PROVA DE BIOTEC

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TERAPIA GÊNICA: baseia-se na transferência de material genético para modificar a expressão das 
células alvo, por meio da interseção de genes funcionais, para substituir ou completar sua ação. 
Doença gênica 
Recessiva Dominante 
Ocorre pela inativação do alelo normal Ocorre pela expressão do alelo mutante 
Tratamento por Terapia de reposição 
enzimática 
Tratamento através do 
Silenciamento 
 ↳ Induzir a expressão de proteínas RNAi ↲ ↳ CRISPER 
 
↓ 
Inativação do RNAm 
que expressa a proteína 
defeituosa 
↓ 
 
Inativação do gene mutado 
 
 
In vivo Ex vivo 
DNA recombinante DNA recombinante 
Transplante Autotransplante 
Injeção viral Injeção de células autólogas tratadas 
 ↳ Contato vírus/célula dentro do organismo ↳ Contato vírus/célula fora do organismo 
 
 
 
↳ Entrega direta - Receptores direcionado 
a célula alvo 
 
● Elementos de controle transcricional : Promotor, enhancer e elementos cromossomais; 
Sequências de capping, intrônicas, de poliadenilação e término da transcrição. 
● Elementos de controle traducional : Região 5’UTR e 3’UTR, Códons de início e término, 
Códons usage e Peptídeo sinal e caudas (Tags). 
Vetores - “ aquele que carrega, entrega “ 
● Comportar o tamanho do material 
genético; 
● Deve ser facilmente produzido; 
● Relação com a célula alvo; 
● Possuir expressão gênica a longo prazo; 
● Não ser tóxico e/ou imunogênico 
 
Retrovírus Adenovírus Adeno-associado 
I ntegração aleatória do DNA ao 
genoma da célula hospedeira; 
sem integração do DNA ao 
genoma da célula hospedeira; 
Vírus de DNA de fita 
simples; 
Pode gerar mutagênese 
ativadora de oncogenes ou 
inativação de genes 
supressores de tumor. 
 Expressão instável. Integração dentro do genoma do hospedeiro; 
 
 
 Não possui doenças humanas associadas; 
 Possui poder afinidade por vários tecidos; 
 
Se replica apenas na 
presença de um vírus 
auxiliar (adenovírus). 
Métodos de transformação gênica 
I. Métodos químicos 
● Lipossomos - vesícula com bicamada fosfolipídica: DNA plasmidial + lipossomo → complexo 
DNA-lipossomo → administração → endocitose ou fusao → endossomo → núcleo → episomo → 
expressão do episomo → produto gênico terapêutico; 
● Cloreto de cálcio. 
II. Métodos físicos 
● Microinjeção direta 
Alta taxa de transfecção; 
Só em ex vivo; 
Potencial para uso em terapia gênica na linhagem germinativa; 
 ↳ Problemas técnicos e éticos. 
● Eletroporação 
Alta taxa de transfecção; 
Só em ex vivo; 
Pouco eficiente pela grande morte celular . 
● Injeção balística de 
DNA 
Alta taxa de transfecção; 
Expressão transitória 
Lesão celular no local atingido pelo disparo . 
 
III. Métodos biológicos 
Bactérias 
Escherichia coli 
Levaduras 
Saccharomyces cerevisiae 
Células de mamíferos 
insetos 
Baculovírus 
Vantagens 
Fácil crescimento 
Purificação 
Algumas modificações 
pós-tradução 
Modificações pós tradução 
Várias cepas de genótipo 
conhecido 
 
Plasmídeo comercializado 
Baixo custo 
 
 
Desvantagens 
Sem modificação pós 
tradução 
Custo elevado Crescimento mento 
 Modificações não desejáveis Custo elevado 
 
Transfecção estável Transfecção transitória* 
Integração do DNA terapêutico ao DNA celular Nenhuma integração genômica 
Risco de integração não específica ↳ Nenhuma integração genômica 
 
Baseada por introdução química ou por 
eletroporação 
 Baseada na injeção viral 
Expressão a longo prazo Expressão a curto prazo 
Manipulação específica do gene/RNAm em 
cultura celular 
 
