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DINORAH ZILBERSZTAJN GOTLIEB Estudo da expressão da miostatina em modelos murinos para doenças neuromusculares São Paulo 2011 Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto de Biociências, para obtenção do Título de Mestre em Biotecnologia. Dinorah Zilbersztajn Gotlieb ESTUDO DA EXPRESSÃO DA MIOSTATINA EM MODELOS MURINOS PARA DOENÇAS NEUROMUSCULARES. São Paulo 2011 Área de concentração:Genética Orientadora: Profa. Dra. Mariz Vainzof Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação Interunidades em Biotecnologia USP/Instituto de Biociências, para obtenção do Título de Mestre em Biotecnologia. Ao meu querido marido e aos meus anjos chamados pai e mãe. AGRADECIMENTOS AGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOS AGRADECIMENTOS Agradeço especialmente à orientadora Prof. Dra. Mariz Vainzof pela oportunidade de realizar o mestrado em seu laboratório do Centro de Estudos do Genoma Humano na USP, me ensinando com seu próprio exemplo o que é ser uma pesquisadora justa, cativante e por ter muita paciência comigo. A FAPESP e ao CNPq pelo fomento deste estudo. Aos meu colegas e amigos do laboratório de proteínas André, Áurea, Danielle Ayub, Lydia Yamamoto, Paula Onofre, Poliana , Camila e Vanessa por doarem alguns instantes ou horas do seu tempo se dedicando para me ajudarem em varias etapas deste estudo, e por contribuir para uma rotina de trabalho harmoniosa. Aos recém chegados no laboratório Amanda, Henrique, Letícia, Priscila, Stephanie e Thais, que já demonstraram o quanto são capazes e podem crescer muito dentro da pesquisa acadêmica. Aqueles que passaram, deixando suas marcas na minha vida profissional e pessoal, contribuindo para aumentar meu conhecimento em diversas áreas. Agradeço aos demais pesquisadores e trabalhadores do Centro de Estudos do Genoma Humano por contribuir com a dinâmica, informática, atendimento, limpeza, contabilidades e segurança do espaço onde foi realizado o presente estudo. A Clarice Gotlieb, que é uma ótima sogra e ajuda em tudo que é possível. Agradeço ao meu marido pela ajuda na revisão deste trabalho, pela compreensão e apoio nos dias que eu precisava de concentração para finalizar o trabalho e por todos os dias que virão e estaremos juntos colhendo os frutos de muita dedicação e carinho. Aos meus queridos irmãos Victor (por ajudar efetivamente na dissertação)e Renato que contribuíram de forma expressiva na minha personalidade, me ensinando muito sobre a vida, fé e perseverança. As minhas cunhadas e amigas Denise e Karen que participam da vida familiar com muita alegria. A minha sobrinha Tamar Victoria, nova integrante da família, que desde tão tenra idade já me alegra com sua serena presença despertando muita alegria no meu coração. Ao Todo Poderoso que provê todas as minhas necessidades. O último porem o agradecimento mais importante: Aos meus pais pelo amor infinito, por estarem sempre ao meu lado em todas as situações, pela paciência, dedicação integral para a minha formação intelectual e moral, através do exemplo de pessoas maravilhosas cuja honestidade, responsabilidade, trabalho, esperança, espiritualidade estão sempre presentes, e porque sem eles eu não teria alcançado este estágio da vida. Ao acender uma tocha, reúnem-se os que buscam a luz. Rebe de Lubavitch. RESUMO Zilbersztajn-Gotlieb D. Estudo da expressão da miostatina em modelos murinos para doenças neuromusculares. [dissertação (Mestrado em Biotecnologia)]. São Paulo: Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo; 2010. As afecções neuromusculares humanas constituem um grupo heterogêneo de doenças genéticas caracterizadas por degeneração muscular progressiva, levando ao desenvolvimento de fraqueza muscular e perda de capacidade motora. Mutações em vários genes resultam na deficiência ou perda de função de diversas proteínas musculares de importância significativa para o bom funcionamento do músculo. Algumas das doenças associadas a alterações nestas proteínas são as distrofias musculares progressivas e as miopatias congênitas.Entre os modelos naturais conhecidos para distrofias musculares humanas estão: o camundongo Dmdmdx, que apresenta deficiência total da proteína distrofina no músculo, modelo da distrofia muscular de Duchenne; o camundongo Lama2dy- 2J/J, que apresenta deficiência da proteína α2-laminina, modelo da DM congênita 1A; o camundongo Largemyd, com defeito na via de glicosilação da proteína α-DG, modelo da DM congênita tipo 1D; e o camundongo SJL/J, com deficiência da proteína disferlina, modelo da distrofia das Cinturas tipo 2B. Todos constituem excelentes modelos para estudos histológicos e fisiopatológicos e vêm sendo utilizados para testar terapias. A proteína miostatina, é um membro da superfamília de fatores de crescimento TGF-β. Ela age como regulador negativo (inibidor) do crescimento muscular. Diversos estudos sugerem a inibição da miostatina como parte de tratamentos para recuperação de massa muscular degenerada em doenças como as distrofias musculares. Entretanto, ainda não é conhecido o real papel da miostatina no quadro distrófico. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a expressão desta proteína nos diversos modelos de degeneração muscular através da avaliação de diferentes músculos de camundongos das linhagens distróficas Dmdmdx, SJL/J, Largemyd e Lama2dy-2J/J. Para tal, quantificamos o mRNA da miostatina e do gene endógeno GAPDH por técnica de PCR em tempo real, e comparamos os resultados de expressão com o padrão de degeneração e regeneração de cada músculo e linhagem, através da avaliação histopatológica.Observamos que em camundongos normais, a miostatina é menos expressa no músculo gastrocnêmio do que no diafragma, refletindo um músculo mais sujeito a lesão. Nas quatro linhagens de camundongos distróficos, independentemente da mutação ou do grau de degeneração do músculo, a miostatina é menos expressa do que em camundongos normais. No músculo distrófico, a expressão da miostatina é inibida tanto no músculo gastrocnêmio como no diafragma, sem diferença entre os dois. A analise comparativa da degeneração e regeneração muscular com a expressão da miostatina mostrou uma maior correlação com o padrão de degeneração do que com a regeneração.Nossos resultados sugerem que o processo de degeneração, quando iniciado, e independentemente de seugrau, causa molecular primária, ou músculo afetado, parece atuar de forma similar na inibição da expressão da miostatina, possivelmente como estímulo a regeneração do dano. Palavras-chave: Distrofias musculares. Camundongos Modelos. Miostatina. ABSTRACT Zilbersztajn-Gotlieb D. Myostatin expression in mouse models of neuromuscular diseases.[Masters thesis (Human Genetic)]. São Paulo: Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo;2010. Human neuromuscular disorders are a heterogeneous group of genetic diseases, caused by mutations in genes coding sarcolemmal, sarcomeric, and cytosolic muscle proteins. Deficiencies or loss of function of these proteins leads to variable degrees of progressive loss of motor ability. Several animal models, displaying phenotypes observed in neuromuscular diseases, have been identified. These models generally present physiological alterations observed in human patients and can be used as important tools for genetic, clinic, and histopathological studies. Among them, the Dmdmdx mouse, which has total deficiency of dystrophin in the muscle, is a model for Duchenne muscular dystrophy; Lama2dy2J/J mouse, which has a deficiency of protein α2-laminin, is a model of congenital DM 1A; Largemyd mouse, defective in α-DG protein glycosylation pathway, is a model of congenital DM type 1D, and SJL/J mouse, with deficiency of the protein dysferlin, is a model of the limb girdle muscular dystrophy type 2B. The protein myostatin, a member of the growth factors TGF-β superfamily, is a negative regulator (inhibitor) of muscle growth. Several studies have suggested the inhibition of myostatin as a therapeutic strategy for the stimulation of the regeneration of the dystrophic muscle. However, the expression and role of myostatin in the dystrophic muscle is still not totally elucidated. Therefore, the main objective of this work was to evaluate the expression of this protein in two different muscles of four mouse models for muscle degeneration, as compared to normal controls. The included dystrophic mice strains were: Dmdmdx, SJL / J, Largemyd and Lama2dy2J/J. The relative expression of the myostatin mRNA was analyzed in the gastrocnemius and diaphragm muscles by real time PCR, the results were correlated with the histopathological findings of each muscle. It was observed that in normal mice muscles, myostatin is less expressed in the gastrocnemius than in the diaphragm, reflecting a muscle most prone to lesions. In the four strains of dystrophic mice myostatin expression is reduced, independently of the primary molecular defect or the degree of degeneration of the studied muscles, with a similar pattern in both gastrocnemius as diaphragm muscles. The comparative analysis of the histopathology of the muscles with the expression of myostatin showed a stronger correlation with the pattern of degeneration then regeneration. Our results suggest that, when started, the process of degeneration of the muscle, independently of the primary molecular defect, or degree, seems to act in a similar pathway leading to the inhibition of the expression of myostatin in the affected muscles, possibly as a stimulus to regeneration of damage. Keywords: Muscular dystrophies. Mouse models. Myostatin. