Prática 7 bqi 101 p (1)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE 
 DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR 
BQI 101 – Laboratório de Bioquímica I 
Relatório da Aula Prática Nº 7 
Dosagem de proteínas pelo Método de Biureto 
 
Ana Carolina Monteiro Agripino – 109451 
 
Igor Henrique Martins - 109476 
 
Pedro Emanuel Costa Vilhete - 112769 
 
 
 
 
 
 
Professora: Valéria Monteze 
 
Número de Turma: 11 
 
Horário da aula: 08h às 10h 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Viçosa (MG), 24/07/2024 
INTRODUÇÃO: 
 
As proteínas são compostos essenciais na biologia, formados por cadeias de aminoácidos 
conectados por ligações peptídicas. Elas desempenham papéis fundamentais na estrutura 
celular, atuam como hormônios e constituem fontes nutricionais importantes, como no caso 
do leite, que é o foco deste estudo. 
O leite, usado como amostra biológica, contém três principais proteínas: lactoalbumina, 
lactoglobulina e caseína. O objetivo é determinar suas quantidades em amostras de leite 
desnatado 
 
Figuras 1, 2 e 3: Imagens representativas das proteínas majoritárias do leite 
 Para essa quantificação, a escolha do método adequado é crucial e depende de vários 
fatores, incluindo a natureza da proteína, solubilidade, localização celular, presença de 
solventes interferentes, além de considerações de rapidez, sensibilidade e 
eficiência.natureza da proteína (enzima, solubilidade, localização celular) 
Após considerar esses fatores, optou-se pelo método do Biureto, que se baseia na 
reação das proteínas com sais de cobre em meio alcalino. O reagente de biureto (uma 
solução de sulfato de cobre e hidróxido de sódio) é crucial para assegurar a sensibilidade e 
eficiência da técnica. A interação dos grupos -NH das cadeias peptídicas com íons cúpricos 
forma complexos que conferem uma coloração violeta à solução, cuja intensidade está 
diretamente relacionada com a concentração de proteína presente. 
É importante salientar que o método do Biureto pode detectar concentrações de 
proteína na faixa de 1 a 5 mg/mL de solução. Caso a concentração seja inferior a essa faixa, 
é necessário concentrar a solução; se for superior, deve ser diluída. 
Após a formação de uma solução colorida, utiliza-se um espectrofotômetro (Anexo 1) 
para medir a intensidade da cor. Os métodos espectrofotométricos são amplamente utilizados 
na quantificação de proteínas. O espectrofotômetro emite luz que passa por um prisma, 
decompondo-a em diferentes comprimentos de onda. Um filtro seleciona um comprimento de 
onda específico que atravessa a solução contida em uma cubeta de espessura conhecida 
(Anexo 2). Parte dessa luz é absorvida pela solução (absorvância), e o restante é transmitido. 
A absorvância é determinada pela diferença entre a intensidade inicial do feixe incidente e a 
transmitida pela cubeta. (transmitância). 
O valor da absorvância é obtido a partir da subtração entre o valor do feixe incidente 
e o de transmitância. 
 
Figura 4: espectrofotômetro 
 
Figura 5: funcionamento de um espectrofotômetro 
A relação entre absorvância e concentração segue a lei de Lambert-Beer, expressa pela 
equação A = k.c.l, onde A é a absorvância, k é o coeficiente de absorção específico da 
substância, c é a concentração do analito, e l é o caminho óptico (ou caminho de célula). 
Para determinar a concentração da solução de interesse, constrói-se uma curva padrão 
experimentalmente em laboratório. Essa curva relaciona a absorvância medida com 
diferentes concentrações conhecidas do analito (Figura 6). 
 
 
 
Figura 6: Gráfico da relação entre absorvância e concentração e a curva padrão 
 
 Nessa prática, a curva de calibração foi feita a partir do seguinte procedimento: 
1. Preparação de cinco soluções de proteína em tubos de ensaio, cada uma com 
concentração conhecida, misturando 4 mL de reagente do biureto com 1 mL 
da solução padrão de proteína. As concentrações variaram de 1 mg/mL a 5 
mg/mL. 
2. Preparação da solução de referência ("Branco") contendo 4 mL de reagente 
do biureto e 1 mL de água destilada. 
3. Ajuste do espectrofotômetro para leitura a 540 nm 
4. Medição das absorvâncias dos tubos de ensaio e registro dos valores. 
5 Construção do gráfico de absorvância versus concentração e determinação da 
equação da reta Y = ax + b, onde Y é a absorvância e x é a concentração padrão, 
utilizando métodos estatísticos adequados. 
 
 
 
6 Verificação da correlação entre as variáveis por meio do coeficiente de 
correlação linear (R). 
 
 
 
OBJETIVOS: 
O propósito desta atividade é utilizar o método do biureto para quantificar as proteínas 
presentes no leite e calcular suas concentrações percentuais. Especificamente, o objetivo 
inclui a interpretação da lei de Lambert-Beer, o uso prático do espectrofotômetro, a 
construção da curva-padrão para correlacionar absorvância com concentração, a 
determinação das concentrações das proteínas utilizando a equação linear derivada da curva-
padrão, e o cálculo do fator de diluição quando necessário. 
 
