Aula PMAF Cromatografia 2018 2

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOFÍSICA
Cromatografia
Profa. PATRICIA M. A. FARIAS
Recife, PE
2018-1
25/10/2018 Profa. Patricia Farias - DBR- UFPE 1
DEFINIÇÃO
Conjunto de técnicas de separação cujo princípio depende da
distribuição diferenciada dos componentes de uma mistura entre
duas fases, uma considerada estacionária, e a outra, móvel.
KROMA + GRAPH
(COR) (ESCREVER)
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PRINCIPAIS FATOS HISTÓRICOS
1897-1903
David 
Talbot Day
Separação 
de HC do 
petróleo
Separação de pigmentos; 
proposição do termo 
cromatografia
Mikhail Tswett
1903-1906
1930
Kuhn e Lederer
Cromatografia 
em coluna
Cromatografia em 
papel
Izmailov e Shreiber
1938
1941
Martin e Synge
Particição em 
cromatografia 
líquida; 
Princípios de 
fase gasosa
Primeira publicação 
Cromatografia em 
fase gasosa
Martin e Synge
1952
1958
Egon Stahl
Cromatografia em 
camada delgada
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Cromatografia
Fase estacionária
Percolada (percorrida)
Por uma (ou mais de uma) fase móvel
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Diferentes compostos
(amostra fase móvel)
interagem com a fase
estacionária com diferentes
velocidades
Diferenças nas propriedades das fases móvel e estacionária
possibilitam que os componentes da amostra se desloquem
através do material cromatográfico com velocidades
desiguais, gerando assim, a separação dos mesmos.
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TIPOS DE SEPARAÇÃO
• Os princípios físico-químico básicos de separação são:
• Adsorção: O soluto é retido pela superfície da fase 
estacionária através de interações químicas ou físicas.
• Partição: O soluto se dissolve na parte líquida que envolve 
a superfície do suporte sólido.
• Troca iônica: O íon da amostra se liga à carga fixa (grupo 
funcional) da fase estacionária.
• Exclusão molecular: As moléculas são separadas por 
tamanho, havendo retenção das maiores.
• Bioafinidade: Ocorre uma ligação molecular específica e 
reversível entre o soluto e o ligante fixado à fase 
estacionária.
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LÍQUIDA
CROMATOGRAFIA
PLANAR COLUNA
LÍQUIDA GÁS FLUÍDO 
SUPERCRÍTICO
Líquida (CP)
Sólida (CCD)
Ligada (CCD)
Ligada (CSFL)Sólido (CSS)
Líquida (CGL)
Sólida (CGS)
Ligada (CGFL) Líquida (CLL)
Sólida (CLS, CE)
Ligada (CFLF, CTI e CB)
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CROMATOGRAFIA PLANAR
Exemplificada na prática realizada
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Cromatografia em Papel
• Um dos tipos de cromatografia planar
• Papel: fase estacionária
• Fase móvel  amostra(s) 
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Cromatograma
Eluição (corrida)
Amostra 
Fator de retenção
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Fator de retenção
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Prática
• Procedimento: 
• Com o papel de filtro recebido*, siga os passos abaixo. Esse papel será o seu 
cromatograma.
1- Com um lápis grafite, trace uma reta a dois centímetros de distância de 
uma das extremidades do papel de filtro recebido;
2- Utilizando uma caneta de ponta porosa, faça um pequeno círculo de cerca 
de um centímetro de diâmetro, de forma que o círculo desenhado esteja a um 
centímetro de distância da linha base (traçada na etapa anterior);
3- Mergulhe o papel de filtro no béquer contendo água e marque 15 minutos 
no cronômetro.
4- Observe o padrão obtido no papel (cromatograma) e calcule o fator de 
retenção Rf da sua amostra.
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Exercícios
• Num cromatograma em papel, uma mancha vermelha desloca-se 4,0 cm da origem enquanto a linha 
do solvente desloca-se 8,0 cm. Qual é o valor do Rf para essa mancha?
• Rf=ସ,଴
଼,଴
• Dois cromatogramas de uma mesma substância são obtidos sob as mesmas condições, exceto pelo
tempo de corrida (ou tempo de eluição), que num deles foi de 10 minutos e no outro 20 minutos. Os
valores de Rf serão diferentes? Explique sua resposta.