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 17 1.1 O MÚSCULO NORMAL ..................................................................................................... 17 1.1.2 O tecido muscular no desenvolvimento embrionário .......................................... 17 1.1.3 O tecido muscular maduro .......................................................................................... 18 1.1.4 Regeneração muscular ................................................................................................. 22 1.2 O MÚSCULO DISTRÓFICO .............................................................................................. 23 1.2.1 Distrofias musculares progressiva ........................................................................... 23 1.2.2 Modelos animais para distrofias musculares ......................................................... 25 1.2.2.1 Distrofinopatias ........................................................................................................... 26 1.2.2.2 Deficiência de alfa 2 laminina .................................................................................. 26 1.2.2.3 Disferlinopatias ........................................................................................................... 27 1.2.2.4 Defeitos de glicosilação ............................................................................................ 27 1.3 MIOSTATINA ....................................................................................................................... 28 1.3.2 Expressão da Miostatina durante o desenvolvimento ........................................ 29 1.3.3 Função da miostatina e associação com doenças .............................................. 30 1.3.4 Inibição da Miostatina como abordagem terapêutica .......................................... 31 2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 33 3 MATERIAL E METODOLOGIA ...................................................................................... 34 3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA .................................. 34 3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPAGEM....................................................................... 34 3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DOS MÚSCULOS .......................................................... 36 3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS .......................................................... 36 3.5 HISTOLOGIA ....................................................................................................................... 37 3.5.1 Coloração de Hematoxilina-Eosina (HE) .................................................................. 37 3.5.2 Coloração com Picro Sirius® ....................................................................................... 37 3.6 ESTUDOS MOLECULARES ............................................................................................. 38 3.6.1 Extração de RNA total ................................................................................................... 38 3.6.2 Síntese de cDNA total ................................................................................................... 38 3.6.3 Análise de Expressão da miostatina ......................................................................... 38 3.6.4 PCR em Tempo Real (Q-PCR)- quantificação relativa da expressão da miostatina ............................................................................................................................ 39 4 RESULTADOS ..................................................................................................................... 40 4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA .............................................................................. 40 4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOSTATINA ............................................................. 41 4.2.1 Análise semiquantitiva.................................................................................................. 41 4.2.2 Análise quantitativa da expressão da miostatina por PCR em tempo real (qRT-PCR) ................................................................................................................................. 45 4.2.2.1 Padronizaçãoda metodologia para os genes em estudo ................................ 45 4.2.2.2 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio do grupo controle ..................................................................................................................... 47 4.2.2.3 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio dos diferentes grupos de animais distróficos................................................................. 49 4.2.2.4 Teste com normalizador específico para cada músculo .................................. 50 4.2.2.5 Análise da miostatina por linhagem (diafragma + gastrocnêmio) ................ 52 4.2.2.6 Análise comparativa da miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio em cada linhagem distrófica (um só normalizador – C5746D) ........ 52 4.3 Análise Histopatológica ................................................................................................... 53 5 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 61 5.1 A MIOSTATINA COMO ALVO PARA TERAPIAS ........................................................ 61 5.2 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA .............................................................................. 62 5.3 ESTUDO DA EXPRESSÃO RELATIVA DA MIOSTATINA ......................................... 64 5.3.1 Escolha do gene endógeno ......................................................................................... 64 5.3.2 Análise Semi quantitativa da miostatina .................................................................. 65 5.3.3 Análise por PCR em tempo real ................................................................................. 65 5.3.3.1 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio do grupo controle ..................................................................................................................... 66 5.3.3.2 Análise da Miostatina nos músculos diafragma e gastrocnêmio dos camundongos afetados ................................................................................................. 67 5.4 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ....................................................................................... 69 5.5 CORRELAÇÃO ENTRE EXPRESSÃO DA MIOSTATINA E PADRÃO DE DEGENERAÇÃO E REGENERAÇÃO MUSCULAR .................................................... 70 6 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 72 REFERÊNCIAS........................................................................................................................ 73 17 1111INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO 1.11.11.11.1O MÚSCULO NORMAO MÚSCULO NORMAO MÚSCULO NORMAO MÚSCULO NORMALLLL 1.1.2 1.1.2 1.1.2 1.1.2 O tecido muscular no desenvolvimento embrionário O tecido muscular no desenvolvimento embrionárioO tecido muscular no desenvolvimento embrionário O tecido muscular no desenvolvimento embrionário No início do estágio embrionário, na fase de nêurula, na parte paraxial da mesoderme forma-se os somitos, dos quais originam os tecidos muscular, ósseo, cartilaginoso e dérmico. O destino de cada região dos somitos é especificada por fatores secretados pelos tecidos adjacentes e sua localização em relação a eles. Figura 1-A mesoderme de um embrião no estágio de nêurula pode ser dividida em partes que darão origem aos diversos compartimentos, órgãos e tecidos do corpo. Em laranja esta destacada a região paraxial de onde serão formados grupos de células mesodérmicas chamadas somitos. Duas regiões dos somitos sofrem influencia de fatores secretados nas suas proximidades que induzem a formação do miótomo e consequentemente das células precursoras musculares. FONTE: modificado Gilbert (2000). A secreção parácrina de fatores específicos induz duas regiões dos somitos a sintetizarem fatores de transcrição miogênica bHLH (Basic helix-loop-helix) se caracterizando em miótomos assim dando origem aos mioblastos. Os mioblastos, células precursoras do músculo,tornam-se alongados, se alinham e se fundem para formação de miotubos multinucleados, resultando em células muito longas chamadas fibras musculares. Figura 2-No miotoma os mioblastos, células precursoras musculares, proliferam, sintetizam miogênicas bHLH, se alinham e se fundem para a formação de miotubos multinucleados. FONTE: modificado Gilbert (2000) A determinação dos mioblastos por diversos fatores de transcrição miogênicos (MYFs) pertencem à família protéica HLH (helix-loop-helix), que têm um papel fundamental na miogênese e na regeneração. Dentre estes, o MyoD (antígeno de dif expressão de genes em tempos diferentes durante a miogênese e é essencial no reparo de lesões musculares, uma vez que participa da ativação das células satélite (CS) (Hawke e Garry, 2001). O MYF5, estrutur determinação dos mioblastos durante o desenvolvimento embrionário, auxiliando na proliferação das CS (Hawke e Garry, 2001). A miogenina (MYF4) é um fator essencial para a diferenciação de células totipotentes em a linhagem miogênica e modulam a diferenciação final das CS; O Pax7 (paired box transcription factor 7), expresso em CS quiescentes e em proliferação. A expressão da miostatina é detectada nos miótomos, desde o iní formação do músculo esquelético adulto número de fibras, seu calibre e tamanho durante a miogênese embrionária, fetal e pós natal (Kambadur et al., 1997). 