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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO 
 
 
 
 
CLÁUDIA BATISTA FAVRETO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Transformação genética de soja usando biobalística, 
Agrobacterium e método integrado, em meio com ácido lipóico 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MARINGÁ 
PARANÁ – BRASIL 
MARÇO – 2012
 
CLÁUDIA BATISTA FAVRETO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Transformação genética de soja usando biobalística, 
Agrobacterium e método integrado, em meio com ácido lipóico 
 
 
 
Dissertação apresentada à Universidade 
Estadual de Maringá, como parte das 
exigências do Programa de Pós-Graduação 
em Genética e Melhoramento, para 
obtenção do Título de Mestre. 
Orientador: Dr. Ivan Schuster. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MARINGÁ 
PARANÁ – BRASIL 
MARÇO – 2012 
 
iii 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Mas a verdade pura é que ninguém devia ter de justificar o que ama. Se eu decidir 
me tornar um desses idosos caducos que vivem sozinho com seis beagles, quem 
será prejudicado pelo extremismo de meu afeto? Há tão pouca dedicação no mundo 
que deveríamos nos alegrar quando ela aparece sob qualquer forma e nunca 
zombar dela ou subestimar sua profundidade. 
O amor, acredito, é um acesso ao mundo e não uma fuga dele”. 
Mark Dotty. 
 
iv 
AGRADECIMENTOS 
 
 
À minha mãe, Débora Felipe Batista Favreto, pela força, pelo exemplo, pelos 
sorrisos e pelo colo. 
À Universidade Estadual de Maringá e ao Programa de Pós-Graduação em 
Genética e Melhoramento pela oportunidade. 
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes), 
pela concessão de bolsa de estudo. 
A Cooperativa Central de Pesquisa Agrícola (Coodetec), pela disponibilidade 
de recursos. 
Ao meu orientador, professor doutor Ivan Schuster, por toda ajuda. 
À Leandra Regina Texeira, pela paciência e ensinamentos. 
À Valesca Barros e Marina Nogueira, por dividirem o teto. 
Aos amigos Rodrigo Cavalcante, Jean Carlos Alekcevetch, Paulo Henrique 
Peruzzo, Renato Alexandre Malfato, por serem sinceros amigos. 
Às amigas Elaine Wilges, por todas as risadas e conversas, e Ana Paula 
Peracchi Oro, pelo seu exemplo de força e por me mostrar que a vida vale a pena. 
Ao Conrado Dorigon, por me mostrar diariamente que sempre há uma saída. 
Às amigas Adriana Scherloski e Natasha Barchinski, pela companhia. 
Aos colegas do Núcleo de Biotecnologia da Coodetec, pela colaboração em 
todas as etapas de realização deste trabalho. 
A todos que contribuíram para a minha formação pessoal e profissional, 
minha gratidão e meu carinho. 
 
 
v 
 
BIOGRAFIA 
 
 
CLÁUDIA BATISTA FAVRETO, filha de Claudio Favreto e Débora Felipe 
Batista Favreto, nasceu em 17 de junho 1987, na cidade de Cascavel, estado do 
Paraná. 
Ingressou no curso de Ciências Biológicas, em fevereiro de 2005, na 
Universidade Paranaense (Unipar), na cidade de Cascavel, Paraná, obtendo o título 
de Licenciada e Bacharel em Ciências Biológicas em fevereiro de 2009. 
Em março de 2009, ingressou no curso de Pós-Graduação em Biotecnologia 
Aplicada à Agroindústria, na Universidade Estadual de Maringá - UEM, na cidade de 
Maringá, estado do Paraná, obtendo o título de Especialista em agosto de 2010. 
Em fevereiro de 2010, ingressou no Curso de Mestrado do Programa de 
Pós-Graduação em Genética e Melhoramento (PGM), da Universidade Estadual de 
Maringá (UEM). 
 
vi 
SUMÁRIO 
 
LISTA DE QUADROS ............................................................................................... vii 
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ viii 
RESUMO.................................................................................................................... ix 
ABSTRACT ................................................................................................................. x 
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1 
2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 2 
2.1. Melhoramento genético de plantas e biotecnologia .......................................... 2 
2.2. Importância econômica e transformação genética da soja ............................... 3 
2.3. Transformação genética em plantas ................................................................. 4 
2.3.1. Transformação genética via biobalística ........................................................... 4 
2.3.2. Transformação genética via Agrobacterium ..................................................... 5 
2.3.3. Transformação genética via sistema integrado entre biobalística e 
Agrobacterium ....................................................................................................... 7 
2.4. Cultura de tecidos e regeneração dos explantes ............................................. 8 
2.4.1. Adição de antioxidantes aos meios de cultura ............................................... 10 
3. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 11 
3.1. Local e condução dos experimentos ............................................................... 11 
3.2. Plasmídeo ....................................................................................................... 11 
3.3. Transformação genética via biobalística ......................................................... 12 
3.4. Transformação genética via Agrobacterium .................................................... 14 
3.5. Transformação genética via sistema integrado entre biobalística e 
Agrobacterium ................................................................................................ 15 
3.6. Eficiência da transformação genética ............................................................. 16 
3.7. Análise das plantas T0..................................................................................... 16 
3.8. Análise da segregação dos possíveis transgenes .......................................... 17 
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 19 
4.1. Eficiência da transformação via expressão transiente GUS ........................... 19 
4.2. Regeneração de plantas ................................................................................. 21 
4.3. Análise molecular e ensaio com glufosinato de amônio nas plantas T0 e T1 .. 23 
5. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 27 
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 28 
 
vii 
 
LISTA DE QUADROS 
Quadro 1 - Classificação dos eixos embrionários submetidos ao ensaio GUS de 
acordo com a coloração apresentada na análise de expressão transiente 
dos três métodos de transformação avaliados ............................................ 20 
 
 
 
 
 
 
viii 
 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1 - Plasmídeo binário pCambia 3301, utilizado para as transformações 
genéticas. ........................................................................................................... 11 
Figura 2 - Eixo embrionário após a excisão dos primórdios foliares. A região em 
destaque corresponde ao meristema ............................................................ 12 
Figura 3 - Desenvolvimento de plântulas a partir de explantes submetidos a 
transformação genética, no período de desenvolvimento in vitro em meio 
seletivo. ..............................................................................................................14 
Figura 4 - (A) Delimitação da área foliar para aplicação do glufosinato de amônio. 
(B) Aplicação de glufosinato de amônio 0,5% nas folhas selecionadas. 17 
Figura 5 - Plantas no período de desenvolvimento V1, fase em que ocorreu a 
aplicação do herbicida glufosinato de amônio 0,5%. ................................. 18 
Figura 6 - (A) Eixos embrionários apresentando manchas azuladas. (B) Eixos 
embrionários com pontos azuis. .................................................................... 19 
Figura 7 - Plantas regeneradas a partir dos métodos de transformação avaliados, 
em diferentes concentrações do ácido lipóico. ............................................ 21 
Figura 8 - Planta T0 após aplicação de glufosinato de amônio (GA) 0,5%; realizada 
nas folhas com áreas marcadas. Observa-se que uma das folhas 
avaliadas é transgênica, e apresenta tolerância ao GA, e a outra não, 
apresentando suscetibilidade ao GA. ........................................................... 24 
Figura 9 - Resultados da análise molecular. (M): marcador de peso molecular de 
100 pb (pares de base); (1): controle positivo – plasmídeo pCambia 
3301; (2) planta transformada via Agrobacterium; (3) e (4): plantas 
transformadas pelo sistema integrado, e suscetíveis na avaliação com 
glufosinato de amônio ; (5): controle negativo para plantas transformadas 
– CD 217 convencional. .................................................................................. 24 
 
 
ix 
RESUMO 
FAVRETO, Cláudia Batista, M. Sc. Universidade Estadual de Maringá, março de 
2012. Transformação genética de soja usando biobalística, Agrobacterium e 
método integrado, em meio com ácido lipóico. Orientador: Ivan Schuster. 
Conselheiros: Carlos Alberto Scapim e Ronald José Barth Pinto. 
 
 
Com o advento da engenharia genética e da Biotecnologia, algumas barreiras 
associadas ao melhoramento genético de plantas foram eliminadas e tornou-se 
possível a transferência de genes entre indivíduos de espécies distintas. Este 
trabalho foi realizado com o objetivo de comparar a eficiência dos sistemas de 
transformação de soja via biobalística, Agrobacterium e sistema integrado e a adição 
de diferentes concentrações de ácido lipóico aos meios de regeneração. Foram 
utilizadas as concentrações de 50, 100, 250 e 500 µM de ácido lipóico e um grupo 
controle. Para a transformação, foi utilizado o vetor binário pCambia 3301 e a 
avaliação da eficiência da transformação foi realizada pelo ensaio histoquímico com 
o gene GUS. O método integrado apresentou maior eficiência de transformação, 
seguido pelo sistema Agrobacterium e biobalística. Não foram obtidas plantas 
transgênicas regeneradas para a transformação via biobalística e sistema integrado. 
Para a transformação via Agrobacterium, a eficiência de regeneração de plantas 
transgênicas foi de 0,4%. As plantas obtidas foram quiméricas, com tecidos 
contendo o transgene e tecidos não transgênicos. A regeneração das plantas 
submetidas à transformação foi superior nas concentrações entre 50 e 250 µM do 
ácido lipóico, sendo a concentração de 100 µM a que apresentou maior número de 
plantas regeneradas. 
 
Palavras-chave: Métodos de transformação de plantas; regeneração de plantas; 
antioxidante. 
 