 
RNAi - silenciamento pós transcricional - apenas o que é expresso 
Silenciamento por meio da degradação do RNAm específico. Ela baseia-se na criação de uma fita de 
RNA ligante (siRNA - exógeno ou miRNA - endogeno) , que se liga ao RNAm de interesse, formando 
assim uma fita dupla, que por sua vez não é lida pelo Ribossomo, ocorre então a degradação da fita 
dupla formada e desse modo não ocorre a expressão da proteína mutada. 
Sh RNA - RNA em forma de grampo → processamento pelo complexo DICER → miRNA OU siRNA → 
complexo RISC → 
→ pareamento completo → atuação anti-SLICER → clivagem 
OU 
→ pareamento incompleto → bloqueio da passagem pelo ribossomo 
Para produção do siRNA - exógeno é feita introdução de um plasmídeo contendo a sequencia 
que expressa o ShRNA. 
Características Vantagens Aplicações 
Taxa de transcrição normal; Baixo custo; 
Estudo funcional: genética 
reversa e genômica funcional; 
- In vivo 
- In vitro 
Baixo nível de acumulação de 
transcritos; Resultados rápidos; 
Degradação citoplasmática do 
mRNA, pós transcricional 
Alelo-específico - 
autossômico dominante 
Repressão traducional. Sem alteração permanente do DNA; 
Produção de modelos 
animais. 
 Permite controle temporal e porcentagem de inativação. 
Estudo em humanos 
 
 
● Estímulo ao desenvolvimento de estudos diretamente em humanos, e vários protocolos clínicos 
já estão sendo testados; 
● Terapias oftalmológicas : compartimentalização ocular, permite a administração direta com 
injeções na cavidade vítrea. Visa silenciar a expressão de genes relacionados ao 
desenvolvimento de vascularização no fundo do olho, sobretudo em pessoas acima de sessenta 
anos de idade (Vitravene® - Novartis e Macugen® - Pfizer) 
CRISPR - silenciamento genético - DNA - definitivo 
● Papel biológico: defesa de células procariotas, contra ação de vírus invasores; 
● Edição genômica: células eucariotas 
1. Inserir genes : atuação do Sistema de reparo de DNA homólogo - plasmídeo contendo sequência de 
gene normal. 
2. Deletar genes : atuação do Sistema de reparo de DNA não homólogo - sem presença da sequência 
do gene. 
Corresponde a um fragmento de DNA bacteriano composto: 
● Sequência que expressa a proteína Cas 9; 
● RNA transativador (tracRNA - RNA de ligação entre a proteína CAS9 e o RNA guia); 
● PAM: sequência homóloga ao DNA humano e viral; 
● Sequência que expressa o RNA Guia - responsável por indicar a qual fragmento de DNA viral 
deve se ligar. 
Inserção do plasmídeo → expressão da CAS9, do RNAtrack e do RNAg → formação do complexo 
CAS9 + RNA track + RNAg → reconhecimento da sequência defeituosa → atuação da CAS9 → 
clivagem do gene → atuação do sistema de reparo de DNA. Caso haja sequência homóloga ela é 
inserida - inserção de gene, caso não haja sequencia homóloga é feita a deleção do gene e a religação 
da fita. 
Vantagens e desvantagens da técnica 
● Simplicidade no desenho do alvo: formação do complexo ribonucleotídeo e não em 
proteína/DNA; 
● Eficiente; 
● Mutações podem ser introduzidas em múltiplos genes ao mesmo tempo; 
● Interesse econômico em reduzir tempo e $$ em criar animais geneticamente modificados; 
● Introdução de mutações a loci não-específicos homólogos semelhantes, mas não idênticos, aos 
sítios alvos. 
VANTAGENS DO CRISPER EM RELAÇÃO AO RNAi 
1. Intervenção a nível de DNA - permanente, diferente do RNAi que é apenas no material 
expresso - transitório; 
2. Promove silenciamento tanto de genes dominantes quanto recessivos, diferente do 
RNAi que é apenas a nível recessivo; 
3. Meno complexo pela menor quantidade de proteínas envolvidas, diferente do RNAi 
que possui dois complexos DICER e RISC; 
4. Maisespecífico - pela presença de uma RNA Gia cuja sequencia é maior pareando 
com mais especificidade; 
5. Tem ação de silenciamento e inserção de genes, diferente do RNAi que apenas 
silencia.