1.1.3 1.1.31.1.3 1.1.3O tecido muscula O tecido musculaO tecido muscula O tecido muscular maduro r maduror maduro r maduro As fibras musculares constituem três tipos de tecidos musculares: estr esquelético, estriado cardíaco e liso. Cada músculo é composto de muitos feixes de fibras musculares. Cada fibra tem diâmetro que varia entre 10 e 100μm, é formada por muitas miofibrilas de di o miotoma os mioblastos, células precursoras musculares, proliferam, sintetizam miogênicas bHLH, se alinham e se fundem para a formação de miotubos multinucleados. Gilbert (2000) A determinação dos mioblastos, e sua diferenciação em miotubos são controladas por diversos fatores de transcrição miogênicos (MYFs) pertencem à família protéica HLH helix), que têm um papel fundamental na miogênese e na regeneração. Dentre estes, o MyoD (antígeno de diferenciação miogênico – MYF3) atua na regulação da expressão de genes em tempos diferentes durante a miogênese e é essencial no reparo de lesões musculares, uma vez que participa da ativação das células satélite (CS) (Hawke O MYF5, estruturalmente relacionado ao MyoD, também atua na determinação dos mioblastos durante o desenvolvimento embrionário, auxiliando na proliferação das CS (Hawke e Garry, 2001). A miogenina (MYF4) é um fator essencial para a diferenciação de células totipotentes em músculo. A miogenina e MYF6 determinam a linhagem miogênica e modulam a diferenciação final das CS; O Pax7 (paired box transcription factor 7), expresso em CS quiescentes e em proliferação. A expressão da miostatina é detectada nos miótomos, desde o início da miogênese e permanece até a formação do músculo esquelético adulto. Acredita-se que este gene deve controlar o número de fibras, seu calibre e tamanho durante a miogênese embrionária, fetal e pós ., 1997). r maduro r maduror maduro r maduro As fibras musculares constituem três tipos de tecidos musculares: estr ado cardíaco e liso. Cada músculo é composto de muitos feixes de fibras musculares. Cada fibra tem varia entre 10e 100μm, é formada por muitas miofibrilas de di 18 o miotoma os mioblastos, células precursoras musculares, proliferam, sintetizam proteínas miogênicas bHLH, se alinham e se fundem para a formação de miotubos multinucleados. , e sua diferenciação em miotubos são controladas por diversos fatores de transcrição miogênicos (MYFs) pertencem à família protéica HLH helix), que têm um papel fundamental na miogênese e na regeneração. Dentre MYF3) atua na regulação da expressão de genes em tempos diferentes durante a miogênese e é essencial no reparo de lesões musculares, uma vez que participa da ativação das células satélite (CS) (Hawke almente relacionado ao MyoD, também atua na determinação dos mioblastos durante o desenvolvimento embrionário, auxiliando na proliferação das CS (Hawke e Garry, 2001). A miogenina (MYF4) é um fator essencial músculo. A miogenina e MYF6 determinam a linhagem miogênica e modulam a diferenciação final das CS; O Pax7 (paired box transcription factor 7), expresso em CS quiescentes e em proliferação. A expressão da cio da miogênese e permanece até a se que este gene deve controlar o número de fibras, seu calibre e tamanho durante a miogênese embrionária, fetal e pós- As fibras musculares constituem três tipos de tecidos musculares: estriado Cada músculo é composto de muitos feixes de fibras musculares. Cada fibra tem varia entre 10 e 100μm, é formada por muitas miofibrilas de diâmetro de 1 a 19 2μm, que correm longitudinalmente à fibra muscular. Por sua vez as miofibrilas são compostas por miofilamentos. É nos miofilamentos que se encontram as estruturas contráteis do músculo chamadas sarcômeros. Figura 3-Organização do músculo esquelético. Cada músculo é composto de muitos feixes de fibras musculares. Cada fibra muscular é composta por muitas miofibrilas, as quais são compostas por miofilamentos. FONTE: modificado Johnson e Raven, 2002. Os sarcômeros são constituidos principalmente por dois tipos de filamentos: filamento espesso, composto pela proteína miosina; filamento fino, formado por monômeros de actina, nebulina, tropomiosina e troponina. A organização destas proteínas revela sob microscopia eletrônica um padrão de bandas claras e escuras que se repetem ao longo dos miofilamentos (Figura 4). Figura 4-Eletronmicrografia de fibra muscular. A linha Z serve como bordas dos sarcômeros claramente visualizados em cada miofibrila. Os filamentos espessos compõem a banda A, os filamentos finos fazem parte da banda I e da banda A, sobrepondo os filamentos espessos. Na região central da banda A chamada por banda H, não há sobreposição dos filamentos, por isso a aparência mais clara. FONTE: modificado Johnson e Raven, 2002. Banda A Filamentos finos Filamentos espessos 20 As bandas espessas e escuras, denominadas bandas A, são compostas por filamentos de miosina combinadas em feixes. A miosina consiste de seis cadeias polipeptídicas – duas cadeias pesadas, de 220kD, cuja porção N-terminal, chamada cabeça, possui atividade ATPásica, e dois pares de cadeias leves diferentes, chamadas cadeias leves essenciais e cadeias leves regulatórias, cujo peso varia de 15 a 22kD, dependendo da sua proveniência. Figura 5-Representação de uma molécula de miosina representando 2 cadeias pesadas, parte torcida, e 2 cabeças parte globular. Parte de um feixe de miosinas na disposição que compõem o fila espesso das miofibrilas. FONTE: modificado Johnson e Raven, 2002. As bandas finas e claras, também chamadas por bandas I, são compostas de dois filamentos de actina torcidos em hélice. A actina é uma proteína globular com 375 aminoácidos. Figura 6-Filamento fino. Duas cadeias de actina torcidas juntas na forma de hélice. FONTE: Modificado Johnson e Raven, 2002. Através de ligações protéicas ocorre a conexão da actina com a membrana plasmática. Um modelo proposto descreve um importante papel da proteína distrofina nesta ligação. A distrofina estaria organizada em um dímero antiparalelo com o domínio N- terminal como ponto de ligação com os filamentos de actina, no interior da fibra muscular e o domínio C-terminal como sítio de ligação à membrana, através de um complexo de Região N-terminal denominada cabeça Filamento fino Moléculas de actina Molécula de miosina Feixe de miosina proteínas e glicoproteínas associadas integrais à membrana (Complexo Distrofina Glicoproteínas Associadas O DGC é um complexo oligomérico, formado pelos sub β-DG), sarcoglicano (α−, β−, γ− distrofina ao complexo DGC é feita através de sua ligação à DG está associada ao complexo transmembranoso sarcoglicano, periférica de membrana relacionados a este processo sugerem que este mecanismo teria importante função na ligação e interação da α- no bom funcionamento do músculo esquelético (Muntoni e Voit, 2004). Desta forma, o DGC promove a ligação entre as proteínas internas da fibra muscular distrofina), e a matriz extracelular (associação por três cadeias, sendo uma delas a cadeia 1995). Figura 7- Complexo Distrofina Glicoproteí da fibra muscular é feita ligada na sua porção N terminal à actina, e na sua porção C terminal à Be associando-se às demais FONTE: Modificado de As fibras musculares podem ser divididas com base na velocidade da contração exercida: lenta, tipo I , tem rico abastecim respiratórias aeróbicas, al fibras vermelhas; e rápida, tipo II, proteínas e glicoproteínas associadas integrais à membrana (Complexo Distrofina Glicoproteínas Associadas - DGC) (Ervasti e Campbell, 1993; Ozawa O DGC é um complexo oligomérico, formado pelos sub-complexo α−, β−, γ− e δ−SG), sintrofinas, e distrobrevinas. A associação da distrofina ao complexo DGC é feita através de sua ligação à proteína DG está associada ao