 
 
x 
ABSTRACT 
FAVRETO, Cláudia Batista, M. Sc. State University of Maringá, March 2012. Genetic 
transformation of soybean using biolistic, Agrobacterium and integrated 
approach, in media with lipoic acid. Advisor: Ivan Schuster. Committee Members: 
Carlos Alberto Scapim and Ronald José Barth Pinto. 
 
Genetic engineering and biotechnology have, some of the barriers associated with 
plant breeding programs were eliminated, and it became possible to transfer genes 
between individuals of different species. This work was carried out to compare the 
efficiency of soybean transformation via biolistics, Agrobacterium and integrated 
system, and the addition of different concentrations of lipoic acid to the regeneration 
media. Concentrations used were 50, 100, 250 and 500 µM of lipoic acid, and a 
control group. Was used for processing the binary vector pCambia 3301 and 
evaluation of the efficiency of transformation was performed by histochemical assay 
with the GUS gene. The integrated method was more efficient processing, followed 
by Agrobacterium and biolistic system. There were obtained transgenic plants 
regenerated via biolistic transformation and integrated. For transformation via 
Agrobacterium efficiency of regeneration of transgenic plants was 0.4%. The plants 
obtained were chimeric, with tissues containing the transgene and non-transgenic 
tissues. The regeneration of plants subjected to transformation was higher in 
concentrations between 50 and 250 µM lipoic acid, the concentration of 100 µM had 
the greatest number of regenerated plants. 
 
Key words: Methods of plant transformation; plant regeneration; antioxidant. 
 
1 
1. INTRODUÇÃO 
Com o desenvolvimento da cultura de tecidos e da engenharia genética, 
diferentes técnicas de transformação genética de plantas foram estabelecidas 
(Brasileiro e Carneiro, 1998). 
Apesar da existência de uma grande variedade de técnicas de 
transformação, não existe ainda um sistema de transferência de genes que possa 
ser considerado universal ou ideal, isto é, um sistema que possa ser comumente 
utilizado para todas as espécies vegetais (Brasileiro e Dusi, 1999). 
Para a aplicação das técnicas de transformação na agricultura, é necessário 
que as células ou tecidos transformados sejam regenerados em plantas que 
expressem o gene introduzido. Sendo assim, o principal pré-requisito para todos os 
procedimentos de transformação é a capacidade de estabelecimento e manutenção 
de uma cultura de tecidos com plantas altamente responsivas a este processo 
(Droste et al., 2001). 
De acordo com Dan et al. (2009), existem problemas associados à cultura de 
tecidos e regeneração dos explantes que afetam a eficiência da transformação 
genética e limitam o número de plantas que podem ser regeneradas. Uma possível 
solução para estes fatores limitantes seria a adição de antioxidantes durante as 
etapas de cultura in vitro. 
A soja (Glycine max L.) tornou-se alvo da transformação genética por 
apresentar base genética entre as cultivares, o que poderia limitar alguns avanços 
pelos métodos convencionais de melhoramento. A importância econômica dessa 
cultura para o Brasil, segundo maior produtor em nível mundial, justifica esforços 
direcionados ao melhoramento genético de cultivares recomendadas para o plantio 
em nosso país (Wiebke, 2005). 
Neste contexto, este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a 
eficiência dos métodos de transformação via biobalística, Agrobacterium 
tumefaciens e sistema integrado; testar a eficiência de um agente antioxidante na 
regeneração dos explantes transformados e determinar a concentração ideal deste. 
 
2 
2. REVISÃO DE LITERATURA 
2.1. Melhoramento genético de plantas e biotecnologia 
O melhoramento genético de plantas e animais é uma prática quase tão 
antiga quanto a própria civilização. Na verdade, é difícil precisar se foi a agricultura 
que incentivou a prática do melhoramento de plantas pelos primeiros agricultores ou 
vice-versa. Provavelmente, ambos evoluíram paralelamente, aumentando a 
qualidade e a produtividade das culturas domesticadas pelo homem (Borém e 
Milach, 1999; Farah, 2007). 
Ao longo da evolução da agricultura, os agricultores verificaram que as 
melhores lavouras provinham de sementes sadias, normalmente colhidas em 
plantas vigorosas que se destacavam das demais. Assim, embora ainda não fossem 
conhecidas as leis da Genética, praticou-se a seleçãoempírica de plantas 
superiores quanto ao número de flores, sementes ou frutos, quanto ao tamanho ou 
palatabilidade dos mesmos e quanto à tolerância a fatores estresses bióticos e 
abióticos (Pinto, 2009). 
Ao final da Segunda Guerra, o modelo tecnológico baseado em pesquisas 
de melhoramento genético estava consolidado nos Estados Unidos e passou a ser 
difundido nos demais países, tendo como principal justificativa o argumento de 
proporcionar a solução para a erradicação da fome no mundo (Teixeira e Lages, 
1996). A substituição da agricultura tradicional por uma agricultura moderna nos 
países de Terceiro Mundo representou a abertura de importantes canais para 
expansão de negócios das empresas que se voltaram à produção de insumos para a 
agricultura (Beaud, 1994). 
De acordo com Albergoni e Pelaez (2007), a adoção destes insumos 
representou um aumento de cerca de 7% no total de alimentos per capta produzidos 
nos países de Terceiro Mundo. No entanto, seus efeitos nocivos passaram a ser 
identificados a partir da década de 1960 e divulgados na mídia e em publicações 
científicas. A utilização de fertilizantes e agrotóxicos passou a ser duramente 
criticada em função dos problemas causados pelo uso intensivo desses produtos, 
como intoxicação humana e animal e poluição do meio ambiente. 
Com o surgimento da engenharia genética, que supera essas dificuldades, o 
processo de domesticação de plantas e animais passou a ser mais acelerado. 
 
3 
Atualmente, uma combinação de técnicas permite isolar um gene específico que 
codifica uma característica desejada e transferir esse gene para outros organismos 
vivos a fim de adaptá-los aos nossos propósitos (Farah, 2007). 
De acordo com Costa et al. (2002), ao contrário dos métodos convencionais 
de cruzamento, na engenharia genética, a transferência de genes não se limita a 
indivíduos da mesma espécie. A compatibilidade sexual, nesse caso, torna-se 
irrelevante. Além disso, permite que se introduzam novas mudanças de modo muito 
mais preciso, com transferência de um único gene, enquanto cruzamentos 
convencionais envolvem uma mistura de milhares de genes, muitos dos quais com 
função desconhecida. Mais ainda, modificações genéticas podem ser realizadas em 
uma única geração, as quais, de outra forma, levariam centenas ou dezenas de 
gerações para serem estabelecidas, tornando o processo muito mais rápido. 
Outra vantagem do emprego de técnicas de engenharia genética é o fato de 
se poder fazer com que os genes introduzidos sejam ativos somente em 
determinado estágio de desenvolvimento da planta ou em um órgão específico, 
tecido ou célula. Antes da introdução do gene pode-se também fazer mudanças 
específicas em sua sequência, de tal forma que a proteína por ele codificada 
apresente propriedades mais adequadas às nossas necessidades. E, finalmente, a 
natureza e a segurança da nova proteína produzida podem ser avaliadas antes do 
início do programa de melhoramento de uma espécie vegetal (Farah, 2007). 
Como resultado do processo de transformação genética, obtém-se um 
organismo geneticamente modificado (OGM), também denominado organismo 
transgênico, que entre os benefícios gerados por essa nova tecnologia para a 
agricultura mundial, inclui-se a possibilidade de aumentar a produção de alimentos 
com maior teor nutricional (Batista et al., 2005). 
 
2.2. Importância econômica e transformação genética da soja 
A partir de 1960, a cultura da soja se estabeleceu como economicamente 
importante para o Brasil. Na década seguinte, a soja se consolidou como a principal 
cultura do agronegócio brasileiro, passando de 1,5 milhões de toneladas (1970) para 
mais de 15 milhões de toneladas em 1979 (Embrapa, 2011). 
Desde meados da década de 1970, o governo brasileiro passou a investir no 
melhoramento genético da soja para sua adaptação às condições brasileiras, 
 
4 
levando à “tropicalização” da cultura e favorecendo o aumento de sua produção. A 
produção brasileira da safra 2010/2011 foi 75,04 milhões de toneladas (Conab, 
2011). 
Os dois primeiros relatos da transformação genética de soja datam de 1988, 
quando Hinchee et al. utilizaram Agrobacterium para transformar nós cotiledonares, 
e McCabe et al. utilizaram as técnicas da biobalística para transformação de 
meristemas. A eficiência das transformações foi considerada baixa, mas, desde 
então, numerosas pesquisas vem sendo desenvolvidas com o intuito de aprimorar 
as técnicas. 
No Brasil, já são 31 eventos de plantas transgênicas liberados para o cultivo 
e comercialização. São oito eventos de algodão, cinco eventos de soja, 17 eventos 
de milho e um evento de feijão. Entre as tecnologias liberadas estão a tolerância à 
herbicidas (TH), tolerância a insetos (RI) e combinação das duas, além de um 
evento de resistência a vírus (CTNBio, 2012). A área plantada com soja transgênica 
na próxima safra será 13,4% maior do que na safra 2010/2011, ocupando 20,8 
milhões de hectares (82,7% da área total prevista) (Agrolink, 2011). 
 
2.3. Transformação genética em plantas 
Os dois métodos mais utilizados para a transferência de genes em plantas 
são a transferência direta utilizando a biobalística (Sanford, 1988) e a transferência 
indireta, via Agrobacterium (Trick e Finer, 1998). 
 