• Num experimento de cromatografia em papel, foram utilizadas 3 faixas de papel de filtro como fase 
estacionária. Na primeira faixa de papel foi depositada uma amostra de suco de uva. Na segunda faixa 
de papel foi depositada uma amostra de batom vermelho. Na terceira faixa de papel foi desenhado um 
círculo com lápis hidrocor marrom. O mesmo volume de água deionizada foi utilizado como solvente 
para os três experimentos e o tempo de eluição foi o mesmo para esses experimentos. Ao final da 
eluição, verificou-se que apenas duas amostras haviam sido separadas com sucesso. Qual das amostras 
não foi separada? Por que? 
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A cromatografia em papel é uma técnica simples, que não requer
instrumentação sofisticada e que demanda baixo custo, podendo ser
bastante útil e largamente explorada, em especial, para fornecer resultados
preliminares, para avaliação de rotas subsequentes de análise.
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Algumas vantagens da cromatografia em papel
Algumas desvantagens da cromatografia em papel
Baixa reprodutibilidade dos resultados, o alargamento da banda de 
difusão dos compostos e a baixa precisão na revelação (processo de 
visualização dos compostos separados, o qual nem sempre apresenta 
padrões bem definidos). 
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CROMATOGRAFIA PLANAR
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CROMATOGRAFIA PLANAR
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CROMATOGRAFIA PLANAR
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CROMATOGRAFIA PLANAR
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CROMATOGRAFIA PLANAR
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CROMATOGRAFIA EM COLUNA
Separação em colunas 
convencionais
Considere a aplicação de uma 
mistura de compostos orgânicos 
no topo de uma coluna 
cromatográfica
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• Separação em colunas 
convencionais
• Estabelecida a percolação da FE com o 
eluente (FM), os componentes da mistura 
passarão a migrar com velocidades 
desiguais caso o sistema seja adequado 
para a separação
SELETIVIDADE
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
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• Separação em colunas convencionais
Uma boa seletividade cromatográfica garantirá uma boa 
separação entre os componentes da amostra;
Cada componente da amostra poderá ser coletado isoladamente, 
através de um coletor de frações (neste caso, um simples frasco 
coletor)
O monitoramento das fases da amostras (constituintes
separados) pode ser feito através de um detector, cujo sinal
identifica a “saída” de cada componente da mistura,
isoladamente.
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
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• Separação em coluna
A resposta do detector é traduzida 
em um gráfico, ou CROMATOGRAMA, 
que relaciona o seu sinal com o 
tempo necessário para a eluição de 
cada componente.
As moléculas de cada componente 
também migram com velocidades 
desiguais devido a fenômenos de 
difusão e transferência de massa
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
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CROMATOGRAMA
• Eluição típica em cromatografia líquida
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TERMOS
• Tempo de retenção
O tempo gasto desde o ato de 
injeção até a saída do ponto 
máximo do pico do sistema
O tempo de retenção engloba todo 
o tempo que o componente em 
questão fica no sistema 
cromatográfico, quer na fase móvelquer na fase estacionária
O fator de separação (SELETIVIDADE) é calculado pela razão entre os respectivos 
fatores de retenção que, por sua vez, são relacionados aos tempos de retenção 
corrigidos
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TERMOS
• Seletividade
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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
• TEORIA
Martin e Synge – Biochem. J. 35, 1358 (1941)
Meio descontínuo análogo às colunas de destilação 
fracionada, constituído por um grande número de 
estágios de equilíbrio ou PRATOS TEÓRICOS (TEORIA DOS 
PRATOS TEÓRICOS)
Van Deemerter, Zuiderweg e Klinkenberg – Chem. Eng. 
Sci. 5, 271 (1956)
Meio contínuo através do qual a separação ocorre por 
fenômenos de difusão e transporte de massa (TEORIA DA 
VELOCIDADE)
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TEORIA DOS PRATOS TEÓRICOS
• Número de pratos teóricos
Coluna cromatográfica definida como uma série de estágios independentes onde acontece 
um quase-equilíbrio entre o analito dissolvido na fase estacionária (FE) e o gás de arraste
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PRATOS TEÓRICOS
• Número de pratos teóricos
• O coeficiente Kc determina a distribuição da amostra (A) entre as 
fases móvel (M) e estacionária (S) em um determinado estágio do 
equilíbrio, obviamente hipotético.
• Quanto mais efetiva for a presença de A na fase móvel (M) menor 
será o seu tempo de retenção
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PRATOS TEÓRICOS
• Número de pratos teóricos
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PRATOS TEÓRICOS
• Número de pratos teóricos
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PRATOS TEÓRICOS
• Cálculo do número de pratos teóricos
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PRATOS TEÓRICOS
• Altura equivalente à um prato teórico
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RESOLUÇÃO CROMATOGRÁFICA
• Equação geral
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RESOLUÇÃO CROMATOGRÁFICA
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