complexo transmembranoso sarcoglicano, e também à proteína periférica de membranaα-DG. A proteína α-DG é altamente glicosilada e estudos relacionados a este processo sugerem que este mecanismo teria importante função na -DG com a laminina na matriz extracelular, e conseq no bom funcionamento do músculo esquelético (Muntoni e Voit, 2004). Desta forma, o DGC promove a ligação entre as proteínas internas da fibra muscular matriz extracelular (associação α-DG-laminina 2). A laminina por três cadeias, sendo uma delas a cadeia α2 (Ervasti e Campbell, 1993; Complexo Distrofina Glicoproteínas associadas. Ligação do citoesqueleto com a matriz extracelular da fibra muscular é feita por interações protéicas, em que a proteína distrofina tem um papel central, ligada na sua porção N terminal à actina, e na sua porção C terminal à Be s demais proteínas do complexo. FONTE: Modificado de Khurana e Davies (2003). fibras musculares podem ser divididas com base na velocidade da contração exercida: lenta, tipo I , tem rico abastecimento de capilares, muitas mitocô bicas, alta concentração de mioglobinas e por isso s e rápida, tipo II, com menor quantidade de capilares, mitocô 21 proteínas e glicoproteínas associadas integrais à membrana (Complexo Distrofina- Campbell, 1993; Ozawa et al., 1995). complexos distroglicano (α-, SG), sintrofinas, e distrobrevinas. A associação da proteínaβ-DG. A proteína β- e também à proteína DG é altamente glicosilada e estudos relacionados a este processo sugerem que este mecanismo teria importante função na na matriz extracelular, e conseqüentemente, no bom funcionamento do músculo esquelético (Muntoni e Voit, 2004). Desta forma, o DGC promove a ligação entre as proteínas internas da fibra muscular (ligação actina- laminina 2). A laminina 2 é composta 2(Ervasti e Campbell, 1993; Ozawa et al., nas associadas. Ligação do citoesqueleto com a matriz extracelular distrofina tem um papel central, ligada na sua porção N terminal à actina, e na sua porção C terminal à Beta Distroglicana fibras musculares podem ser divididas com base na velocidade da contração ento de capilares, muitas mitocôndrias e enzimas por isso são chamadas de quantidade de capilares, mitocôndrias e mioglobinas, são chamadas de fibras brancas anaeróbica, pois usam glicogê O músculo humano també rápidas mas também tem uma alta capacidade oxidativa, portanto mais resistentes a fadiga. 1.1. 1.1.1.1. 1.1.4 44 4Regeneração muscular Regeneração muscularRegeneração muscular Regeneração muscular A regeneração é comandada pelas células satélite têm forma alongada e são uninucleadas, e tem papel importante na hipertrofia e no reparo de lesões sofridas pela fibra muscular. As CS se localizam na periferia dos miotubos e representam cerca de 30% dos núcleos sublaminares dos músc e Garry, 2001). Figura 8- Ativação, diferenciação e proliferação de células satélites na resposta a fatores liberados pelo exercício ou lesão ativam as células satélites fazendo com que estas deixem o estado quiescente. N aos miócitos “danificados”, contribuem para a regeneração da célula FONTE: modificado A quantidade de CS depende da idade, espécie e tipo de fib glicolítico (rápidas) apresentam quantidade menor de CS, já que estas aparecem em maior número quando próximas a capilares, mionúcleos e junções neuromusculares (JNM). Isto significa que as fibras oxidativas possuem aproximadamente 5 glicolíticas. Geralmente, as CS se encontram quiescentes no músculo adulto, porém explosões de atividade muscular após treinamento de resistência ocasionam hipertrofia em mioglobinas, são chamadas de fibras brancas e são adaptadas para respiração pois usam glicogênio e possuem altas concentrações de enzimas glicol humano também possui uma forma intermediári m tem uma alta capacidade oxidativa, portanto mais resistentes a Regeneração muscular Regeneração muscularRegeneração muscular Regeneração muscular A regeneração é comandada pelas células satélites (CS) do músculo. Estas c têm forma alongada e são uninucleadas, e tem papel importante na hipertrofia e no reparo de lesões sofridas pela fibra muscular. As CS se localizam na periferia dos miotubos e representam cerca de 30% dos núcleos sublaminares dos músculos dos membro Ativação, diferenciação e proliferação de células satélites na resposta a fatores liberados pelo exercício ou lesão ativam as células satélites fazendo com que estas deixem o estado quiescente. Neste estado as células podem proliferar e/ou migrar, nesse caso ao fundir aos miócitos “danificados”, contribuem para a regeneração da célula. FONTE: modificado adaptado de Hawke e Garry(2001). A quantidade de CS depende da idade, espécie e tipo de fib glicolítico (rápidas) apresentam quantidade menor de CS, já que estas aparecem em maior número quando próximas a capilares, mionúcleos e junções neuromusculares (JNM). Isto significa que as fibras oxidativas possuem aproximadamente 5 vezes mais CS que as Geralmente, as CS se encontram quiescentes no músculo adulto, porém explosões de atividade muscular após treinamento de resistência ocasionam hipertrofia em 22 daptadas para respiração altas concentrações de enzimas glicolíticas. ria de fibras que são m tem uma alta capacidade oxidativa, portanto mais resistentes a (CS) do músculo. Estas células têm forma alongada e são uninucleadas, e tem papel importante na hipertrofia e no reparo de lesões sofridas pela fibra muscular. As CS se localizam na periferia dos miotubos e ulos dos membros ( Hawke Ativação, diferenciação e proliferação de células satélites na resposta ao dano muscular. Vários fatores liberados pelo exercício ou lesão ativam as células satélites fazendo com que estas deixem o este estado as células podem proliferar e/ou migrar, nesse caso ao fundir-se A quantidade de CS depende da idade, espécie e tipo de fibras. As fibras do tipo glicolítico (rápidas) apresentam quantidade menor de CS, já que estas aparecem em maior número quando próximas a capilares, mionúcleos e junções neuromusculares (JNM). Isto vezes mais CS que as Geralmente, as CS se encontram quiescentes no músculo adulto, porém explosões de atividade muscular após treinamento de resistência ocasionam hipertrofia em 23 decorrência da ativação das CS. A lesão muscular causada pelo exercício intenso provoca a migração de macrófagos para a região lesada, com conseqüente liberação de citocinas. As CS são atraídas por quimiotaxia e se fundem a miofibras já existentes, causando aumento da massa muscular (Hawke e Garry, 2001). Sugere-se que miostatina no músculo danificado deve agir como um chamariz químico de fagócitos e células inflamatórias e deve modular o processo de regeneração através de seu efeito nessas células (Kirk et al., 2000; Sharma et al., 2001). 1.2 1.2 1.2 1.2 O MÚSCULO DISTRÓFICOO MÚSCULO DISTRÓFICOO MÚSCULO DISTRÓFICOO MÚSCULO DISTRÓFICO 1 11 1. .. .2.1 Distrofias musculares progressiva 2.1 Distrofias musculares progressiva2.1 Distrofias musculares progressiva 2.1 Distrofias musculares progressiva As afecções neuromusculares humanas constituem um grupo heterogêneo de doenças genéticas caracterizadas por degeneração muscular progressiva, levando ao desenvolvimento de fraqueza muscular e perda de capacidade motora (Vainzof e Zatz, 2003). Na última década, foram identificadas mutações em vários genes, resultando na deficiência ou perda de função de diversas proteínas musculares de importância significativa para o bom funcionamento do músculo. Estudos bioquímicos e imunohistológicos têm localizado estas proteínas nos diversos compartimentos da fibra muscular. Associadas à membrana sarcolemal, encontra-se a distrofina, as 4 sarcoglicanas (α−, β−, γ− e δ-SG), disferlina e caveolina 3; na matriz extracelular, a α2-laminina e colágeno VI; nos sarcômeros, a teletonina, miotilina, titina, actina e tropomiosina; no citosol muscular, a calpaína 3, FKRP, TRIM32, miotubularina; e nos núcleos, a emerina, lamina A/C, proteína SMN. Algumas das doenças associadas a alterações nestas proteínas são as distrofias musculares progressivas e as miopatias congênitas. Dentre as diferentes miopatias, a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é a mais comum, com uma incidência de 1 em cada 3000 nascimentos do sexo masculino. Os sinais clínicos iniciam-se entre 3 e 5 anos de idade (com quedas freqüentes, dificuldades para subir escadas, correr e levantar do chão), o confinamento em cadeira de rodas se dá até os 12 anos de idade e os afetados raramente sobrevivem após a terceira década (Zatz, 2001). O gene responsável pela DMD localiza-se no braço curto do cromossomo X (Xp21). 