2.3.1. Transformação genética via biobalística 
A biobalística pode ser aplicada em qualquer tipo de tecido vegetal, porém 
requer equipamento apropriado, tem custo elevado e pode inserir um grande número 
de cópias do gene de interesse nas células vegetais, provocando problemas na 
inserção e regulação dos mesmos (Handel et al., 1997). 
A técnica da biobalística (balística biológica), também conhecida por 
biolística, aceleração de partículas, ou bombardeamento de partículas, foi descrita 
inicialmente por Sanford et al. (1987). 
De acordo com Sanford (1988) e Carneiro et al. (2004), o método é 
conhecido como transformação direta e consiste na aceleração de micropartículas 
que atravessam a parede celular e membrana plasmática, de forma não letal, 
 
5 
carregando substâncias fisicamente aderidas às micropartículas (DNA, RNA ou 
proteínas) para o interior da célula, utilizando o canhão gênico. 
A aceleração das micropartículas envolve um instrumento conhecido como 
“gene gun” ou canhão gênico (Rech e Aragão, 1998; Carneiro et al., 2004), capaz de 
acelerar as partículas a velocidades superiores a 1.500 km h-1. Ainda, o sistema é 
composto por uma câmara especial em condições de vácuo, que reduz o arraste das 
micropartículas pelo ar (Carneiro et al., 2004). Essas partículas (de ouro ou 
tungstênio) alojam-se aleatoriamente nas organelas celulares e, posteriormente, o 
DNA é dissociado das micropartículas pela ação do líquido celular e integrado no 
genoma nuclear do organismo receptor (Rech e Aragão, 1998; Carneiro et al., 2004). 
Para a aceleração das micropartículas, diferentes sistemas foram 
desenvolvidos e construídos, como a onda de choque gerada por uma explosão 
química, utilizando pólvora seca (Sanford et al., 1987); a descarga de hélio a alta 
pressão (Sanford et al., 1991); a vaporização de uma gota de água decorrente de 
descarga elétrica com alta voltagem e baixa capacitância (McCabe et al., 1988) ou 
com baixa voltagem a alta capacitância (Rech et al., 1991) ou por uma descarga de 
ar comprimido (Morikawa et al., 1989). 
No entanto, os sistemas que utilizam gás hélio sob alta pressão e descarga 
elétrica possuem um amplo espectro de utilização e são mais eficientes para a 
obtenção de altas freqüências de transformação em diferentes espécies vegetais. O 
sistema que utiliza gás hélio sob alta pressão tem sido responsável pela totalidade 
das plantas transgênicas obtidaspelo processo de biobalística (Rech e Aragão, 
1998). 
Para Lacorte et al. (1999), a biobalística é bastante versátil, podendo ser 
utilizada para a transformação de diferentes tipos de tecidos e células, em geral, 
independentemente do genótipo. Nesse processo efetivo e simples, podem-se 
bombardear embriões, hipocótilos, cotilédones, discos foliares, calos ou suspensões 
celulares. Virtualmente, qualquer tipo de célula ou tecido pode ser usado para 
transformação (Andrade, 2003). 
2.3.2. Transformação genética via Agrobacterium 
A técnica via Agrobacterium tumefaciens tem sido muito utilizada em 
dicotiledôneas, mas não em monocotiledôneas, pela dificuldade de identificar 
estirpes da bactéria que infectem estas plantas. Mesmo assim, o uso dessa bactéria 
 
6 
é de grande interesse, visto que uma ou poucas cópias do transgene são inseridas 
no genoma da planta, diferente do que ocorre na biobalística, além de poder ser 
considerada mais eficiente e de menor custo para as espécies compatíveis com a 
bactéria (Webb e Morris, 1992). 
Este método, chamado indireto, consiste no uso de um vetor, como a 
Agrobacterium, para intermediar a transferência do DNA. As bactérias do gênero 
Agrobacterium são fitopatógenos com a capacidade natural de transferir DNA para 
algumas espécies de dicotiledôneas, induzindo a formação de um tumor conhecido 
como galha-da-coroa (crown gall) ou a síndrome da raiz em cabeleira (hairy root). 
Para haver a infecção, é necessário algum tipo de ferimento, por meio do qual a 
agrobactéria vai reconhecer a planta e iniciar a transferência do DNA (Andrade, 
2003). 
Segundo Brasileiro e Lacorte (1998), a célula lesada exsuda moléculas-sinal 
(como compostos fenólicos, açúcares e aminoácidos) em resposta ao ferimento, que 
são responsáveis pela atração das bactérias (quimiotactismo positivo). Em contato 
com as células vegetais, as bactérias sintetizam microfibrilas de celulose, 
propiciando uma melhor fixação. 
As moléculas sinal vão também ativar genes que estão localizados na região 
de virulência (região vir) do plasmídio Ti (de Tumor-inducing), que é um plasmídio de 
alto peso molecular (150 a 250 kb), presentes em todas as linhagens patogênicas de 
Agrobacterium. A região vir é um regulon composto de seis a oito operons, 
contendo, aproximadamente, 25 genes. As diversas proteínas codificadas pelos 
genes vir vão promover a transferência de uma outra região do plasmídio Ti da 
bactéria para a célula vegetal. Essa região, denominada T-DNA (de transferred 
DNA), é delimitada por duas sequências repetidas de 25 pb, conhecidas como 
extremidades direita e esquerda. Uma vez no núcleo da célula, o T-DNA é integrado, 
de forma estável, no genoma vegetal (Brasileiro e Lacorte, 1998). 
No genoma vegetal, os genes presentes no T-DNA de Agrobacterium 
tumefaciens, conhecidos como oncogenes, são transcritos, codificando enzimas 
envolvidas na via de biossíntese de hormônios vegetais (citocininas e auxinas). 
Como conseqüência deste desbalanço hormonal, as células transformadas 
proliferam desordenadamente, levando à formação de um tumor, conhecido como 
galha-da-coroa ou grown gall (Brasileiro e Lacorte, 1998). 
 
7 
Conforme Andrade (2003), o sistema foi adaptado para a engenharia 
genética, onde os estudos visam caracterizar melhor o processo de transformação 
natural e utilizar o processo da transformação como métodos de manipulação 
genética em plantas. No entanto, não seria desejável a indução de tumor em plantas 
transgênicas criadas por engenharia genética. Para evitar tal possibilidade, os genes 
responsáveis pela indução do tumor são retirados do T-DNA e substituídos pelo 
gene que se pretende transferir para a planta. O plasmídio Ti, carregando um T-DNA 
assim modificado, é dito “desarmado” e pode então ser utilizado como vetor (Farah, 
2007). 
Embora a transformação pelo T-DNA represente um excelente sistema de 
transferência gênica, só é viável em plantas sujeitas a infecção pela bactéria A. 
tumefaciens, ou seja, as dicotiledôneas. Por muito tempo se considerou que as 
monocotiledôneas fossem resistentes à transformação por A. tumefaciens. 
Entretanto, com o refinamento do protocolo e adotando-se condições 
cuidadosamente controladas, foi possível transformar monocotiledôneas, como arroz 
e milho, utilizando este sistema (Farah, 2007; Hiei et al., 1994). 
O método mostra-se promissor porque permite introduzir baixo número de 
cópias dos transgenes nos cromossomos vegetais, geralmente uma ou duas (Hiei et 
al., 1994; Ishida et al., 1996). A inserção de múltiplas cópias dos genes pode levar a 
uma instabilidade da expressão dos transgenes ou ainda ao silenciamento gênico 
(Kaeppler et al., 2001; Vega et al., 2008). 
 
2.3.3. Transformação genética via sistema integrado entre biobalística e 
Agrobacterium 
Para garantir o sucesso da transformação mediada por Agrobacterium, a 
parede das células vegetais deve ser lesada, uma vez que os ferimentos estimulam 
a infecção pelas bactérias e, posteriormente, a transferência do gene de interesse 
(Bidney et al., 1992; Andrade, 2003). No entanto, a lesão não pode ser muito grande 
para não comprometer a sobrevivência do tecido vegetal (Wiebke, 2005). 
Bidney et al. (1992) utilizaram pela primeira vez um método alternativo de 
transformação genética, que associa a capacidade de abertura de microferimentos 
pelo bombardeamento de micropartículas da biobalística à capacidade de infecção 
pela Agrobacterium, para a transformação de folhas de tabaco e meristemas de 
 
8 
girassol. Mais tarde, a técnica foi também utilizada para a transformação de 
meristemas de banana (May et al., 1995) e de feijão (Brasileiro et al., 1996). 
Droste et al. (2000) utilizaram o sistema integrado para transformar embriões 
somáticos de soja e obtiveram expressão transiente significativa, porém não 
obtiveram a confirmação de transformantes estáveis devido à morte de todo o tecido 
vegetal submetido à transformação durante o período de regeneração. 
 
2.4. Cultura de tecidos e regeneração dos explantes 
A cultura de tecidos e a regeneração de plantas são também essenciais para 
a transformação, sendo que este processo completo requer um mecanismo que 
desenvolva plantas adultas (Texeira et al., 2011). Assim, requer protocolos de 
regeneração in vitro, que têm sido usados em combinação com protocolos de 
transformação para obter plantas transgênicas de soja (Kita et al., 2007). 
As técnicas de cultura de tecidos têm sido empregadas de diferentes formas 
no desenvolvimento de cultivares superiores. Em geral, essas técnicas são utilizadas 
em uma ou outra etapa do melhoramento, não, necessariamente, no 
desenvolvimento direto de novas cultivares, mas podem oferecer novas alternativas 
aos programas de melhoramento em suas diferentes fases e, muitas vezes, 
oferecem soluções únicas (Ferreira et al., 1998). 
Apesar da existência de uma grande variedade de técnicas de 
transformação, não existe ainda um sistema de transferência de genes que possa 
ser considerado universal ou ideal, isto é, um sistema que possa ser comumente 
utilizado para todas as espécies vegetais. Entretanto, a maior dificuldade para a 
obtenção de plantas transgênicas é o estabelecimento prévio de um sistema de 
regeneração eficiente. Cada espécie vegetal, ou mesmo diferentes genótipos dentro 
de uma mesma espécie, possui diferentes exigências nutricionais e hormonais para 
a sua regeneração (Brasileiro e Dusi, 1999). 
A incorporação de genes via transformação genética depende da cultura de 
células, tecidos ou órgãos para a regeneração de plantas in vitro. Vale ressaltar que 
o primeiro grupo de cultivares transgênicos comercializados em diversas partesdo 
mundo, apresentando, por exemplo, resistência a herbicidas, insetos e patógenos, 
foi desenvolvido mediante o uso de cultura de tecidos em combinação com métodos 
de biologia molecular (Ferreira et al., 1998). 
 
