Relatorio Bioquímica proteínas com biureto

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UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE 
 
 
CURSO DE QUÍMICA 
 
DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA 
 
 
 
 
 
DOSAGEM DE PROTEÍNAS: DETERMINAÇÃO COLORIMÉTRICA DE 
PROTEÍNAS ATRAVÉS DA REAÇÃO DO BIURETO 
 
 
 
 
 
 
 
Alunos: Ana Carolina da Silva Drumond TIA: 3140344-1 
 Kelly Cristina do Nascimento 3144770-8 
 Sophia Rodrigues Parisi 3140143-0 
 
 
 
 
2 
 
São Paulo 
2015 
UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE 
 
 
 
 
DOSAGEM DE PROTEÍNAS 
 
 
 
Relatório da sexta aula prática da disciplina de 
Bioquímica ministrada pelo Prof. Dr. Marcos 
A. Fazio acerca da descoberta de uma 
Concentração desconhecida a partir da 
Equação da reta obtida pela absorbância 
Versus concentração, da espectrofotometria. 
. 
 
 
 
 
 
 
São Paulo 
2015 
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Sumário 
 OBJETIVO ................................................................................................................................... 4 1.
 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 5 2.
2.1 Métodos para determinação de proteínas ................................................................................ 5 
2.2 Método de Biureto ................................................................................................................... 5 
2.3 Espectrofotometria de Absorção Molecular.............................................................................. 7 
 PROCEDIMENTOS ....................................................................................................................... 9 3.
3.1 Materiais .................................................................................................................................. 9 
3.2 Reagentes ................................................................................................................................ 9 
3.3 Método .................................................................................................................................... 9 
 RESULTADOS E DISCUSSÕES ......................................................................................................11 4.
 CONCLUSÃO ..............................................................................................................................13 5.
 QUESTIONÁRIO .........................................................................................................................14 6.
 TOXICIDADE ..............................................................................................................................15 7.
 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................................16 8.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 OBJETIVO 1.
 
Determinação colorimétrica de proteínas através da reação de Biureto, pelo método 
de espectrofotometria, realizar o gráfico absorbância versus concentração, e 
encontra o valor da concentração de uma determinada solução através da equação 
da reta obtida pelo gráfico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 INTRODUÇÃO 2.
 
2.1 Métodos para determinação de proteínas 
 
Métodos para determinação de proteínas totais são muito utilizados por 
profissionais de diversas áreas como as de pesquisas, análises clínicas, indústria de 
alimentos e para escolha desse método leva-se em conta custo dos reagentes, 
tempo de análise e interferentes envolvidos. O desenvolvimento dessas 
metodologias auxilia no diagnóstico de doenças relacionadas à quantidade de 
proteínas presentes em fluídos biológicos, no aproveitamento de nutrientes na 
fabricação de alimentos para animais, no trato de doenças ligadas à nutrição 
humana como obesidade e anorexia e para purificação e determinação de proteínas 
e enzimas em estudos químicos (Zaia, 1998). 
Existem vários métodos para determinação de proteínas, os mais utilizados 
utilizam a espectrofotometria na região do ultravioleta e do visível (UV-Visível). Não 
existe um método universal para determinação de proteínas totais, os mais 
conhecidos são o do biureto, de Lowry, do “Coomassie brilliant blue” BG-250 ou 
reagente de Bradford, do BCA ou reagente de Smith, e de absorção de proteínas no 
ultravioleta (Zaia, 1998). 
 
2.2 Método de Biureto 
 
O Biureto é um composto formado pelo aquecimento da ureia à 180°C, devido 
à semelhança desse composto com as estruturas das proteínas é que foi dado este 
nome ao método de análise (Miwa, 2003). 
O método se dá pela aplicação do reativo de Biureto (hidróxido de sódio e 
sulfato de cobre) em uma solução de proteína, o cobre é estabilizado em solução 
com o auxílio do tartarato de sódio, o que ocorre é que o cobre se complexa com a 
proteína em meio alcalino formando uma ligação quadrado planar com a ligação 
peptídica, para que essa reação ocorra é necessário no mínimo duas ligações 
peptídicas (Zaia, 1998). Na formação do complexo íon cobre tetracoordenado, o 
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cobre liga-se a quatro nitrogênios das ligações peptídicas adjacentes havendo a 
perda de um próton de cada grupo amino substituído (Miwa, 2003). 
Figura 1: Complexo íon cobre e ligações peptídicas. 
 