24 O produto do gene é uma proteína de 427-kDa, denominada distrofina, que se localiza na face interna da membrana das fibras musculares esqueléticas e cardíacas, como visto anteriormente. Recentemente foram identificadas mutações em diversos genes que atuam na cascata de glicosilação da α-DG resultando em doenças neuromusculares (Martin, 2003). A ausência de distrofina no músculo distrófico resulta na deficiência secundária dos componentes do DGC (Ohlendieck et al., 1991; Ervasti e Campbell, 1993). Como conseqüência, ocorre a instabilidade desse complexo, e as fibras musculares ficam mais suscetíveis ao estresse mecânico causado pela contração muscular, levando ao processo de degeneração em pacientescom DMD. Portanto, as proteínas do complexo DGC também são de extrema importância para o bom funcionamento do músculo, e assim como a deficiência de distrofina leva às distrofias de Duchenne, alterações nas proteínas do complexo DGC causam as distrofias musculares tipo Cinturas (DMC). As formas autossômicas recessivas mais graves e de início mais precoce são as sarcoglicanopatias, causadas por mutações nos genes que codificam as 4 proteínas sarcoglicanas (α−, β−, γ− e δ-SG). Dentre as formas de distrofias das Cinturas mais benignas, a deficiência da enzima calpaína 3 causa DMC2A, a deficiência da proteína sarcolemal disferlina causa a forma DMC2B e a deficiência da proteína sarcomérica teletonina causa DMC2G. Além disso, mutações no gene LAMA2 que codifica a cadeia α2 da laminina muscular (laminina2) causam uma forma de distrofia muscular congênita muito grave, a CMD1A. A α2-laminina é expressa em vários tipos celulares, entre eles células musculares esqueléticas e cardíacas, células de Schwann, trofoblastos e células de origem mesenquimal (Vilquin et al., 1999). Em 1994, Tomé et al. identificaram a proteína merosina ou α2-laminina como a responsável pela patogênese da doença. Por outro lado, novas formas de distrofias musculares foram recentemente associadas a mutações em genes que codificam enzimas glicosiltransferases, que contribuem para a glicosilação da proteína α-DG. Curiosamente, a análise de proteínas em biópsias musculares destes pacientes mostra uma hipo-glicosilação da α-DG e redução significativa de numerosos ligantes da matriz extracelular (Muntoni et al., 2004). Dentro deste grupo de doenças, nota-se a distrofia das cinturas tipo 2I e forma congênita 1C, ambas causadas por mutações no gene FKRP que codifica uma possível glicosiltransferase. Além disso, uma nova forma de distrofia muscular congênita, a forma DMC1D, também foi assoc glicosilação da proteína complexo DGC muscular. Portanto, o estudo da via de glicosilação de proteínas musculares se tornou muito importante na compreensão de novos mecanismos causadores de doenças neuromusculares humanas. Figura 9- Complexo distrofina glicoproteínas associadas FONTE: Byrne et al.(2003 1. 1.1. 1.2.2Modelos animais para distrofias musculares 2.2Modelos animais para distrofias musculares2.2Modelos animais para distrofias musculares 2.2Modelos animais para distrofias musculares Muitos animais apresentam naturalmente fenótipos relacionados com características já observadas em doenças hereditári geneticamente. Estes animais geralmente apresentam alterações fisiológicas que aparecem em pacientes humanos. Eles podem servir como ferramentas de estudos genéticos, clínicos, histopatológicos e terapêuticos ajudando na das doenças e suas manifestações nos indivíduos afetados (Vainzof Os modelos murinos são os mais estudados e utilizados para as distrofias musculares. Porém, outros animais com diferentes miopatias já foram identificad como os cães Golden Retriever, Beagle, Rottweiler, modelos para DMD e Cocker Spaniel e Chihuahua, modelos para deficiência das proteínas sarcoglicanas (Shelton e Engvall, 2005). glicosiltransferase. Além disso, uma nova forma de distrofia muscular congênita, a forma DMC1D, também foi associada a mutações no gene LARGE. Este gene está envolvido na glicosilação da proteína α-DG, membro essencial na formação e funcionamento do complexo DGC muscular. Portanto, o estudo da via de glicosilação de proteínas musculares se tornou muito importante na compreensão de novos mecanismos causadores de doenças neuromusculares humanas. Complexo distrofina glicoproteínas associadas 2003). 2.2Modelos animais para distrofias musculares 2.2Modelos animais para distrofias musculares2.2Modelos animais para distrofias musculares 2.2Modelos animais para distrofias musculares Muitos animais apresentam naturalmente fenótipos relacionados com características já observadas em doenças hereditárias enquanto outros são modificados geneticamente. Estes animais geralmente apresentam alterações fisiológicas que aparecem em pacientes humanos. Eles podem servir como ferramentas de estudos genéticos, clínicos, histopatológicos e terapêuticos ajudando na compreensão da origem das doenças e suas manifestações nos indivíduos afetados (Vainzof et al Os modelos murinos são os mais estudados e utilizados para as distrofias outros animais com diferentes miopatias já foram identificad como os cães Golden Retriever, Beagle, Rottweiler, modelos para DMD e Cocker Spaniel e Chihuahua, modelos para deficiência das proteínas sarcoglicanas Shelton e Engvall, 2005). 25 glicosiltransferase. Além disso, uma nova forma de distrofia muscular congênita, a forma . Este gene está envolvido na DG, membro essencial na formação e funcionamento do complexo DGC muscular. Portanto, o estudo da via de glicosilação de proteínas musculares se tornou muito importante na compreensão de novos mecanismos Muitos animais apresentam naturalmente fenótipos relacionados com as enquanto outros são modificados geneticamente. Estes animais geralmente apresentam alterações fisiológicas que aparecem em pacientes humanos. Eles podem servir como ferramentas de estudos compreensão da origem et al., 2007). Os modelos murinos são os mais estudados e utilizados para as distrofias outros animais com diferentes miopatias já foram identificados tais como os cães Golden Retriever, Beagle, Rottweiler, modelos para DMD e Boston Terrier, Cocker Spaniel e Chihuahua, modelos para deficiência das proteínas sarcoglicanas 26 1.2.2.1 1.2.2.1 1.2.2.1 1.2.2.1 Distrofinopatias DistrofinopatiasDistrofinopatias Distrofinopatias O camundongo Dmd mdx é modelo mais usado para DMD (Bulfield et al.,1984). O Dmd mdx tem uma mutação de ponto no gene da distrofina no cromossomo X que causa uma terminação prematura do polipeptídio (Sicinski et al., 1989), e conseqüentemente ausência total da proteína no músculo. Esse fato o torna um bom modelo molecular. No entanto, além de apresentar menor degeneração e maior regeneração muscular, o Dmd mdx não tem fraqueza muscular significativa e por isso não é usado como modelo clínico de DMD. O músculo mais afetado, que melhor representa a progressão de fraqueza e reproduz as transformações de distrofia muscular humana no Dmd mdx é o diafragma, (Stedman et al., 1991) por esta razão ele é amplamente usado em análises histológicas. 1.2.2.2 1.2.2.2 1.2.2.2 1.2.2.2 Deficiência de alfa 2 laminina Deficiência de alfa 2 lamininaDeficiência de alfa 2 laminina Deficiência de alfa 2 laminina Diversos camundongos modelos com deficiência de alfa 2 lamina foram produzidos. Dentre eles, dois modelos, com mutações espontâneas no gene LAMA2 foram identificados no Laboratório Jackson: o camundongo dy/dy (dystrophia-muscularis) e seu mutante alélico dy 2J /dy 2J .No modelo dy 2J /dy 2J a distrofia é mais branda que no modelo dy/dy. Ambos exibem deficiência parcial de alfa 2 lamina e são modelos para distrofia muscular congênita com deficiência de merosina (CMD1A) (Jackson Laboratories). Estudos moleculares da expressão do gene Lama2 nos camundongos dy/dy revelaram deficiência de seu mRNA nos músculos esquelético e cardíaco e no nervo periférico, porem não se sabe ainda qual é a mutação para esse fenótipo (Jackson Laboratories). Clinicamente esses camundongos são considerados menores e mais fracos. Geralmente são estéreis. Oacometimento muscular começa aproximadamente em 3 ½ semanas de vida, em que ocorre paralisia primeiramente nos músculos posteriores, depois nos axiais e por último nos anteriores. Eles apresentam defeitos na mielinação de nervos periféricos e morte prematura, antes dos 6 meses de idade (Vainzof et al., 2007). A mutação que ocorre nos modelos Lama2 dyJ /J é uma substituição de um G por A, o que causa splicing anormal e conseqüentemente expressão de múltiplos mRNA. Um mRNA é traduzido num polipeptídio alfa2 com uma deleção no domínio IV (Sumada et al., 27 1995). Os efeitos desta mutação são mais brandos que no camundongo dy/dy, porem nos dois casos as alterações clínicas e histológicas são similares. Os camundongos Lama2 dyJ /J são maiores e mais ativos que os camundongos dy/dy, têm expectativa de vida normal e são férteis. Foi observado que ao levantar o animal pela cauda ele recolhe os membros em direção ao tronco (Allamand e Campbell, 2000). 