9 
A produção de plantas transgênicas requer que somente algumas das 
células de um explante ou tecido sejam transformadas com um gene de interesse e 
então se induza a regeneração de uma planta inteira (Dan et al., 2009). 
De acordo com Dan et al. (2009), existem três problemas comumente 
associados à cultura de tecidos e regeneração de explantes: escurecimento e/ou 
necrose dos tecidos, recalcitrância in vitro e escape de brotos não transformados, 
que afetam a eficiência da transformação, limitando o número de plantas 
transgênicas que podem ser regeneradas. 
Radicais livres intracelulares, ou seja, moléculas intracelulares de baixo peso 
molecular com um elétron não pareado são, muitas vezes, chamados de espécies 
reativas de oxigênio (ROS), sendo os dois termos comumente utilizados como 
equivalentes. Os radicais livres podem reagir com mais biomoléculas iniciando uma 
reação em cadeia de formação de radicais livres. Para encerrar essa reação, um 
radical livre recém-formado deve reagir com outro ou com um antioxidante (Dan, 
2008). 
Todos os organismos aeróbicos formam e degradam ROS para conduzir a 
concentrações fisiológicas ideais para função celular normal, porém, quando em 
concentrações excessivas, leva a um estado denominado estresse oxidativo. Esse 
estado está relacionado a aspectos positivos, como a proliferação celular normal, a 
ativação de fatores de transcrição ou expressão gênica, mas também pode estar 
relacionado a respostas negativas, como a inibição do crescimento e a perda das 
funções celulares, resultando em apoptose ou necrose por interferir em várias 
biomoléculas, como proteínas, lipídeos e DNA (Dan, 2008). 
Dan (2008) destaca que um equilíbrio entre oxidante e antioxidante é de 
fundamental importância para o funcionamento normal das células, regulação do 
crescimento e adaptação às diversas condições de crescimento. 
Um antioxidante pode ser definido como uma substância que atrasa ou 
previne a oxidação de seu substrato quando presente em baixas concentrações em 
relação ao seu substrato. Esse substrato pode ser quase tudo o que é encontrado 
em tecidos vivos especialmente proteínas, lipídeos, carboidratos e DNA (Dan, 2008). 
Alguns estudos relatam o escurecimento de tecido e/ou necrose, 
acarretando em uma baixa regeneração de plantas in vitro e o uso, com sucesso, de 
antioxidantes para resolver o problema (Dan, 2008). 
 
 
10 
2.4.1. Adição de antioxidantes aos meios de cultura 
De acordo com Dan et al. (2009), os principais antioxidantes usados na 
cultura de tecidos de plantas são classificados em grupos, baseados nas suas 
funções in vitro. O primeiro grupo de antioxidantes tanto pode reduzir o 
escurecimento dos tecidos quanto promover organogênese, embriogênese somática 
e acelerar o crescimento de brotos durante a micropropagação de diferentes 
espécies vegetais, tais como Protea cynaroides, Adonis amurensis e Euphoria 
langana. Neste grupo, encontram-se o ácido ascórbico, ácido cítrico, 
polivinilpirolidona (PVPP), dithiothreitol (DTT) e vitamina C. 
O segundo grupo de antioxidantes pode aumentar o número de brotos, 
raízes e crescimento da planta em diferentes espécies vegetais, como Solanum 
lycopersicum e Elaeagnus mollis. Neste grupo, encontram-se cisteína, phenoxane, 
3-ter-butil-4-hidroxianisole e vitamina E. Finalmente, o terceiro grupo de 
antioxidantes promovem formação de calos e organogênese e inibem a 
embriogênese somática. Esses antioxidantes são ascorbato, glutationa e α-tocoferol 
(Dan et al., 2009). 
Alguns antioxidantes estão associados ao controle do escurecimento e 
necrose dos tecidos transformados, tais como PVPP, DTT, ácido ascórbico, cisteína, 
glutationa, selenito, tocoferol e ácido lipóico (Dan, 2008). 
O ácido lipóico é um componente envolvido em muitos complexos 
multienzimáticos, como piruvato desidrogenase, alfa-cetoglutarato desidrogenase e 
complexo glicina descarboxilase (Packer et al., 1995). Sua ação foi investigada em 
plantas de cinco espécies transformadas via Agrobacterium. Em soja, a frequência 
de eventos transgênicos foi de 0,6 a 3,6%, enquanto a frequência de escape de 
brotos foi reduzida de 92 a 72%. 
 
11 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
3.1. Local e condução dos experimentos 
Os experimentos foram conduzidos no Núcleo de Biotecnologia da 
Cooperativa Central de Pesquisa Agrícola (Coodetec), localizada em Cascavel – PR. 
Foram utilizadas sementes da cultivar CD 217. Cada método de 
transformação (biobalística, Agrobacterium tumefaciens e sistema integrado) foi 
constituído de cinco tratamentos, sendo um sem a adição de ácido lipóico (grupo 
controle) e os demais utilizando concentrações de 50, 100, 250 e 500 µM do ácido 
lipóico adicionados aos meios de cultura. O delineamento experimental foi 
inteiramente casualizado, sendo que cada tratamento foi composto de 10 repetições, 
e cada repetição utilizou 10 explantes. A unidade experimental foi constituída de 
uma placa de Petri ou uma magenta, dependendo do desenvolvimento do explante. 
As plântulas obtidas foram sempre agrupadas pela unidade experimental inicial, ou 
seja, pela sua repetição. Uma vez que a variabilidade dentro dos tratamentos é 
grande neste tipo de experimento e não atendem às pressuposições básicas para a 
realização de testes estatísticos, os dados foram analisados apenas 
descritivamente. 
 
3.2. Plasmídeo 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1 - Plasmídeo binário pCambia 3301, utilizado para as transformações 
genéticas. 
 
12 
Foi utilizado o plasmídeo binário pCambia 3301 (Figura 1), que contém o 
gene da b- glucuronidase (GUS) e o gene da fosfinotricina acetiltransferase (BAR), 
que confere tolerância ao herbicida glufosinato de amônio, ambos sob controle do 
promotor CaMV35S. O plasmídeo também contém um gene de seleção bacteriana 
com canamicina. 
 
3.3. Transformação genética via biobalística 
Sementes de soja da cultivar CD 217 foram previamente desinfestadas 
superficialmente por 5 minutos com etanol 70% (v/v), seguido por 20 minutos em 
solução de hipoclorito de sódio 50% com Tween 20. Em seguida, as sementes foram 
enxaguadas quatro vezes com água destilada esterilizada e embebidas por 
aproximadamente 18 horas. 
Após esse período e em fluxo laminar, os cotilédones foram separados e o 
eixo embrionário isolado. Com o auxílio da lupa, os primórdios foliares foram 
excisados, ocorrendo a exposição da região meristemática, as quais foram utilizadas 
para o processo de transformação genética (Figura 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2 - Eixo embrionário após a excisão dos primórdios foliares. A região em 
destaque corresponde ao meristema. 
 
13 
Para a transformação, os eixos embrionários foram posicionados em meio 
de bombardeamento, contendo sais MS (Murashige e Skoog, 1962), 3% de 
sacarose, 0,8% de phytagel e pH 5,7, na região circundante à zona de morte, 
previamente marcada no fundo da placa com o auxílio de um delimitador de zona de 
morte. O posicionamento consiste em deixar a região meristemática sobre a linha da 
zona de morte, para que fique totalmente exposta durante o bombardeamento. 
Para o preparo da suspensão de partículas, a umidade relativa do ambiente 
foi mantida abaixo de 50%. 
A suspensão de micropartículas foi preparada de acordo com a metodologia 
de Sanford et al. (1993), com algumas modificações, sendo utilizado 50 µL de 
micropartículas de tungstênio,8 µg de DNA plasmidial, 50 µL de CaCl2 e 20 µL de 
espermidina. Para o bombardeamento, a pressão de saída do gás hélio utilizada foi 
de 1.200 psi e a placa contendo os eixos devidamente posicionados foi mantida a 80 
mm da tela de retenção. A pressão foi mantida em 27 polegadas de Hg (Rech e 
Aragão, 1998). 
Após o bombardeamento, os eixos embrionários foram transferidos para 
meio de indução, composto por sais MS (Murashige e Skoog, 1962), 22,2 µM de 
benzilaminopurina (BAP), 3% de sacarose, 0,6% de phytagel e pH 5,7, 
suplementado com ácido lipóico nas concentrações em teste. As placas com os 
meios foram mantidas no escuro por um período de 48 horas, em temperatura de 
24±1°C. 
Após esse período, os eixos embrionários foram transferidos para meio de 
seleção contendo sais MS (Murashige e Skoog, 1962), suplementado com 6 mg L-1 
de glufosinato de amônio, 3% de sacarose, 0,6% de phytagel e pH 5,7. Os eixos 
bombardeados foram regenerados por cerca de quatro a seis semanas neste meio e 
mantidas a 24±1ºC, sob fotoperíodo de 16 horas de luz e intensidade luminosa de 30 
µmol m-2 s-1. As plântulas bem desenvolvidas (Figura 3) foram transferidas para 
substrato (terra e vermiculita, 1:1) em copos descartáveis e cobertas por sacos 
plásticos por 7 a 10 dias, quando, de acordo com o desenvolvimento individual, 
foram realizados cortes nos sacos plásticos. As plântulas foram mantidas em câmara 
de crescimento por 30 dias, nas condições já citadas de temperatura, fotoperíodo e 
intensidade luminosa. 
Após o período de aclimatação, as plantas foram transplantadas para vasos 
em casa de vegetação. 
 
