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Professor: Christian Reis Disciplina: Biologia Molecular EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS HETEROLÓGAS Uso de uma célula ou um organismo para expressar uma proteína produzida em outra célula ou outro organismo. Ex.: TAQ DNA Polimerase, enzimas de restrição. Produção de proteínas recombinantes - heterólogas Para que produzir proteínas recombinantes? Pesquisa em estrutura e função de proteínas Imunização Fármacos: anticorpos terapêuticos, vacinas, hormônios, fatores de coagulação Diagnóstico: Kits para detecção de doenças. Por que expressar proteínas recombinantes? Dificuldade de se purificar do tecido original Proteínas do tecido podem estar contaminadas Proteínas recombinantes podem ser engenheiradas Processo completamente controlado Especificidade Quantidade Como preparar um sistema recombinante? Isolar e preparar o DNA ou cDNA Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína CLONAGEM E TRANSFORMAÇÃO EM PLASMÍDEOS LIGAÇÃO Como preparar um sistema recombinante Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína Vetores de expressão- componentes básicos malE M13 ORI- Marcadores seletivos Origem de replicação Promotor Sítio de poliadenilação Terminador Sítio de ligação do ribossomo Promotor Região Codificadora Terminador DNA RNA PROTEÍNA Ribossomo Estrutura de um Gene Expressão de gene em procarioto 10 Operon lac 11 Operon é um conjunto de genes nos procariontes que se encontram funcionalmente relacionados, contíguos e controlados coordenadamente, sendo todos expressos em apenas um mRNA pela ação de único promotor. O operon lac é conjunto de genes que codificam para proteínas envolvidas com o metabolismo da lactose. Organização na forma de operons Terminador Promotor/operador Regiões Codificadoras OPERON E. coli RNA MENSAGEIRO POLICISTRÔNICO 12 Estrutura do Operon lac Operon Lac: ~6000 bp 13 Metabolismo da lactose PERMEASE TRANSACETILASE β-GALACTOSIDADE Operon lac - Enzimas 14 A lactose induz a síntese de enzimas envolvidas no seu próprio metabolismo PERMEASE CITOPLASMA PERIPLASMA 15 Transporta lactose β-Galactosidase 16 Clivagem da lactose Ausência de lactose Presença de lactose Co nt ro le n eg at iv o do O pe ro n la c 17 Características que devem ser avaliadas em cada sistema de expressão Taxa de crescimento celular Complexidade do meio de cultura Custo do meio de cultura Nível de expressão Capacidade de expressar extracelularmente Capacidade de produzir as modificações pós-traducionais tais como: dobramento correto, formação das pontes dissulfeto, glicosilação, fosforilação, acetilação Vantagens dos sistemas de expressão eucarióticos - Dobramento das proteínas eucarióticas mais semelhante. - Modificações pós-traducionais. - Pode produzir grandes quantidades de proteínas com o uso de equipamentos próprios (fermentadores). Desvantagens dos sistemas de expressão eucarióticos - Sistemas caros - Necessitam equipamentos adequados - Poucos vetores disponíveis - Adequado para proteínas ricas em cisteínas- pontes dissulfeto. - Níveis de expressão mais baixos. Escolha do sistema - hospedeiros Bactérias Gram-negativas – E. coli e Caulobacter Bactérias Gram-positivas – Bacillus subtilis Leveduras – Saccharomyces pichiapastoris Protozoários – Leishmania tarentolae Fungos filamentosos – Aspergillus e Trichoderma Células de inseto Células de mamífero Células vegetais Plantas transgênicas e Animais transgênicos Replicação a cada 20 minutos em condições ideais de crescimento Disponibilidades de vários vetores de clonagem Disponibilidade de várias cepas mutantes, deficientes em proteases Linhagens de E. coli modificadas - Gram negativa SISTEMA MAIS UTILIZADO PARA EXPRESSÃO PROTEÍNA HETERÓLOGA Como preparar um sistema recombinante Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína Como preparar um sistema recombinante Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína Seleção Cepa Transformada Vetores carregam gene resistência a antibióticos Manutenção Pressão Seletiva Meio + antibiótico Seleção Antibióticos: ampicilina, canamicina, cloranfenicol, tetraciclina, Gentamicina,Higromicina, kanamicina Como preparar um sistema recombinante Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína Solubilidade proteína Desvantagens Sistema procariótico Não realiza modificações pós-traducionais - Não realiza secreção de proteínas. Algumas proteínas são tóxicas para as bactérias. Dobramento incorreto de proteínas (proteínas ricas em cys) Codon usage (uso de tRNAs) -Tendência a formar corpúsculos de inclusão. Degradação proteolítica Como preparar um sistema recombinante Isolar e preparar o DNA ou cDNA- clonar Escolher o sistema apropriado Transformar hospedeiro Selecionar hospedeiro transformado Checar se a proteína foi expressa Checar se está solúvel Purificar Checar se está ativa Caracterizar a proteína PURIFICAÇÃO PROTEÍNA RECOMBINANTE – CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE pGEX – Glutationa S-Transferase agarose-glutationa pET, pRSETA – tag de Histidinas coluna de níquel Proteína de interesse GST Clivagem com fator Xa Sistemas de Purificação pGEX - GE Sistemas de Purificação pRSETA - INVITROGEN Proteína de interesse 6xHis Glutationa Sefarose 4B – Purificação GST Ni-NTA Agarose – Purificação His ↑Eluente Proteína de interesse Resina - Glutationa Sefarose, Ni-NTA Agarose. PURIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE PURIFICAÇÃO PROTEÍNAS RECOMBINANTES Número do slide 1 Número do slide 2 Número do slide 3 Número do slide 4 Número do slide 5 Número do slide 6 Número do slide 7 Número do slide 8 Número do slide 9 Número do slide 10 Número do slide 11 Número do slide 12 Número do slide 13 Número do slide 14 Número do slide 15 Número do slide 16 Número do slide 17 Número do slide 18 Número do slide 19 Número do slide 20 Número do slide 21 Número do slide 22 Número do slide 23 Número do slide 24 Número do slide 25 Número do slide 26 Número do slide 27 Solubilidade proteína Número do slide 29 Número do slide 30 Número do slide31 Número do slide 32 Número do slide 33 Número do slide 34 Número do slide 35 Número do slide 36
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