1.2.2.3 1.2.2.31.2.2.3 1.2.2.3 Disfer DisferDisfer Disferlinopatias linopatiaslinopatias linopatias O camundongo SJL/J é um modelo natural para diferentes doenças humanas. Recentemente identificou-se nele uma deleção de 171pb no gene da disferlina, na região que codifica a maioria dos domínios C2. Essa mutação causa a deleção de 57 aminoácidos, resultando numa molécula 6.5 kD menor que a proteína normal de aproximadamente 230 kD (Bittner et al., 1999) e provocando sua instabilidade. O SJL/J apresenta uma redução média de 85% nos níveis de disferlina, tornando-o um bom modelo para LGMD2B (Vainzof et al.,2003). Ele desenvolve uma miopatia espontânea caracterizada por progressão lenta de perda muscular (Bittner et al., 1999) e força correspondente a um aumento da patologia do músculo incluindo fibras musculares com núcleos centrais, variação de calibre, splitting, infiltração inflamatória, necrose e eventual substituição de músculo por tecido gorduroso (Vainzof et al.,2003). Este quadro afeta primeiramente os músculos proximais enquanto os músculos distais permanecem menos afetados. Cruzamentos subseqüentes de SJLxC57BL/10 revelaram que o fenótipo muscular apresentado é herdado como caráter autossômico recessivo(Bittner et al., 1999). Este camundongo é extremamente suscetível a doenças autoimune, linfoma e infecções virais. Geralmente os machos (Jackson Laboratories) têm um comportamento agressivo (Hoet al., 2004). 1.2.2.4 1.2.2.4 1.2.2.4 1.2.2.4 Defeitos de glicosilação Defeitos de glicosilaçãoDefeitos de glicosilação Defeitos de glicosilação No camundongo, o gene que codifica uma possível glicosiltransferase é o Large. Deleções que retiram os exons 4-6 resultam na alteração da glicosilação da alfa 28 distroglicana e são responsáveis pelo fenótipo miodistrófico (Large myd ), destacando comprometimento do músculo esquelético, coração, retina, sistema nervoso periférico e sistema nervoso central (Vainzof et al., 2007). Os camundongos homozigotos Large myd apresentam distrofia muscular progressiva grave e cardiomiopatia branda. Podem ser reconhecidos com 12-15 dias pelo seu tamanho reduzido e postura anormal (Browning et al., 2005). Defeitos neuronais aparecem no cérebro principalmente no córtex e cerebelo, também presentes no camundongo deficiente de fukutina. 1.1.1.1.3 3 3 3 MIOSTATINAMIOSTATINAMIOSTATINAMIOSTATINA A miostatina, também conhecida como GDF-8, é um membro da superfamília de fatores de crescimento TGF-β, que é composta por fatores de crescimento e diferenciação do desenvolvimento embrionário e manutenção da homeostase tecidual (McPherron e Lee, 1997). A miostatina é codificada pelo gene MSTN, localizado em 2q32.2 em humanos e em camundongo esta em 1 27.8 cM (Szabo et al.,1998). O gene MSTN foi seqüenciado por Ferrel et al.(1999), e é constituído por três exons intercalados por dois introns, contendo 7,7 kb e um mRNA de 3,1 kb. Vários polimorfismos foram identificados em humanos. A miostatina é uma proteína com 375 aminoácidos, contendo uma seqüência sinalizadora de secreção, um sítio de processamento proteolítico e nove resíduos de cisteínas na sua porção C-terminal. Em eletroforese realizada em condições não redutoras, pode-se observar duas bandas de massas de 101 kDa e 25 kDa, consistentes com o tamanho esperado para as formas diméricas não-processadas e processadas, respectivamente (McPherron e Lee, 1997). Normalmente a miostatina está em estado inativo, no qual a região madura C- terminal da molécula fica ligada não covalentemente ao seu pró-peptideo na região N- terminal. O pró-peptideo tem função inibitória sobre a proteína, pois inibe a sua ligação ao receptor (Lee e McPherron, 2001). Esse complexo latente pode ser ativado in vitro pela 29 clivagem do pró-peptideo com membros da família das metaloproteinases BMP-1/TLD (bone morphogeneticprotein-1/tolloid)(Wolfman et al., 2003). Após a ativação de seu estado latente, o dímero C-terminal da miostatina é capaz de ligar aos receptores e ativar uma cascata de transdução de sinal na célula-alvo. Estudos com miostatina recombinante purificada demonstraram que ela é capaz de se ligar aos receptores activina tipo II(receptores transmembrana serina/treonina quinase): ActRIIA e ActRIIB in vitro (Lee e McPherron 2001; Rebbapragada et al., 2003). A ligação ao ActRII leva a fosforilação e ativação do receptor Activina tipo I, que por sua vez inicia uma cascata de sinalização pela fosforilação das proteínas Smad2 e Smad3. Após a fosforilação as Smads formam heterodimeros com a CoSmad4. Esses complexos de Smads ativados são translocados do citoplasma para o núcleo onde eles regulam a transcrição de genes alvos(Langley et al., 2002) (Shi e Massague, 2003). A localização celular da miostatina parece depender do estado anatomo-patológico do músculo e do estágio de diferenciação muscular. Acredita-se também que a miostatina deve desempenhar diferentes papéis na dinâmica de desenvolvimento e do processo de degeneração/regeneração musculares (Sharma et al., 2001). Wehling et al. (2000) encontraram a proteína nas junções miotendinosas em músculo normal e em processo de reposição de massa muscular perdida por falta de uso. A miostatina foi encontrada também no citoplasma de fibras musculares e nos mionúcleos de músculo denervado, em processo de degeneração/regeneração e de ganho de massa muscular (Sakuma e cols., 2000). Por outro lado, marcação positiva para miostatina foi também encontrada em células não musculares, como os macrófagos e fibroblastos no tecido muscular em processo de regeneração (Yamanouchi et al., 2000). 1. 1.1. 1.3.2 3.2 3.2 3.2 Expressão da Miostat Expressão da MiostatExpressão da Miostat Expressão da Miostatina durante o desenvolvimento ina durante o desenvolvimentoina durante o desenvolvimento ina durante o desenvolvimento A análise da expressão de miostatina nos diferentes estágios de desenvolvimento embrionário mostrou que nos estágios mais incipientes, sua expressão é restrita aos somitos em desenvolvimento. O mRNA da miostatina pode ser detectado desde 9,5 dias post-coitum (p.c.), em cerca de um terço dos somitos. Por volta do dia 10,5 p.c. a expressão parece estar localizada no miótomo. Em estágios mais avançados de 30 desenvolvimento a miostatina é encontrada em uma ampla gama de músculos em desenvolvimento (McPherron et al., 1997). Em animais adultos, a miostatina continua a ser expressa quase que exclusivamente na musculatura esquelética.Entretanto, quantidades residuais de miostatina foram detectadas também em tecido adiposo. A expressão no músculo esquelético é disseminada, embora, exista variação de expressão em músculos diferentes (McPherron et al., 1997). A miostatina é expressa também na musculatura cardíaca (Sharma et al., 1999). 1. 1.1. 1.3.3 Função da miostatina e associação com doenças 3.3 Função da miostatina e associação com doenças3.3 Função da miostatina e associação com doenças 3.3 Função da miostatina e associação com doenças Diversos estudos tentam explicar a interação da miostatina com os tecidos do corpo, e sua relação com doenças humanas. Recentemente a miostatina foi relacionada com doenças como obesidade e diabetes. Administrando uma dieta rica em gordura para camundongos selvagens e transgênicos para a miostatina, et al.(2005) constataram que nesta dieta o camundongo selvagem apresentou resistência a insulina. Em seu sangue havia maior concentração de glicose, enquanto o animal transgênico, com inibição da miostatina, conseguiu manter os mesmos níveis de glicose que os camundongos transgênicos e selvagens alimentados com uma dieta balanceada de nutrientes. Em outro estudo Hitell et al.(2009) observaram um aumento da secreção de miostatina em miotubos em cultura de mulheres obesas. Resultados encontrados por Feldman et al.(2006) revelaram que a miostatina, a semelhança com a dexametasona, também tem a capacidade de induzir a adipogenese de uma linhagem de células pluripotentes. Entretanto, os adipócitos formados são menores, expressam marcadores de adipócitos imaturos e teriam a sensibilidade a insulina aumentada. Um estudo realizado por Roth et al.(2003) verificou que a expressão da miostatina estava reduzida em 37% em indivíduos sedentários que participaram de um programa de treinamento físico intenso, concluindo que a miostatina responde à carga muscular em alguns casos, e, portanto é um regulador do tamanho celular. A expressão da miostatina 31 parece, portanto, depender do tipo de contração muscular realizada, bem como a freqüência, intensidade e duração dos estímulos (Sakuma et al., 2000). Aumento da quantidade de miostatina foi observado em humanos em conseqüência da inatividade (Zimmers et al., 2002) e em casos de perda de massa muscular, como verificado em homens portadores de HIV (Gonzales-Cadavid et al., 1998). Durante o processo de regeneração muscular é observado uma elevação na replicação de células satélites. A expressão de miostatina em fibras em processo de regeneração é diferente entre fibras que sobreviveram ao processo de degeneração e fibras danificadas em regeneração. Nas primeiras a expressão é alta o que deve inibir a multiplicação de mioblastos, nas outras a expressão é baixa, ou seja, a multiplicação de mioblastos não é inibida (Kirk et al., 2000; Sharma et al., 2001). Estudos em cultura de mioblastos demonstraram que a miostatina atua bloqueando as fases G1 e G2 do ciclo celular, regulando proteínas importantes ao ciclo como Cdk2, p21 e Rb sem afetar o mecanismo de apoptose dos mioblastos. Em resposta à sinalização da miostatina, a proteína p21 é hiper-regulada inibindo a atividade ciclina E/Cdk2 causando a hipofosforilação da proteína Rb e parando o ciclo celular na fase G1 (Thomas et al., 2000). 