidade do MSC. Propomos três critérios para definir MSC:
Primeiro, o MSC deve ser aderente ao plástico quando mantido em condições de cultura padrão
usando frascos de cultura de tecidos. Em segundo lugar, 95% da população de MSC deve expressar
CD105, CD73 e CD90, conforme medido por citometria de fluxo. Além disso, essas células não
devem ter expressão (5/2% positiva) de CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79a ou CD19 e HLA
classe II. Terceiro, as células devem ser capazes de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e
condroblastos sob condições padrão de diferenciação in vitro.
Capitulo 2- Łos et al., Stem Cells do livro Stem Cells and Biomaterials for Regenerative Medicine.
2019, Pages 5-16
2- Defina nicho.
Os nichos de células tronco são caracterizados por um ambiente histológico definido, a
disponibilidade de certos tipos de moléculas de adesão e, muitas vezes, também a presença de
células de suporte. Cada nicho de célula-tronco tem órgãos específicos e suas características
histológicas, como nichos de células tronco hematopoiéticas em ossos trabeculares, criptas intestinas
no trato digestivo, protuberância do folículo capilar para regeneração de queratinócitos, cabelo e
glândulas sebáceas ou subventricular zona do cerebelo e a zona subgranular do hipotálamo, que é
responsável pela produção de astrócitos. Os nichos podem ainda ser divididos em nicho simples,
complexo ou de armazenamento.
3- Descreva os diferentes graus de potência.
Célula-tronco - Potência
As células-tronco podem ser classificadas de acordo com sua plasticidade / potencial regenerativo
em: totipotentes, pluripotentes, multipotentes, oligopotentes e unipotentes.
As células totipotentes têm capacidade de se diferenciar em linhagens celulares de todas as três
camadas germinativas: mesoderme, endoderme e ectoderme, incluindo células da placenta, e essa
capacidade tem apenas zigoto e primeiro blastômero no organismo humano. Durante as divisões,
forma-se mórula e, em seguida, blastocisto. As células que compõem a massa celular interna do
blastocisto (ICM) têm propriedades pluripotentes. As células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) têm
capacidade de se diferenciar em células de todas as três camadas germinativas, com exceção de
tecidos extrafetais (ou seja, placenta). No organismo humano, apenas as células-tronco
embrionárias, que formam a ICM, têm capacidade pluripotente. As células-tronco multipotentes se
diferenciam em muitos tipos de células que se originam da mesma camada germinativa.
4- Compare MSC em função de sua fonte.
As células-tronco mesenquimais (MSC) são células multipotentes não hematopoiéticas, isoladas de
diferentes fontes: medula óssea, tecido adiposo, pele, sangue periférico, mas também de tecido
perinatal como: sangue do cordão umbilical, líquido amniótico, membrana e placenta. Elas podem ser
potencialmente usadas para intervenções terapêuticas em muitas doenças. Hoje em dia os MSC são
usados na clínica principalmente para terapia de reconstrução óssea. Para tanto, MSC autólogas,
geralmente de medula óssea, são utilizadas. O transplante de MSC também foi testado para reparar
a cartilagem danificada. Em tais tentativas, MSC frequentemente enriquecido com materiais
biocompatíveis, como cola de fibrina rica em plaquetas, ácido hialurônico e membrana de colágeno
são aplicados. Várias tentativas têm sido feitas para usar MSC no tratamento de lesões
cardiovasculares, como, por exemplo, infarto do miocárdio ou cardiomiopatia isquêmica crônica.
5- Descreva células-tronco hematopoiéticas.
HSC são células multipotentes, responsáveis pela hematopoiese e pela produção células do sistema
imunológico no organismo. São definidos com base em marcadores específicos tendocapacidade
única de migrar para os tecidos danificados. O transplante de HSC é um tratamento de escolha,
particularmente as leucemias agressivas. Para fins de coleta, eles são “forçados” a serem liberados
da medula óssea por citocinas como fator estimulador de colônias de granulócitos, trombopoietina ou
ligante c-Kit, e coletados do sangue por leucaférese. Seu nicho de células-tronco está localizado na
medula óssea; em particular, no nicho arteriolar e no nicho senoidal-megacariócito. O nicho de HSC é
rico em vários tipos de células, como pericitos, células endoteliais, células de osteolineage, nervos
simpáticos e células de Schwann, que ajudam a manter o estado indiferenciado de HSC.
6- Descreva as células-tronco adultas do músculo e do pâncreas.
Eles têm potencial multipotente e capacidade de auto-renovação. As SSC podem ser usadas na
promoção da angiogênese porque contribuem para a estabilidade dos vasos sanguíneos. Além disso,
eles podem ser usados na regeneração do tecido ósseo e como um componente terapêutico de HSC
no tratamento de leucemia ou síndromes mielodisplásicas.
As células-tronco pancreáticas (PSC) são células endodérmicas, específicas de tecidos, que estão
localizadas em diferentes regiões do pâncreas, são responsáveis por reparos de danos e têm
potencial de multi diferenciação. As células-tronco musculares (células satélite) são responsáveis
 pela regeneração muscular.