14 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3 - Desenvolvimento de plântulas a partir de explantes submetidos à 
transformação genética, no período de desenvolvimento in vitro em meio seletivo. 
 
3.4. Transformação genética via Agrobacterium 
Os procedimentos para a transformação genética via Agrobacterium foram 
realizados de acordo com Kanamori et al. (2009). 
Utilizou-se a linhagem EAH 105 de Agrobacterium tumefaciens, contendo o 
plasmídeo pCambia 3301. A bactéria foi crescida em meio YEP sólido, contendo 
canamicina a 28ºC. Após um período de aproximadamente 12 horas, uma colônia 
isolada foi transferida para o meio YEP líquido com o antibiótico e crescida por 24 
horas.Transferiram-se 100 µL da pré cultura para 100 mL de meio YEP com 
antibiótico e manteve-se por 1 dia sob agitação constante, a 28ºC. 
Para o co-cultivo, a densidade óptica foi ajustada para 0,8, a uma 
absorbância de 600 nm. A suspensão bacteriana foi centrifugada e o pellet formado 
foi ressuspendido em meio C líquido (metade da concentração de sais MS, 
vitaminas B5, MES, sucrose, 5 mg mL-1 benzil-aminopurina, 1 M acetoseringona, 1M 
tiosulfato de sódio, 1 M DTT. pH 5,4)(Kanamori et al., 2009). 
Sementes de soja da cultivar CD 217 foram esterilizadas e embebidas de 
acordo com os procedimentos previamente descritos no item 3.2. Em fluxo laminar, 
os eixos embrionários foram isolados e os primórdios foliares excisados. 
 
15 
Os explantes foram imersos na suspensão bacteriana suspendida em meio 
C, onde permaneceram por 30 minutos. Após, foram colocados sobre papel filtro 
estéril para retirada do excesso de umidade e, em seguida, transferidos para meio C 
sólido (solidificado com phytagel) (Kanamori et al., 2009), suplementado com as 
concentrações de ácido lipóico em teste (grupo controle, 50, 100, 250 e 500 µM). 
Foram acondicionados 50 eixos por placa. Depois de cinco dias de co-cultivo a 
24±1°C, os explantes foram lavados em água destilada estéril contendo 50 mg L-1 de 
meropenem, colocados sobre papel filtro e acondicionados em meio S1 sólido (sais 
MS, vitamina B5, MES, sucrose, phytagel, 12,5 mg mL-1 meropenem. pH 5,7), 
mantidos em câmara de crescimento com as condições descritas anteriormente. 
Depois de duas semanas, os explantes foram transferidos para meio S2 
(sais MS, vitamina B5, MES, sucrose, phytagel, 12,5 mg mL-1 meropenem, 10 mg 
mL-1 glufosinato de amônio. pH 5,7), onde permaneceram por mais duas semanas. 
Após o período de cultura in vitro, as plântulas bem desenvolvidas foram 
transferidas para substrato (terra e vermiculita, 1:1) e cobertas por sacos plásticos 
por sete a dez dias. As plântulas foram mantidas em câmara de crescimento por 30 
dias, nas condições previamente citadas de temperatura, fotoperíodo e intensidade 
luminosa. 
Após o período de aclimatação, as plantas foram transplantadas para vasos 
em casa de vegetação. 
 
3.5. Transformação genética via sistema integrado entre biobalística e 
Agrobacterium 
Para a desinfestação superficial, retirada do eixo embrionário e excisão dos 
primórdios foliares, foram utilizados os mesmos processos descritos anteriormente. 
Os procedimentos realizados para a transformação pelo sistema integrado foram 
descritos por Wiebke (2005), utilizando-se micropartículas de tungstênio sem DNA. 
Imediatamente após o tiro da biobalística, os eixos foram transferidos para um tubo 
que contém a suspensão bacteriana em meio C líquido e então, todos os 
procedimentos seguintes foram os mesmos realizados na transformação via 
Agrobacterium. 
Após o período de cultura in vitro, as plântulas bem desenvolvidas foram 
transferidas para substrato (terra e vermiculita, 1:1) e cobertas por sacos plásticos 
por 7 a 10 dias. As plântulas foram mantidas em câmara de crescimento por 30 dias, 
 
16 
nas condições previamente citadas de temperatura, fotoperíodo e intensidade 
luminosa. 
Após o período de aclimatação, as plantas foram transplantadas para vasos 
em casa de vegetação. 
 
3.6. Eficiência da transformação genética 
Para avaliar a eficiência dos métodos de transformação, realizou-se o ensaio 
histoquímico GUS, de acordo com Jefferson (1987). Para cada método de 
transformação em teste, foram utilizados 100 eixos embrionários da cultivar CD 217, 
além dos eixos submetidos à transformação e regeneração. 
Os explantes foram transformados seguindo os procedimentos já descritos, 
e após o período de 48 horas para biobalística e 120 horas para transformação via 
Agrobacterium e sistema integrado, foram acondicionados em magentas contendo 
tampão GUS (50 mM NaPO4 – pH 7,0; 10 mM beta-Mercaptoetanol; 10 mM 
Na2EDTA; 0,1% lauril sarcosine de sódio; 0,1% de Triton X-100), onde 
permaneceram sob agitação constante de 200 rpm, a 37ºC por um período de 
aproximadamente 12 horas. 
Após este período, os eixos foram lavados duas vezes com álcool 70% e 
escorridos sobre papel filtro estéril. 
Com o auxílio de estereomicroscópio binocular, os eixos foram classificados 
de acordo com sua coloração. 
 
3.7. Análise das plantas T0 
Todas as plantas T0 que regeneraram em meio seletivo e foram aclimatadas 
em casa de vegetação foram usadas para o ensaio de resistência ao herbicida 
glufosinato de amônio. Aplicou-se, em duas folhas de cada planta, o herbicida 
glufosinato de amônio a 0,5% (Figura 4 A e B). Após um período de sete dias, as 
plantas foram avaliadas. 
A análise das plantas transformadas (T0) foi realizada, também, por reação 
em cadeia da polimerase (PCR) para detectar a presença do transgene pCambia 
3301 nas plântulas. O DNA genômico foi extraído, utilizando o protocolo descrito por 
Doyle e Doyle (1990) modificado. Cada reação (20 µL) foi elaborada com 20 mM 
Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 3 mM MgCl2, 250 µM de cada desoxinucleotídeo 
 
17 
(dATP, dTTP, dGTP e dCTP), 1,0 U de Taq DNA polimerase, 30 ng de DNA e 0,2 
µM de cada oligonucleotídeo iniciador específico para o primer BAR (5’-
GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’ e 5-’GTCTGCACCATCGTCAACC-3’).Figura 4 - (A) Delimitação da área foliar para aplicação do glufosinato de amônio. (B) 
Aplicação de glufosinato de amônio 0,5% nas folhas selecionadas. 
 
As reações foram submetidas ao seguinte programa de temperaturas: 3 
minutos a 94ºC, seguido de 35 ciclos de amplificação (30 segundos a 94ºC; 30 
segundos a 58ºC; 40 segundos a 72ºC) e extensão final de 7 minutos a 72ºC, em 
termociclador Hybaid modelo Express. Os produtos da PCR foram submetidos à 
eletroforese em tampão SB 0,5X (Brody e Kern, 2004) em gel de agarose 0,8% (p/v) 
com brometo de etídio (0,5 µg mL-1) e visualizados com luz ultravioleta em aparelho 
de fotodocumentação (Vilber Loumat, Marne-la-Vallee, França). 
 
3.8. Análise da segregação dos possíveis transgenes 
Em casa de vegetação, todas as sementes obtidas a partir das plantas T0 
transformadas via biobalística e Agrobacterium foram semeadas em bandejas de 
isopor de 72 células, em substrato composto por terra:areia (1:1) e 5% húmus, 
sendo adicionada uma semente por célula. Aproximadamente 15 dias após o plantio, 
quando as plantas apresentavam-se no estádio fisiológico V1 (Figura 5), borrifou-se 
A B 
 
18 
glufosinato de amônio 0,5% sobre as plântulas, a fim de verificar a possível 
segregação do gene. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5 - Plantas no período de desenvolvimento V1, fase em que ocorreu a 
aplicação do herbicida glufosinato de amônio 0,5%. 
 
Sete dias após a aplicação, foi realizada a análise da tolerância das plântulas 
ao herbicida. 
 
19 
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
4.1. Eficiência da transformação via expressão transiente GUS 
A realização de ensaio histoquímico para o gene GUS envolve uma série de 
variáveis que podem afetar a localização histoquímica, incluindo todos os aspectos 
de preparação do tecido, fixação e a reação em si (Jefferson, 1987). Quando se 
realiza a transformação de plantas com o gene GUS, há possíveis padrões de 
expressão diferentes, expressos pela coloração. Os eixos embrionários foram 
classificados de acordo com a sua coloração (Figura 6). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6 - (A) Eixos embrionários apresentando manchas azuladas. (B) Eixos 
embrionários com pontos azuis. 
 