 
A intensidade da coloração desta reação é linearmente proporcional à 
quantidade de proteínas presentes na solução (Miwa, 2003). Para analise 
espectrofotométrica o método de biureto possui dois picos de absorção um em 
270nm e outro em 540nm, sendo que este é mais utilizado mesmo aquele sendo 
seis vezes mais sensível para este método, porém nesta região várias outras 
substâncias possuem absorção podendo causar interferências na análise (Zaia, 
1998). 
Este método apresenta as características de ser rápido, seus reagentes são 
de baixo custo e não apresenta grande variação de absortividade para diversos tipos 
de proteínas ele é muito utilizado para determinação de proteínas em soro ou 
plasma sanguíneo, líquido cérebro espinhal (líquor), urina, alimentos, saliva, tecido 
animal (Zaia, 1998). 
Apesar de ser muito utilizado, sua sensibilidade não é muito grande em 
comparação com outros métodos analíticos além também de possuir alguns 
interferentes como bilirrubina, lipídeos, amônio, hemoglobina entre outros, para 
esses casos recomenda-se a precipitação das proteínas com ácido tricloroacético e 
posterior solubilização para determinação das mesmas (Zaia, 1998). 
 
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2.3 Espectrofotometria de Absorção Molecular. 
 
A técnica de espectrometria de absorção molecular é uma das técnicas mais 
utilizadas para analises, pois se trata de uma técnica que requer um custo 
relativamente baixo em equipamentos e em treinamentos de usuários (NEAL, 2000). 
Esta técnica baseia-se no fato de que espécies moleculares e iônicas são capazes 
de absorver energia de uma fonte de radiação (LEAL, et. al. 2007), cada molécula 
absorve em um comprimento de onda específico (CAREY, 2008). 
 
Figura 2: Esquema do funcionamento interno de um espectrofotômetro. 
 
 A luz branca ou visível está contida em uma faixa do espectro 
eletromagnético que varia de 400nm (violeta) a 800nm (vermelho) (CAREY, 2008). A 
intensidade da luz absorvida por uma amostra depende do espaço entre seus níveis 
de energia e o encontro destes com os feixes de luz do monocromador (NEAL, 
2000). A concentração de uma solução não é medida diretamente e sim relacionada 
com a potência da radiação que é incidida sobre amostra, pois uma partedesta é 
absorvida e o restante atravessa o meio, sendo este fenômeno descrito pela Lei de 
Lambert-Beer que relaciona a absorbância e a transmitância que há em uma 
amostra quando a ela se aplica uma radiação (LEAL, et. al. 2007). Em consequência 
da lei de Lambert-Beer os dados da absorbância são adquiridos como indicador de 
concentração e o espectro de absorção de moléculas em solução é muito grande 
(NEAL, 2000). 
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Segundo Leal, et. al. (2007): 
 
“A lei que rege o processo de absorção de radiação é a Lei 
de Lambert-Beer, que estabelece a relação entre as absorvân- 
cia (A), que corresponde ao inverso do logaritmo decimal da 
transmitância, e a concentração da espécie absorvente. 
 
log P0 / P = log (I/T) = A= ɛ.b.c 
 
onde: ɛ é a absortividade molar do analito, b é o comprimento 
do percurso ótico e c a concentração da substância absorvente,” 
 
Na espectrofotometria na região do Visível, utilizam-se soluções de 
substâncias coradas como na técnica de Colorimetria, onde se compara a cor de 
soluções de concentrações conhecidas com a de concentração desconhecida, 
porém na espectrofotometria utiliza-se, ao invés do olho humano, aparelhos que 
emitem radiação e o comprimento de onda é selecionado por um monocromador e 
há um detector que faz as medidas de absorbância (LEAL, et. al. 2007). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 PROCEDIMENTOS 3.
 