Essas etapas são fundamentais para uma análise precisa das proteínas no leite, seguindo 
métodos científicos rigorosos e técnicas analíticas bem estabelecidas. 
 
RESULTADOS E DISCUSSÃO: 
Na primeira etapa do experimento, procedeu-se à construção da curva de calibração. 
Para isso, prepararam-se seis tubos de ensaio contendo diferentes concentrações 
conhecidas das soluções padrões de proteínas, cada uma misturada com o reagente de 
biureto. Após 15 minutos para reação, as soluções foram então submetidas à leitura de 
absorbância no espectrofotômetro. Os resultados obtidos estão detalhados a seguir: 
N 
Concentraç 
ões (x) 
Absorbânci 
a (y) 
x.y x^2 y^2 
1 1 0,041 0,041 1 0,001681 
2 2 0,079 0,158 4 0,006241 
3 3 0,111 0,333 9 0,012321 
4 4 0,170 0,68 16 0,0289 
5 5 0,269 1,345 25 0,072361 
somatório 15 0,67 2,557 55 0,121504 
 
 
 
 
 
 
Resolvendo as equações das incógnitas a e b: 
 
 
Na segunda parte da prática, o objetivo era quantificar as proteínas presentes no 
leite. Foram preparadas duas amostras para análise: 
1. A primeira amostra consistia em 10 mL de água misturados com 10 mL de 
leite desnatado. Esta solução foi titulada com HCl a 2% até alcançar 2,2 mL 
de volume total. 
2. A segunda amostra foi preparada com 19 mL de água e 1 mL de leite 
desnatado. 
Ambas as amostras foram então submetidas à análise no espectrofotômetro, e os 
resultados obtidos foram os seguintes: 
Amostra Absorvância 
1 0,126 
2 0,167 
Com esses valores e a equação obtida pela curva de calibração, é possível obter os 
valores das concentrações das amostras: 
Amostra 1 Amostra 2 
A = 0,0547 C - 0,0301 
0,126 = 0,0547 C - 0,0301 
C = 2,854 g/L 
A = 0,0547 C - 0,0301 
0,167 = 0,0547 C - 0,0301 
C = 3,579 g/L 
No entanto, tais valores são dessa concentração diluída, ou seja, é necessário utilizar 
os valores dos fatores de diluição, de acordo com o preparo das amostras, para encontrar a 
concentração de proteínas do leite: 
FD1 = Vtotal / Vleite = 10 mL+10mL+2,2L / 10mL = 2,22 
FD2 = Vtotal / Vleite = 1 mL+19mL / 1mL = 20,0 
Amostra I: 
2,854 x 2,22 = 6,33588 mg. mL (Concentração de lactoproteínas) Amostra 
II: 
3,579 x 20,0 = 71,589 mg. mL (Concentração de proteínas TOTAIS) 
Concentração em porcentagem de Caseína e Lactoproteínas no leite: 
71,58 - 6,33588 = 65,24412 mg/mL 
(65,24412/71,58) . 100 = 91,15% (Caseína) 
(6,33588/71,58) . 100 = 8,85% (Lactoproteínas) 
CONCLUSÕES: 
Após a realização da prática, pode-se concluir que o método do Biureto demonstrou ser 
altamente eficaz na quantificação de proteínas no leite. Este método utiliza um reagente 
contendo cobre que, em meio alcalino, reage com as proteínas formando uma solução violeta. 
A absorvância desta solução é medida a um comprimento de onda de 540 nm no 
espectrofotômetro. 
Observou-se uma relação diretamenteproporcional entre a absorvância e a concentração de 
proteínas nas soluções analisadas. Isso significa que é possível determinar a concentração 
das proteínas em uma substância conhecendo-se sua absorvância. 
Esses resultados reforçam a eficiência do método do Biureto como uma técnica robusta e 
confiável para análise quantitativa de proteínas, oferecendo uma ferramenta precisa e 
amplamente utilizada em estudos laboratoriais e industriais relacionados à bioquímica e à 
análise de alimentos. 
 