1. 1.1. 1.3.4 3.43.4 3.4 Inibição da Miostatina como abordagem terapêu Inibição da Miostatina como abordagem terapêuInibição da Miostatina como abordagem terapêu Inibição da Miostatina como abordagem terapêutica ticatica tica Muitos estudos enfatizam a inibição da miostatina porque o tratamento de doenças musculares pela maioria das abordagens farmacológicas tem sido decepcionante (Rodino- Klapac, 2009). Por causa do importante papel da miostatina no desenvolvimento e regeneração do músculo, terapias com bloqueio de miostatina estão sendo testadas em modelos animais de distrofias musculares (Bogdanovich et al., 2002). Outros ainda focam no objetivo de produzir animais com maior massa muscular, o que seria vantajoso para a pecuária. Lee et al.(2005) descreveram um potente inibidor da miostatina (ACVR2B) que quando injetado em camundongos selvagens resulta em aumento de massa muscular. Em seu estudo demonstraram que o efeito do ACVR2B é atenuado em indivíduos nulos para a 32 miostatina, sugerindo que existe pelos menos uma outra substância que normalmente funciona limitando o crescimento da musculatura. Em pesquisa realizada por Parsons et al.(2006), comparou-se a inibição da miostatina com anticorpos monoclonais em estágios iniciais de desenvolvimento com estágios tardios em animais nulos para delta sarcoglicana. Eles observaram aumento de massa muscular, regeneração e redução de fibrose em estágios iniciais e sugeriram que a inibição pode ser benéfica em período inicial de vida ou quando a doença é branda. Heineke et al.(2010) após induzirem danos cardíacos em camundongos, detectaram aumento das concentrações plasmáticas de miostatina e conseqüente diminuição da massa muscular esquelética. Com estes dados os autores apontam a miostatina liberada na circulação sistêmica por cardiomiócitos como causadora da caquexia que ocorre em pacientes que sofrem de falhas cardíacas. Em experimentos realizados com camundongos deficientes para alfa-laminina2 e nulos para a miostatina, Li et al.(2005) observaram maiores taxas de morte pós-natal, o aumento de musculatura e regeneração muscular concomitantemente ao aumento da formação de gordura, demonstrando que a ausência desta proteína não reduziu a patologia muscular dos indivíduos afetados. Haidet et al.(2008) testaram a injeção intramuscular pós-natal de vírus adeno- associado (AAV) codificando proteínas que inibem a miostatina. Em camundongos selvagens ocorreu o aumento da musculatura e da força. Interessante que em Dmd mdx o tratamento reverteu a patologia muscular e melhorou a força, mesmo quando administrada para animais de 6 meses. Ainda que ocorra o aumento da musculatura na ausência de miostatina, a força muscular é menor em camundongos deficientes de miostatina que em camundongos selvagens (Amthor et al., 2007). Visto que o papel da miostatina no processo distrófico não está bem estabelecido, este trabalho se faz de extrema importância na tentativa de explicar uma possível relação desta proteína com o processo distrófico. 33 2 2 2 2 OBJETIVOBJETIVOBJETIVOBJETIVOS OS OS OS Avaliar e comparar a expressão da miostatina em quatro modelos murinos para distrofias musculares com diversos padrões de fraqueza muscular: Dmd mdx , SJL, Large myd , Lama2 dyJ /J. Objetivos Específicos: • Avaliar e comparar a expressão do mRNA da miostatina, por PCR em tempo real no músculo gastrocnêmio e diafragma dos animais das diferentes linhagens. • Comparar a expressão da miostatina com as alterações histopatológicas dos músculos estudados e correlacionar com o grau de fraqueza muscular característico de cada linhagem. 34 3 3 3 3 MATERIAL E METODOLOGIAMATERIAL E METODOLOGIAMATERIAL E METODOLOGIAMATERIAL E METODOLOGIA 3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA. 3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA.3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA. 3.1 OBTENÇÃO DOS ANIMAIS E MANUTENÇÃO DA COLÔNIA. Os animais deste projeto são mantidos no biotério do Centro de Estudos do Genoma Humano, o qual está devidamente equipado para abrigar estes animais, em temperaturaconstante e boas condições de higiene e saúde. Os animais recebem alimentação e água ad libidum . Foram utilizadas as linhagens de camundongos Dmd mdx (Bulfieldet al., 1984), B6.WK-Lama2 dyJ /J (Meier e Southard, 1970), SJL/J (Welleret al., 1997), Large myd (Grewal e Hewitt, 2002), e C57Black6 (camundongo normal). Os camundongos Lama2 dyJ /J (000524), SJL/J (000686) e Large myd /J (000226) foram importados do laboratório Jackson (www.jaxmice.org). 3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPA 3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPA3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPA 3.2 EXTRAÇÃO DE DNA E GENOTIPAGEM GEMGEM GEM Duas linhagens são genotipadas em nosso laboratório: modelo Large myd e o modelo Lama2 dyJ /J. Para estas genotipagens os animais foram identificados previamente com furos na orelha, fragmentos de cauda foram colocados em tubos identificados com solução de extração e Proteinase K e incubados a 55ºC over night. Após incubação o DNA foi precipitado com isopropanol e ressuspendido com TE. Para o modelo Large myd , utilizou-se uma reação de PCR multiplex que amplifica o alelo mutado e o alelo normal simultaneamente. Se o indivíduo for homozigoto para a mutação, a reação amplifica apenas o alelo mutado (421 pb). Se ele for normal, apenas o alelo normal (162 pb). Se for heterozigoto, os dois alelos são amplificados. Os oligonucleotideos usados (Browning, 2005) nesta etapa estão no quadro 1. O resultado desta reação pode ser observado na eletroforese das amostras em gel de agarose 2%. Quadro 1-Oligonucleotídeos utilizados pra genotipagem do modelo Mouse wild type forward (MWTF) Mouse wild type reverse (MWTR) Mutation forward (MUTF) Mutation reverse (MUTR) Figura 10- Genotipagem dos camundongos agarose 2% corado com brometo de etideo. Para o modelo Lama2 fragmento de 170pb contendo a mutação. Após o PCR é feito uma reação de digestão com a enzima NDE1, pois esta mutação cria um sítio de restrição que é poss esta enzima. Após a elet banda referente ao alelo normal. Se o indiví duas bandas referentes a digestão do alelo mutado. Se for heterozigoto,os dois alelos são amplificados e o mutado é digerido, portanto aparecem reação pode ser observado na eletroforese das amostras em gel de acrilamida. Figura11- Genotipagem de Lama2 camundongo normal; 2 421pb 162pb ligonucleotídeos utilizados pra genotipagem do modelo Large Mouse wild type forward (MWTF) GGC CGT GTT CCA TAA GTT CAA Mouse wild type reverse (MWTR) GGC ATA CGC CTC TGT GAA AAC Mutation forward (MUTF) ATC TCA GTC CCA AAG GGT GAAG Mutation reverse (MUTR) GCC AAT GTA AAA TGA GGG GAA A Genotipagem dos camundongos Largemyd. Eletroforese dos produtos do PCR multiplex em gel de agarose 2% corado com brometo de etideo. Lama2 dyJ /J, utilizou-se uma reação de PCR fragmento de 170pb contendo a mutação. Após o PCR é feito uma reação de digestão com esta mutação cria um sítio de restrição que é poss eletroforese dos produtos, se o indivíduo for normal aparece uma nte ao alelo normal. Se o indivíduo for homozigoto para a mutação, aparecem rentes a digestão do alelo mutado. Se for heterozigoto,os dois alelos são amplificados e o mutado é digerido, portanto aparecem três bandas. O resultado desta reação pode ser observado na eletroforese das amostras em gel de acrilamida. Lama2dy-2J/J, após digestão. Gel de acrilamida corado com brometo de etídio. 1 camundongo normal; 2- camundongo heterozigoto; 3- camundongo afetado. 377pb 213pb 164pb 35 Large myd . A GTT CAA GGC ATA CGC CTC TGT GAA AAC ATC TCA GTC CCA AAG GGT GAAG GCC AAT GTA AAA TGA GGG GAA A dutos do PCR multiplex em gel de se uma reação de PCR que amplifica um fragmento de 170pb contendo a mutação. Após o PCR é feito uma reação de digestão com esta mutação cria um sítio de restrição que é possível digerir com duo for normal aparece uma duo for homozigoto para a mutação, aparecem rentes a digestão do alelo mutado. Se for heterozigoto,os dois alelos são bandas. O resultado desta reação pode ser observado na eletroforese das amostras em gel de acrilamida. , após digestão. Gel de acrilamida corado com brometo de etídio. 1- camundongo afetado. 36 Após a genotipagem, os animais afetados foram separados em nova gaiola para envelhecerem até atingirem as idades requisitadas nos experimentos do laboratório. Quando necessário são formados novos casais de heterozigotos. Os normais podem ser destinados como indivíduo controle em alguns estudos. Foram utilizados: Seis camundongos SJL/J com 3 meses. Cinco camundongos Large myd com 3 meses. Seis camundongos Lama2 dy-2J /J com 3 meses. Seis camundongos Dmd mdx com 3 meses. Seis camundongos normais C57BL 3 meses. Os indivíduos selecionados foram eutanaziados em cubas de CO 2 . 