3.1 Materiais 
 
- Tubo de ensaio 
- Pipetas 
- Bequer 
- Bico de Bunsen 
 
3.2 Reagentes 
 
- Solução de Albumina 1% 
- Solução de Albumina 2% 
- Solução de Albumina 4% 
- Solução de Albumina 6% 
- Solução de Albumina 8% 
- Solução de Albumina desconhecida 
- Solução estoque de Biureto: 
 Tartarato de sódio e potássio 45 g 
 Solução de hidróxido de sódio (0,2 M) 400 mL 
 Solução de sulfato de cobre II pentahidratado 15 g 
 Iodeto de potássio 5 g 
 
3.3 Método 
 
Inicialmente pegou-se sete tubos de ensaio e numerou-se. Ao tubo número um, 
adicionou-se 1 mL da solução de albumina 1%. Ao tubo número dois, adicionou-se 1 mL da 
solução de albumina 2%. Ao tubo número três, adicionou-se 1 mL da solução de albumina 
4%. Ao tubo número quatro, adicionou-se 1 mL da solução de albumina 6%. Ao tubo número 
cinco, adicionou-se 1 mL da solução de albumina 8%. Ao tubo número seis, adicionou-se 1 
mL da solução de albumina desconhecida. E, finalmente, ao tubo de número sete, 
adicionou-se 1 mL de água destilada. 
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Em seguida, acrescentou-se a cada tubo 5 mL de solução diluída de Biureto. 
Colocou-se os tubos de ensaio em banho-Maria por aproximadamente 30 minutos. Ao retirá-
los do banho-maria, leu-se a absorbância a 540 nm e anotaram-se os resultados obtidos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 RESULTADOS E DISCUSSÕES 4.
 
Tubos Concentração Absorbância 
Tubo 7 0,000 0,000 
Tubo 1 1,667 0,200 
Tubo 2 3,333 0,330 
Tubo 3 6,667 0,476 
Tubo 4 10,000 0,656 
Tubo 5 13,333 0,773 
 
 
 
O gráfico demonstra a absorbância nas concentrações pré-modificadas, pois 
a solução continha 1 mL da solução de albumina e foi diluída para 6 mL, pois ao 
adicionar os 5 mL de Biureto, a concentração é modificada. Então, o gráfico foi 
elaborado após os cálculos de M1.V1=M2.V2. 
 
 
 
 
 
 
 
y = 0,0551x + 0,0845 
R² = 0,9647 
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
0,000 5,000 10,000 15,000
Absorbância 
Absorbância
Linear (Absorbância)
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 O tubo número 7 foi utilizado como branco, continha somente água destilada 
e com ele, calibrou o espectrofotômetro para que começasse com a absorbância 
igual a 0. 
 A equação da reta obtida foi y = 0,0551.x + 0,0845, e o R2 = 0,9647, sendo o 
valor do R2 satisfatório, pois quanto mais próximo de 1 melhor. 
 Era necessário descobrir a concentração da solução 6, a partir da equação do 
gráfico, o valor da sua absorbância obtida no experimento foi 0,538, então o valor da 
concentração será de 8,230 M. Vendo pelo gráfico, esta molaridade está correta, 
pois a absorbância está entre as das soluções 3 e 4. E a molaridade inicial, seria de 
49,40 M. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 CONCLUSÃO 5.
 