Nos testes realizados para a eficiência da transformação, foram observados 
diferentes padrões de expressão, que variaram de pontos a manchas azuis. Ambas 
as formas de expressão confirmam a eficiência dos métodos em teste. No entanto, 
os pontos azuis são essencialmente limitados à região meristemática do explante, o 
que aumentaria a possibilidade de uma planta transgênica em relação às manchas. 
No Quadro 1, estão apresentados os resultados da análise de expressão 
transiente do gene GUS para os três métodos de transformação utilizados. 
O sistema integrado de transformação apresentou atividade gus maior que o 
método que utiliza somente o bombardeamento de partículas – biobalística ou 
Agrobacterium. Para o sistema integrado, a expressão transiente do gene GUS 
ocorreu em quantidade superior de eixos embrionários e em maior área por eixo. 
Além disso, a quantidade de eixos que não apresentou coloração foi menor para o 
método integrado. 
A B 
 
20 
Quadro 1 - Classificação dos eixos embrionários submetidos ao ensaio GUS de 
acordo com a coloração apresentada na análise de expressão transiente dos três 
métodos de transformação avaliados 
 Biobalística Agrobacterium Sistema integrado 
Ausência de 
coloração 
 
16 
 
41 
 
6 
 
Pontos azuis - 14 26 
Manchas azuis 84 45 51 
Pontos e manchas 
azuis 
- - 17 
 
Os resultados obtidos, conforme Quadro 1, diferem dos resultados de Droste 
et al. (2000), que utilizaram o sistema integrado e a biobalística para transformação 
de clumps embriogênicos de soja, obtidos a partir do desenvolvimento de 
cotilédones imaturos. De acordo com os dados destes autores, a eficiência da 
transformação pelo sistema integrado foi menor que a biobalística, pois, além de 
apresentarem baixo número de pontos azuis, estes não apresentam coloração tão 
intensa quando transformados pelo sistema integrado. 
Mesmo considerando baixa a eficiência do método integrado quando 
comparado ao método que utiliza somente o bombardeamento de partículas, Droste 
et al. (2000) consideraram o método integrado de bombardeamento uma alternativa 
promissora para a transformação de tecidos embriogênicos de soja. 
May et al. (1995) obtiveram plantas transformadas de banana a partir da 
inoculação de Agrobacterium em meristemas previamente bombardeados com 
micropartículas. Bidney et al. (1992) observaram que folhas de tabaco e meristemas 
de girassol têm sua frequência de transformação aumentada quando a inoculação 
da Agrobacterium ocorre após o processo de bombardeamento. Apesar das 
diferenças relacionadas à espécie vegetal, condição fisiológica do explante, tipo do 
explante e sistema de cultura, observa-se que os microferimentos causados pelo 
bombardeamento das partículas podem melhorar significativamente a eficiência da 
transformação mediada por Agrobacterium em diferentes tipos de tecidos (Droste et 
al., 1994). 
A produção de plantas transgênicas de soja pela transformação via 
Agrobacterium também foi alcançada a partir de nós cotiledonares (Hinchee et al., 
 
21 
1988), cotilédones imaturos (Parrott et al., 1994) e culturas embriogênicas em 
suspensão (Trick e Finer, 1998). Este método é genótipo-dependente em termos de 
susceptibilidade à Agrobacterium tumefaciens e à resposta quanto à regeneração 
das plantas (Owens e Cress, 1985; Hinchee et al., 1988; Delzer et al., 1990). Além 
disso, requer considerável habilidade para alcançar a infecção de células do tecido 
alvo com Agrobacterium (Zhang et al., 1999). 
 
4.2. Regeneração de plantas 
Na Figura 7, estão apresentados os resultados da regeneração de plantas 
em cada método de transformação, com as diferentes concentrações de ácido 
lipóico. 
 
 
Figura 7 - Plantas regeneradas a partir dos métodos de transformação avaliados, 
em diferentes concentrações do ácido lipóico. 
 
Os dados obtidos a partir da regeneração das plantas foram submetidos ao 
teste de normalidade de Lilliefors. Por não atenderem às pressuposições básicas, 
 
22 
não foi possível realizar a análise de variância e regressão para os mesmos. Por 
este motivo, os resultados foram analisados a partir de estatística descritiva. 
Para todas as concentrações de ácido lipóico testadas nos métodos de 
transformação, a taxa de regeneração de explantes foi baixa. No método da 
biobalística, as três plantas obtidas não foram suficientes para justificar a adição do 
ácido lipóico nas etapas de regeneração. 
A regeneração de plantas submetidas às transformações via Agrobacterium 
e sistema integrado mostrou-se mais eficiente que o método que utiliza somente a 
biobalística. No método integrado, a concentração de 50 µM foi a que apresentou 
maior número de plantas regeneradas, enquanto no método da Agrobacterium as 
concentrações com melhores resultados variaram entre 50 a 250 µM do ácido. Dan 
et al. (2009) trabalharam com transformação via Agrobacterium em soja e 
observaram que a concentração de 100 µM foi mais eficiente para o número de 
explantes regenerados, enquanto as concentrações 250 e 500 µM apresentaram-se 
superiores no que se refere à eficiência da transformação. 
Comparando os métodos integrado e biobalística, observa-se que o estresse 
causado pelo bombardeamento de micropartículas é alto, o que pode ser 
responsável pela baixa quantidade de plantas obtidas. Contudo, o bombardeamento 
também é utilizado no sistema integrado, embora neste método a quantidade de 
explantes regeneradosfoi alta. 
Dan (2008) e Dan et al. (2009) avaliaram a adição do antioxidante em 
transformações via Agrobacterium, obtendo resultados satisfatórios que justificam 
seu uso nas etapas de regeneração dos explantes. A diferença observada quanto a 
quantidade de plantas regeneradas pelos dois métodos (biobalística e sistema 
integrado) pode sugerir que o uso do ácido lipóico seja eficiente em sistemas de 
transformação que envolvam Agrobacterium, sendo que, para as transformações 
que utilizam somente o bombardeamento de partículas, outro antioxidante deva ser 
testado, sendo mais adequado a este método de transformação. 
A concentração de 500 µM não foi eficiente para a regeneração dos 
explantes, o que pode indicar que concentrações elevadas tornam-se tóxicas ou não 
favoráveis ao desenvolvimento dos explantes. Estes resultados também foram 
verificados por Dan et al. (2009), que observaram redução na quantidade de 
regenerantes na concentração de 500 µM . 
 
23 
A baixa quantidade de plantas regeneradas em relação aos resultados do 
ensaio GUS pode ser justificada pelo fato de que uma sequência de DNA introduzida 
em uma célula pode vir a ser transcrita, mesmo sem estar integrada ao genoma. A 
maior intensidade da expressão gênica transiente é, geralmente, observada de 24 a 
72 horas após a transferência, não sendo detectada após uma semana (Lacorte et 
al., 1999). 
Nos sistemas de transferência direta de DNA, um fator limitante para a 
obtenção de plantas transgênicas é a baixa frequência de integração estável do 
DNA. Esta integração pode variar de menos de 1% a 5% das células inicialmente 
transformadas. Portanto, a maior parte da expressão gênica detectada 24 ou 72 
horas após a transformação é transiente e não existe uma relação direta entre o 
nível de expressão transiente e a frequência de integração (Birch e Franks, 1991), o 
que pode justificar a grande diferença entre a expressão GUS e a eficiência na 
obtenção de plantas pelo sistema da biobalística. 
 
4.3. Análise molecular e ensaio com glufosinato de amônio nas plantas T0 e T1 
Os testes com glufosinato de amônio nas plantas T0 revelam que, das 138 
plantas testadas, apenas uma apresentou sinais de tolerância ao herbicida, por não 
apresentar efeitos negativos após a aplicação deste (Figura 8). Esta planta foi obtida 
pela transformação via Agrobacterium e regenerada em meio suplementado com 
100 µM de ácido lipóico. Apresentou tecidos transgênicos e tecidos não 
transformados, uma vez que uma das folhas em que foi aplicado glufosinato de 
amônio foi tolerante ao herbicida e a outra folha foi suscetível (Figura 8). 
Este resultado caracteriza o quimerismo que pode ocorrer quando se realiza 
transformação genética em tecido multicelular. Esta planta quimérica também não 
amplificou o fragmento correspondente ao marcador utilizado, o que sugere que o 
tecido amostrado para análise de DNA também não contenha o transgene. 
Outra planta (amostra 2 na Figura 9) suscetível ao herbicida apresentou 
banda referente ao marcador do gene bar (Figura 9), indicando que as folhas em 
que foi aplicado o glufosinato de amônio eram formadas por tecido não transformado 
e a folha coletada para análise de DNA era transgênica. Esta planta também é 
quimérica e foi transformada pelo sistema Agrobacterium e também regenerada em 
meio suplementado com 100 µM de ácido lipóico. 
 
24 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8 - Planta T0 após aplicação de glufosinato de amônio (GA) 0,5%; realizada 
nas folhas com áreas marcadas. As folhas indicadas com as setas receberam 
aplicação do herbicida. Observa-se que uma das folhas avaliadas é transgênica, e 
apresenta tolerância ao GA, e a outra não, apresentando suscetibilidade ao GA. 
 