3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DO 3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DO3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DO 3.3 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DOS MÚSCULOS S MÚSCULOSS MÚSCULOS S MÚSCULOS A partir de necropsia foram coletados diafragma e gastrocnêmio de cada animal. Os fragmentos musculares foram destinados à histologia e a estudos moleculares. 3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS 3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS 3.4 PREPARAÇÃO DE LÂMINAS HISTOLÓGICAS Os fragmentos destinados a histologia foram crioprotegidos com talco, subseqüentemente envoltos por resina Tissue-tec ® (Sakura, Japão) e montados em uma rolha de cortiça previamente identificada, mantendo as fibras musculares na orientação vertical em relação à superfície da rolha. O conjunto foi congelado e armazenado em nitrogênio líquido. As lâminas de vidro foram cobertas com polilisina para aumentar a aderência do corte histológico à lâmina. Os fragmentos musculares foram seccionados transversalmente com espessura de 6μm num micrótomo criostato à temperatura de –25 o C. Em seguida as lâminas foram armazenadas em freezer –70 o C. 37 3.5 HISTOLOGIA 3.5 HISTOLOGIA3.5 HISTOLOGIA 3.5 HISTOLOGIA 3.5.1 3.5.1 3.5.1 3.5.1 Coloração de Hematoxilina Coloração de HematoxilinaColoração de Hematoxilina Coloração de Hematoxilina- -- -Eosina (HE) Eosina (HE)Eosina (HE) Eosina (HE) A coloração de HE permite analisar a morfologia das fibras musculares e dos tecidos adjacentes, podendo-se observar se existe ou não hiperplasia, hipertrofia, presença de regeneração/degeneração, estruturas anormais, entre outros. Esta reação foi realizada de acordo com a descrita em Dubowitz, 1985. 3.5.2 3.5.2 3.5.2 3.5.2 Coloração com Picro Sirius Coloração com Picro SiriusColoração com Picro Sirius Coloração com Picro Sirius ® ®® ® A coloração com Picro Sirius ® ®® ® permite a visualização dos tecidos conjuntivos perimisial e endomisial de tecidos musculares. Através de um microscópio óptico com câmera fotográfica acoplada e conectada a um computador é possível fazer a quantificação proporcional entre a área de tecido conjuntivo e a área total de um campo selecionado. Esta reação foi realizada de acordo com as seguintes etapas: Primeiramente as lâminas com os cortes histológicos ficam submersas por 20 minutos em Bouim para a fixação do tecido. Depois elas passam por um banho de água corrente para retirar o excesso de Bouim. Em seguida são submersas em solução de Sirius Red ® com ácido pícrico. Apósaproximadamente 30 minutos é feita a desidratação em série de 2 minutos em cada desidratante seguinte: em álcool 90%, álcool 100%, solução de álcool mais xilol e por ultimo xilol. As lâminas são retiradas uma por vez para serem montadas com resina para montagem histológica e lamínula. Para a quantificação utiliza-se o software KS 300 (2002) da Carl Zeiss, o qual calcula a área relativa ao tecido conjuntivo (corado em vermelho) em relação à área total do corte. 38 3.6 ESTUDOS MOLECULARES 3.6 ESTUDOS MOLECULARES3.6 ESTUDOS MOLECULARES 3.6 ESTUDOS MOLECULARES Cada fragmento destinado a estudos moleculares foi congelado em nitrogênio líquido, macerado com pistola em banho de nitrogênio líquido e dividido em duas partes, uma para extração de proteínas e outra para extração de DNA e RNA. 3.6.1 3.6.13.6.1 3.6.1Extração de RNA total Extração de RNA totalExtração de RNA total Extração de RNA total O RNA total foi extraído dos músculos coletados, a partir de material macerado com pistola em banho de nitrogênio líquido e estocado também em nitrogênio líquido. A extração de RNA do material pulverizado foi realizada com o reagente Trizol ® (Invitrogen Inc Brasil), conforme as especificações do fabricante. O RNA foi diluído em água tratada com dietilpirocarbonato 0,01% (DEPC) (livre de ribonucleases) e guardado em freezer – 70 o C. 3.6.2 3.6.2 3.6.2 3.6.2 Síntese de cDNA total Síntese de cDNA totalSíntese de cDNA total Síntese de cDNA total O RNA foi quantificado em espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nm, 1 µg de RNA total foi utilizado para a síntese de cDNA, a qual foi realizada conforme protocolo da enzima MMLV (Invitrogen). 3.6.3 3.6.33.6.3 3.6.3Análise de Expressão da miostatina Análise de Expressão da miostatinaAnálise de Expressão da miostatina Análise de Expressão da miostatina Em um primeiro momento os cDNAs foram testados através da reação em cadeia da polimerase convencional (PCR), com um par de “oligonucleotideos” que amplificam o gene endógeno GAPDH. De cada amostra 2µl. do produto de PCR foi misturado com o mesmo volume de tampão de corrida e aplicado em gel de poliacrilamida. Como todos amplificaram, foi feito o PCR Real Time para os pares de oligonucleotideos dos genes da miostatina e do endógeno GAPDH. 39 3.6.4 3.6.4 3.6.4 3.6.4 PCR PCR PCR PCR em Tempo Real (Q em Tempo Real (Qem Tempo Real (Q em Tempo Real (Q- -- -PCR) PCR)PCR) PCR)- -- - quantificação relativa da expressão da miostatina quantificação relativa da expressão da miostatinaquantificação relativa da expressão da miostatina quantificação relativa da expressão da miostatina As amostras de cDNA foram aplicadas em triplicatas em placa ótica de 96 poços. A cada amostra foi adicionado o par de primers do gene de interesse e o MasterMix contendo Sybr Green (Applied Biosystems), num volume total de 25μL. A corrida das placas foi feita no termociclador para Real-Time 7500 da Applied Biosystems. Quadro2- Pares dos oligonucleotideos para amplificação do gene alvo da miostatina e o gene endógeno GAPDH. MIOSTATINA forward (MSTN F) AACCTTCCCAGGACCAGGAG MIOSTATINA reverse (MSTN R) CATCGCAGTCAAGCCCAAAG GAPDH forward AGGTCGGTGTGAACGGATTTG GAPDH reverse TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA Para quantificação relativa da expressão da miostatina, foi necessário realizar uma curva padrão com diferentes diluições de um cDNA controle. Nesta etapa é determinado o threshold, o qual é um valor arbitrário do limiar que determina o ciclo onde é medida a fluorescência em cada reação (Ct). O valor Ct é usado pelo programa para calcular a expressão de um gene da amostra alvo. Os valores obtidos foram comparados quanto à sua significância estatística com o auxílio do programa MiniTab. O teste realizado foi o não-paramétrico de Mann-Whitney. 40 4 RESULTADOS4 RESULTADOS4 RESULTADOS4 RESULTADOS 4.1 CARACTERIZAÇÃO DA A 4.1 CARACTERIZAÇÃO DA A4.1 CARACTERIZAÇÃO DA A 4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA MOSTRAMOSTRA MOSTRA Foram avaliados no total 36 animais, pertencentes a 5 diferentes linhagens:C57Bl, SJL/J, Dmd mdx , Large myd e Lama2 dy2J /J,conforme ilustrado no Quadro 3. De acordo com os resultados obtidos e da viabilidade de material, o número de animais nos diferentes testes variou. Quadro3- Animais avaliados por cada metodologia SEMI SEMISEMI SEMI QUANTITATIVO QUANTITATIVOQUANTITATIVO QUANTITATIVO QPCR QPCRQPCR QPCR HISTOLOGIA HISTOLOGIAHISTOLOGIA HISTOLOGIA DIAFRAGMA DIAFRAGMADIAFRAGMA DIAFRAGMA GASTROCNÊMIO GASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIO GASTROCNÊMIO DIAFRAGMA DIAFRAGMADIAFRAGMA DIAFRAGMA GASTROCNÊMIO GASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIO GASTROCNÊMIO DIAFRAGMA DIAFRAGMADIAFRAGMA DIAFRAGMA GASTROCNÊMIO GASTROCNÊMIOGASTROCNÊMIO GASTROCNÊMIO C57Bl C57BlC57Bl C57Bl C19 C19 C20 C20 C 20 D C 20 G C20G C21 C21D C21G C22 C22 C22D C22G C23 C23 C 23 D C 23 G C23D C23G C24 C24 C 24 D C 24 G C25 C25 C 25 G C25D C25G C46 C46 C 46 D C 46 G C46D C46G C47 C47 C 47 D C 47 G C48 C48 SJL/J SJL/JSJL/J SJL/J S1 S2 S2 S 2D S 2 G S2D S3 S3 S 3D S 3 G S3D S3G S4 S4 S 4D S 4 G S4D S4G S5 S5 S 5D S 5 G S5D S5G S6 S6 S 6D S 6 G S6D S6G S7 S7 S 7D S 7 G S7D Dmd DmdDmd Dmd mdx mdxmdx mdx M8 M9 M9 M 9D M 9 G M9D M9G M10 M18G M25 M 25D M 25 G M25D M25G M26 M26 M 26D M 26 G M26D M26G 41 4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOS 4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOS4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOS 4.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO DA MIOSTATINA TATINATATINA TATINA 4.2.1 4.2.1 4.2.1 4.2.1 Aná AnáAná Análise semiquantitiva. lise semiquantitiva.lise semiquantitiva. lise semiquantitiva. A avaliação do nível de expressão da miostatina nos diferentes grupos de modelos murinos para distrofias musculares, foi realizado através do método semiquantitativo, com reações de PCR para amplificação do cDNA da miostatina em 27 e 30 ciclos. Utilizou-se como gene endógeno o GAPDH. Um exemplo representativo do padrão de amplificação e corrida em gel de acrilamida estão ilustrados na figura 12. M27 M27 M 27D M 27 G M27D M27G M28 M28 M 28D M 28 G M28D M28G M29 M29 M 29D M 29 G M29D M29G Large LargeLarge Large myd mydmyd myd L118 L118 L 118D L 118 G L118G L121 L121 L 121D L 121 G L121D L121G L123 L123 L 123D L 123 G L123D L123G L129 L129 L 129D
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