O experimento foi interessante, pois teve um primeiro contato com o 
espectrofotômetro, que é um instrumento importante para determinações na química 
analítica. 
A utilização de Biureto nos mostra que diferentes compostos podem reagir de 
diferentes formas com proteínas e aminoácidos, sendo que a reação do Biureto 
ocorre com proteínas com mais de duas ligações peptídicas, diferentemente da 
Ninhidrina que já foi utilizada em outros experimentos, que reage com os grupos 
amina de aminoácidos e proteínas. 
Os valores obtidos no gráfico foram satisfatórios, pois foi possível encontrar o 
valor da solução de concentração desconhecida, sendo ela 8,230 M, e a inicial 
sendo 49,4 aproximadamente 5% de Albumina na solução. Ficando estes valores 
entre os valores do tubo 3, 6,667 M e Abs. 0,476, e o tubo 4, 10,000 M e Abs. 0,656. 
O resultado da concentração ficou no intervalo esperado, sendo que pode 
haver erros por ser um resultado experimental e com poucos números para serem 
comparados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 QUESTIONÁRIO 6.
 
1) Porquê está técnica é denominada de reação do Biureto? 
Porque o Biureto forma um complexo com o íon cúprico, em meio básico, quando 
entra em contato com proteínas que contem mais de duas ligações peptídicas, e a 
composição do Biureto contem hidróxido de sódio e sulfato de cobre II 
pentahidratado. Quando o Cobre reage com o Carbono alfa e com o Nitrogênio das 
ligações peptídicas, há a formação de um complexo púrpura, tendo um pico de 
absorção a 540 nm, e quando a concentração da solução é diferente, a absorbância 
também é diferente, fazendo com que a partir da equação da reta obtida pelo gráfico 
seja possível calcular a concentração de uma solução cuja concentração seja 
desconhecida. 
2) Quais são os tipos de compostos em que a reação de Biureto dá positivo? 
O teste de Biureto só é possível com proteínas que contenham mais de dois enlaces 
peptídicos, ou seja, mais de 3 aminoácidos ligados, não dando o mesmo resultado 
com aminoácidos e com dipeptídeos. Diferentemente da Ninhidrina, que reagia com 
aminoácidos. 
3) Enuncie a Lei de Lambert-Beer utilizada nessa técnica. 
Para encontrar a concentração da solução desconhecida, é necessário relacionar 
com a Lei de Lambert-Beer, que relata que a absorbância é diretamente 
proporcional à concentração da espécie absorvente, quando se mantem o caminho 
óptico constante. Utilizamos a reação: Absorbância = ε (absortividade molar) x C 
(concentração da substância). A absorbância é lida no espectrofotômetro, e a 
absortividade é encontrada na equação da reta do gráfico. 
4) Qual a relação entre absorbância e transmitância? 
 A absorbância é diretamente proporcional a concentração da espécie absorvente, e 
a fração de luz que passa por uma amostra é a transmitância que está relacionada 
logaritmicamente com a concentração. Para encontrar a absorbância das soluções, 
é necessário deixar a transmitância em 1,00, pois assim a absorbância fica em 0,00 
e é possível obtê-la de forma correta. 
5) De acordo com seus dados experimentais (gráfico obtido por meio do 
experimento) qual seria a concentração das seguintes substancias desconhecidas 
cuja absorbância após a reaçãodo Biureto foram de: 
a) 0,126 b) 0,315 c) 0,0 
Equação da reta: y = 0,0551.x + 0,0845 
a) 0,753 M b) 4,183 M c) 0,000 M 
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 TOXICIDADE 7.
 
Albumina: não tóxico, por ser formada por aminoácidos essenciais. 
Biureto: irritação cutânea, irritação ocular, pode provocar irritação nas vias 
respiratórias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 8.
 
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médio/volume único. São Paulo: Ed. FTD, 2005. 
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Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. 
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CAREY, F. A. Química Orgânica. vol. 1. Sétima Edição. The McGraw-Hill 
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LEAL, A. A. X. HENRIQUES, C. A. LUNA, A. S. Validação e Estimativa da 
Incerteza do Método de Determinação do Fósforo por Espectrofotometria UV-VIS. 
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NEAL, S. L. Ultraviolet and Visible Molecular Absorption and Fluorescence 
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17 
 
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via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Química 
Nova. n. 21 Jun. 1998. p 787- 793.