 
 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: 
LEHNINGER, A.L., NELSON, D.L., COX, M.M. Princípios de Bioquímica. 4 Ed. São Paulo:Ed. 
Sarvier, 2007. 1202p 
Curva padrão. Acesso em: 16/10/2023 
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/5646438/mod_resource/content/1/Teoria_CurvaPad
r 
ao.pdf#:~:text=Uma%20curva%2Dpadrão%20é%20utilizada%20para%20determinar%20qu 
antitativamente%20uma%20propriedade,colorimétrico%2C%20o%20ensaio%20de%20Brad 
ford. 
ANEXOS: 
Anexo 1: Anexo 2: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Anexo 3: Anexo 4: 
 
 
Anexo 5 Anexo 6 (Amostra com leite desnatado) 
 
 
 
 
 
 
RESOLUÇÃO DOS EXERCÍCIOS DO CADERNO DIDÁTICO: 
1. Enuncie a lei de Lambert-Beer. Discuta se as soluções-padrão de proteína 
obedeceram a esta lei nas concentrações avaliadas 
A lei de Lambert-Beer diz que a transmitância depende da natureza da substância (k) 
que absorve a luz, da concentração desta (c) e da espessura da solução atravessada pela 
luz (l). Essas grandezas relacionadas são descritas pela lei: T = 10 -kcl 
Aplicando o logaritmo decimal nos dois lados da equação: log T = -kcl e -log T = kcl 
Portanto, -log T é chamado de absorvância e é diretamente proporcional à 
concentração e à espessura da solução. 
Relacionando a teoria com o que foi visto no experimento, pode-se concluir que as 
proteínas estão, sim, de acordo com essa lei, uma vez que o tom violeta se intensificou 
proporcionalmente às concentrações das soluções. 
2. Cite as razões pelas quais se empregou o comprimento de onda de 540 nm 
nesse experimento. 
O comprimento de onda 540 nm foi escolhido pois ele é o ideal de absorvância no 
biureto, já que, para calcular a absorvância é preciso usar um comprimento de onda 
que deixa passar apenas a faixa de comprimento de energia desejada. 
3. Por que se utiliza sempre um branco na dosagem colorimétrica? 
O espectrofotômetro tem seu funcionamento a partir de um feixe de luz 
monocromático que atravessa uma cubeta. No entanto, ao atravessar, é possível que 
esse feixe sofra refração, reflexão, absorção e até outras interações indesejáveis. 
Para conter tais interferências, o aparelho deve ser zerado com uma solução de 
referência do experimento desejado, chamada “branco”. Esse branco é necessário ser 
utilizado sempre que a absorvância da mistura de reagentes no comprimento de onda 
utilizado for diferente da absorvância da água. 
4. Discuta a utilidade de uma curva padrão e o método utilizado para o cálculo 
A curva-padrão pode ser utilizada em várias situações e, no geral, seu objetivo é 
determinar quantitativamente uma propriedade de uma amostra desconhecida a partir de 
uma amostra conhecida que tenha a mesma propriedade. Neste caso, a Lei de Lambert-
Beer pode ser utilizada para o cálculo, já que absorvância de determinado comprimento 
de onda é diretamente proporcional à concentração da substância. 
5. Qual a razão de se proceder à diluição do leite no preparo das amostras I e II? O 
método do Biureto é efetivo na dosagem de proteínas de uma solução apenas quando 
a concentração de proteínas da mesma está entre 1 e 5 mg/mL. A concentração de 
proteínas do leite puro está bem acima dessa faixa, por isso, é necessário diluir tal 
substância até que ela esteja de acordo com os padrões ideais para o teste ser bem 
realizado. 
6. Por que o fator de diluição da amostra II teve que ser maior do que o da amostra 
I? 
A amostra l é feita com a solução filtrada, ou seja, uma das proteínas do leite, a 
caseína, ficou retida no filtro e não está contida na amostra. Devido a esse fato, a 
concentração da solução filtrada é bem pequena, já que a proteína em maior 
quantidade do leite não está na amostra l, o que faz com que a amostra chegue na 
concentração ideal sem tanta diluição. No entanto, a amostra ll foi feita com o leite 
desnatado em si, todas as proteínas estavam contidas ali, por isso, a diluição teve que 
ser bem maior, uma vez que a concentração de proteínas era bem maior do que o da 
amostra l. 
7. A uma amostra de 20 mL de leite adicionaram-se 30 mL de H20 e 4 mL de HCI 0,2 
mol/L. Após filtração, 1 mL do filtrado foi retirado e submetido à reação do 
Biureto (conforme visto em prática). Depois de completada a reação, fez-se a 
leitura da absorvância a 540 mm, obtendo-se o valor de 0,215. Pergunta-se: 
a. Sabendo-se que a equação da reta para a curva-padrão de proteína foi Y = 0,05 
x - 0,002, qual é a concentração de proteínas da amostra? 
Como nos foi dada a equação da curva-padrão da proteína, é necessário, 
apenas, substituir os valores fornecidos. Sabendo que Y é a absorvância e x 
é a concentração, temos: 
Y=0,215 → 
0, 215 = 0, 05𝑥 − 0, 002 → 0, 213 = 0, 05𝑥 → 𝑥 = 4, 26𝑔/𝐿 
 
 
b. Quais proteínas podem ser quantificadas com este procedimento? 
Justifique 
A adição do HCl à solução de água e leite desnatado, faz com que a caseína 
se precipite devido à isoeletricidade. Com a filtragem da solução, a caseína 
fica retida no filtro e na solução passam as lactoalbuminas e lactoglobulinas, 
essas que serão possíveis de ser quantificadas.