 Para os métodos de transformação avaliados, apenas o sistema via 
Agrobacterium apresentou plantas transformadas, com 0,4% de transformantes, e 
todas as plantas obtidas foram quiméricas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9 - Resultados da análise molecular. (M): marcador de peso molecular de 
100 pb (pares de base); (1): controle positivo – plasmídeo pCambia 3301; (2) planta 
transformada via Agrobacterium; (3) e (4): plantas transformadas pelo sistema 
integrado, e suscetíveis na avaliação com glufosinato de amônio ; (5): controle 
negativo para plantas transformadas – CD 217 convencional. 
 
25 
As amostras identificadas como 3 e 4 na Figura 9, transformadas pelo 
sistema integrado, não apresentaram bandas referentes ao plasmídio, o que indica 
que não são plantas transgênicas. Estas plantas podem ser escapes, pois 
regeneraram em meio contendo glufosinato de amônio. Podem também ser 
quimeras e, neste caso, tanto as folhas utilizadas para o teste com glufosinato de 
amônio quanto a folha utilizada para análise de DNA são tecido não transformado, 
mas podem haver tecidos transformados nestas plantas. Para fins de análise dos 
dados, estas plantas foram consideradas escapes (não transgênicas). 
Em muitos procedimentos de transformação de plantas, o número de 
regenerantes não-transgênicos pode ser alto o suficiente para ser considerado um 
problema. Elevar a concentração do agente seletivo é uma estratégia para superar a 
geração de escapes (Niu et al., 2000), contudo, em alguns casos, alta concentração 
do agente seletivo pode inibir a proliferação de células transformadas, assim como 
de não-transformadas (Harjeet e Raina, 1997). 
Tecidos transformados podem abrigar células transformadas e não 
transformadas. Como resultado, a planta regenerada pode ser uma quimera para os 
transgenes. O problema do quimerismo parece ser mais frequente do que 
originalmente imaginado e tem sido relatado em muitas espécies, incluindo tabaco 
(Schmülling e Schell, 1993), soja (Christou, 1990), batata (Rakosy-Tican et al., 2007) 
e arroz (Christou e Ford, 1995). Quimeras são também recuperadas com alta 
frequência em árvores frutíferas, tais como maçã e Citrus, para o qual o escapes e 
quimeras são responsáveis por 90% das linhas regeneradas (Costa et al., 2002; 
Domínguez et al., 2004). 
Na obtenção de plantas via organogênese, a ocorrência de quimerismo pode 
ser explicada mais plausivelmente pela sua origem multicelular (Poethig, 1989). O 
desenvolvimento de quimeras e escapes pode, ainda, resultar da expressão 
transiente do gene marcador durante os estágios iniciais de regeneração, além da 
presença e/ou persistência da Agrobacterium em células de tecidos infectados 
(Faize et al., 2010). 
Quimeras também podem ser consequência da proteção de células não 
transgênicas que circundam as células transformadas (Domínguez et al., 2004) ou 
da ineficácia dos agentes seletivos em espécies com tolerância endógena (Rakosy-
Tican et al., 2007). 
 
26 
Para as plantas obtidas neste trabalho, o quimerismo pode ter ocorrido pelo 
fato do agente de seleção ser um herbicida de contato. As células que estão em 
contato com o meio seletivo estão sob seleção e, em sua grande maioria, são 
transgênicos. As células que não estão em contato com o meio seletivo não são 
necessariamente transgênicas e podem regenerar plantas, desde que os tecidos 
que estão em contato com o meio seletivo sejam transgênicos. 
Em sistemas de transformação que apresentem possibilidade alta de 
quimerismo, as sementes obtidas das plantas T0 (sementes T1) devem ser avaliadas 
para a presença dos transgenes, pois as sementes podem ser obtidas tanto a partir 
de tecidos transformados como a partir de tecidos não transformados. 
As sementes T1 obtidas a partir das plantas T0 pelos métodos de 
transformação via biobalística e Agrobacterium foram submetidas à aplicação do 
glufosinato de amônio 0,5%.As 189 sementes obtidas a partir das 3 plantas da 
biobalística e as 5.175 sementes obtidas a partir das 65 plantas do sistema 
Agrobacterium geraram plantas que foram sensíveis ao herbicida, indicando que o 
método da biobalística não gerou plantas transgênicas. Já as plantas quiméricas do 
sistema Agrobacterium geraram sementes a partir de regiões não transgênicas, o 
que justifica a sensibilidade ao agente seletivo. 
 
27 
5. CONCLUSÕES 
Os métodos de transformação via Agrobacterium e sistema integrado 
mostraram-se mais eficientes para a obtenção de plantas regeneradas que o método 
que utiliza somente a biobalística. Para estes métodos de transformação, a adição 
do ácido lipóico contribuiu para a regeneração nas concentrações de 50 a 250 µM 
para o método de Agrobacterium e 50 µM para o sistema integrado. 
Embora na avaliação transiente da expressão do gene GUS foram obtidas 
altas taxas de eficiência das transformações, não foram obtidas plantas transgênicas 
para os métodos de biobalística e integrado. Para o método de Agrobacterium, a 
eficiência na obtenção de plantas transgênicas foi de 0,4%. Todas as plantas 
transgênicas obtidas eram quiméricas e não produziram sementes transgênicas. 
 
28 
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
AGROLINK. Brasil tem novo recorde na adoção de lavouras transgênicas. 
Disponível em: http://www.agrolink.com.br/culturas/soja/noticia/brasil-tem-novo-
recorde-na-adocao-de-lavouras-transgenicas_133944.html. Acesso em: 07, agosto, 
2011. 
 
ALBERGONI, L.; PELAEZ, V. Da revolução verde à agrobiotecnologia: ruptura ou 
continuidade dos paradigmas? Revista de Economia, 33:31-53, 2007. 
 
ANDRADE, S.R.M. Transformação de plantas. Planaltina: Embrapa Cerrados, 
2003. 28p. 
 
BATISTA, R.; NUNES, D.; CARMO, M.; CARDOSO, C.; SÃO JOSÉ, H.; ALMEIDA, 
A.B.; MANIQUE, A.; BENTO, L.; RICARDO, C.P.; OLIVEIRA, M.M. Lack of 
detectable allergenicity of transgenic maize and soybean samples. Journal of 
Allergy and Clinical Immunology, 116:403-410, 2005. 
 
BEAUD, M. História do capitalismo: de 1500 até nossos dias. São Paulo: 
Brasiliense, 1994. 408p. 
 
BIDNEY, D.; SCELONGE, C.; MARTICH, J.; BURRUS, M.; SIMS, L.; HUFFMAN, G. 
Microprojectile bombardment of plant tissues increases transformation frequency by 
Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology, 18:301-313, 1992. 
 
BIRCH, R.G.; FRANKS, T. Development and optimization of microprojectile system 
for plant genetic transformation. Australian Journal of Plant Physiology, 18:453-
469, 1991. 
 
BORÉM, A.; MILACH, S.K. O melhoramento na virada do milênio. Biotecnologia 
Ciência & Desenvolvimento, 7:68-72, 1999. 
 
 
29 
BRASILEIRO, A.C.M.; ARAGÃO, F.J.L.; ROSSI, S.; DUSI, D.M.A.; BARROS, L.M. 
G.; RECH, E. Journal of American Society for Horticultural Science, 121:810-
815, 1996. 
 
BRASILEIRO, A.C.M.; CARNEIRO, V.T.C. Introdução à transformação genética de 
plantas. In: BRASILEIRO, A.C.M. Manual de transformação genética de plantas. 
Brasília: Embrapa SPI/Embrapa-Cenargen, 1998. p. 13-16. 
 
BRASILEIRO, A.C.M.; DUSI, D.M.A. Transformação genética de plantas. In: 
TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultura de tecidos e transformação 
genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI, 1999. p. 679-735. 
BRASILEIRO, A.C.M.; LACORTE, C. Interação Agrobacterium-Hospedeiro. In: 
BRASILEIRO, A.C.M. Manual de transformação genética de plantas. Brasília: 
Embrapa SPI/Embrapa-Cenargen, 1998. p. 75-92. 
 
BRODY, J.R.; KERN, S.E. Sodium boric acid: a Tris-free cooler conductive medium 
for DNA electrophoresis. Biotechniques, 36:214-216, 2004. 
 
CARNEIRO, A.A.; CARNEIRO, N.P.; PAIVA, E. Transformação genética de milho 
utilizando o bombardeamento de partículas. Sete Lagoas: Embrapa Milho e 
Sorgo, 2004. 44p. 
 
CHRISTOU, P. Morphological description of transgenic soybean chimeras created by 
the delivery, integration and expression of foreign DNA using eletric discharge 
particle acceleration. Annals of Botany, 66:379-386, 1990. 
 
CHRISTOU, P.; FORD, T.L. Recovery oh chimeric rice plants from dry seed using 
electric discharge particle acceleration. Annals of Botany, 75:449-454, 1995. 
 
CONAB – Companhia Nacional de Abastecimento. Acompanhamento da safra 
brasileira. Grãos, safra 2010/2011. Décimo levantamento, julho/2011. Disponível 
em: http://www.conab.gov.br/OlalaCMS/uploads/arquivos/11_07_06_08_59_20_ 
boletim_grao_julho_2011..pdf. Acesso em: 08, agosto, 2011. 
 
 
30 
COSTA, M.G.C.; OTONI, W.C.; MOORE, G.A. An evaluation of factors affecting the 
efficiency of Agrobacterium-mediated transformation of Citrus paradise (Macf.) and 
production of transgenic plants containing carotenoid biosynthetic genes. Plant Cell 
Reports, 21:365-373, 2002. 
 
CTNBIO – Comissão Técnica Nacional de Biotecnologia. Aprovações comerciais. 
Disponível em: http://www.ctnbio.gov.br/index.php/content/view/12482.html. Acesso 
em: 31, janeiro, 2012. 
 
DAN, Y. Biological functions of antioxidants in plant transformation. In Vitro Cellular 
& Developmental Biology – Plant, p.149-161, 2008. 
 
DAN, Y.; ARMSTRONG, C.L.; DONG, J.; FENG, X.; FRY, J.E.; KEITHLY, G.E.; 
MARTINELL, B.J.; ROBERTS, G.A.; SMITH, L.A.; TAN, L.J.; DUNCAN, D.R. Lipoic 
acid – a unique plant transformation enhancer. In Vitro Cellular & Developmental 
Biology – Plant, 45:630-638. 2009. 
 
DELZER, B.W.; SOMERS, D.A.; ORF, J.H. Agrobacterium tumefaciens susceptibility 
and plant regeneration of 10 soybean genotypes in maturity groups 00 to II. Crop 
Science, 30:320-322, 1990. 
 
DOMÍNGUEZ, A.; CERVERA, M.; PÉREZ, R.M.; ROMERO, J.; FAGOAGA, C.; 
CUBERO, J.; LÓPEZ, M.M.; JUÁREZ, J.A.; NAVARRO, L.; PEÑA, L. Characteristion 
of regenerants obtained under selective conditions after Agrobacterium-mediated 
transformation of citrus explants reveals production of silenced and chimeric plants at 
unexpected high frequencies. Molecular Breeding, 14:171-183, 2004. 
 
DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant DNA form fresh tissue. Focus, 12:13-15, 
1990. 
 
DROSTE, A.; BODANESE-ZANETTINI, M.H.; MUNDSTOCK, E.; HU, C.Y. 
Susceptibility of Brazilian soybean cultivars to Agrobacterium tumefacians. Brazil 
Journal of Genetics, 17:83-88. 1994. 
 
 
31 
DROSTE, A.; PASQUALI, G.; BODANESE-ZANETTINI, M.H. Integrated 
bombardment and Agrobacterium transformation system: an alternative method for 
soybean transformation. Plant Molecular Biology Reporter, 18:51-59, 2000. 
 
DROSTE, A.; LEITE, P.C.P.; PASQUALI, G.; MUNDSTOCK, E.C.; BODANESE-
ZANETTINI, M.H. Regeneration of soybean via embryogenic suspension culture. 
Scientia Agricola, 58:753-758, 2001. 
 
EMBRAPA. A soja no Brasil. Disponível em: http://www.cnpso.embrapa. 
br/producaosoja/SojanoBrasil.htm. Acesso em: 08, agosto, 2011. 
 
FAIZE, M.; FAIZE, L.; BURGOS, L. Using quantitative reatl-time PCR to detect 
chimeras in transgenic tobacco and apritcot and to monitor their dissociation. 
Biotechnology, 10:53, 2010. 
 
FARAH, S.B. DNA segredos e mistérios. São Paulo: Sarvier, 2007. 538p. 
 
FERREIRA, M.E.; CALDAS, L.S.; PEREIRA, E.A. Aplicações da cultura de tecidos 
no melhoramento genético de plantas. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, 
J.A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa-
SPI, 1998. p. 21-43. 
 
HANDEL, C.L.; WAGNER, C.M.; MILACH, S.C.K.; FEDERIZZI, L.C. Transformação 
genética de cereais via Agrobacterium tumefaciens. Ciência Rural, 27:359-365, 
1997. 
 
HARJEET, K.; RAINA, S.K. Biolistic transformation of elite indica rice (Oryza sativa 
L.) cultivars through semi-solid and liquid medium selection systems. Journal of 
Plant Biochemistry and Biotechnology, 6:75-80, 1997. 
 
HIEI, Y.; OHTA, S.; KOMARI, T.; KUMASHIRO, T. Efficienttransformation of rice 
(Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the 
boundaries of the TDNA. Plant Journal, 6:271–282, 1994. 
 
 
32 
HINCHEE, M.A.W.; CONNOR-WARD, D.V.; NEWELL, C.A.; McDONNELL, R.E.; 
SATO, S.J.; GASSER, C.S.; FISCHHOFF, D.A.; RE, D.B.; FRALEY, R.T.; HORSCH, 
R.B. Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA 
transfer. Nature Biotechnology, 6:915-922, 1988. 
 
ISHIDA, Y.; SAITO, H.; OHTA, S.; HIEI, Y.; KOMARI, T.E.; KUMASHIRO, T. High 
efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium 
tumefaciens. Nature Biotecnology, 14:745-750, 1996. 
 
JEFFERSON, R.A. Assaying chimeric genes in plants: the GUS genes fusion 
system. Plant Molecular Biology Reports, 5:387-405, 1987. 
 
KAEPPLER, H.; AKULA, C.; AKULA, A.; KAEPPLER, S.M.; CHADLER, V.; 
IDORENKO, L.; NAPOLI, C.; JORGENSEN, R. Agrobacterium-mediated 
transformation of maize optimization of parameters for utilization of nonsuperbinary 
vectors. In: PLANTE ANIMAL GENOME CONFERENCE. San Diego, 2001. 
Resumos… San Diego: UNESP, 2001, p. 992. 
 
KANAMORI, N.; GIROTTO, L.; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, K.; NAPOMUCENO, A.L. 
Agrobactereium-mediated transformation of Brazilian variety, BR16. JIRCAS 
Working Report, 71:75-79, 2009. 
 
KITA, Y.; NISHIZAWA, K.; TAKAHASHI, M.; KITAYAMA, M.; ISHIMOTO, M. Genetic 
improvement of the somatic embryogenesis and regeneration in soybean and 
transformation of the improvement breeding lines. Plant Cell Reports, 26:439-447, 
2007. 
 
LACORTE, C.; ARAGÃO, F.J.L.; VAINSTEIN, M.H.; RECH, E.L. Biobalística. In: 
ANDRADE, S.R.M. (ed.). Cultura de tecidos e transformação genética de 
plantas. 1 ed. Brasília: Embrapa-SP, 1999. p. 761-781. 
 
MAY, G.D.; AFZA, H.S.; WIECKO, A.; NOVAK, F.J.; ARNTZEN, C.J. Generation of 
transgenic banana (Musa acuminate) plants via Agrobacterium-mediated 
transformation. Nature Biotechnology, 13:486-492, 1995. 
 
33 
 
McCABE, D.E.; SWAIN, W.F.; MARTINELI, B.J.; CHRISTOU, P. Stable 
transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration. Biotechnology, 
6:23-926, 1988. 
 
MORIKAWA, H.; IIDA, A.; YAMADA, Y. Transient expression of foreign genes in 
plant cells and tissues obtained by simple biolistic deive (particle-gun). Applied 
Microbiology and Biotechnology, 31:320-322, 1989. 
 
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and biossays with 
tobacco issue cultures. Physiologia Plantarum, 15:473- 497, 1962. 
 
NIU, X.; LI, X.; VERONESE, P.; BRESSAN, R.A. WELLER, S.C.; HASEGAWA, P.M. 
Factors affecting Agrobacterium tumefaciens-mediated transformed of peppermint. 
Plant Cell Reports, 19:304-310, 2000. 
 
OWENS, L.D.; CRESS, D.E. Genotypic variability of soybean response to 
Agrobacterium strains harboring the Ti or Ri plasmids. Plant Physiology, 77:87-94, 
1985. 
 
PACKER, L.; WITT, E.; TRITSCHELER, H. Alpha-lipoic as a biological antioxidant. 
Free Radical Biology & Medicine, 19:227-250, 1995. 
 
PARROTT, W.A.; ALL, J.N.; ADANG, M.J.; BAILEY, M.A.; BOERMA, H.R.; 
STEWART, C.N.J. Recovery and evaluation of soybean plants transgenic for a 
Bacillus thuringiensis var. Kurstaki insecticidal gene. In Vitro Cellular and 
Developmental Biology-Plant, 30:144-149, 1994. 
 
PINTO, R.J.B. Introdução ao melhoramento genético de plantas. 2 ed. Maringá: 
Eduem, 2009. 351p. 
 
POETHIG, S. Genetic mosaics and cell lineage analysis in plants. Trends in 
Genetics, 5:273-277, 1989. 
 
 
34 
RAKOSY-TICAN, E.; AURORI, C.M.; DIJKSTRA, C.; THIEME, R.; AURORI, A.; 
DAVEY, M.R. The usefulness of the gfp reporter gene for monitoring Agrobacterium-
mediated transformation of potato dihaploid and tetraploid genotypes. Plant Cell 
Reports, 26:661-671, 2007. 
 
RECH, E.L.; VAINSTEIN, M.H.; DAVEY, M.R. An electrical particle acceleration gun 
por gene transfer into cells. Technique, 3:143-149, 1991. 
 
RECH, E.L.; ARAGÃO, F.J.L. Biobalística. In: BRASILEIRO, A.C.M. Manual de 
transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa SPI/Embrapa-Cenargen, 
1998. p. 51-64. 
 
SANFORD, J.C.; KLEIN, T.M.; WOLF, E.D.; ALLEN, N. Delivery of substances into 
cells tissues using a particle bombardment process. Particulate Science 
Technology, 5:27-37, 1987. 
 
SANFORD, J.C. The biolistic process. A new concept in gene transfer and biological 
delivery. TIBTech, 6:299-302, 1988. 
 
SANFORD, J.C.; VIT, M.J.; RUSSELL, J.A.; SMITH, F.D.; HARPENDING, M.K.; 
ROY, M.K.; JOHNSTON, S.A. An improved helium-driven biolistic device. 
Technique, 3:3-16, 1991. 
 
SANFORD, J.C.; SMITH, F.D.; RUSSEL, J.A. Optimizing the biolistic process for 
diferent biological applications. IN: WU, R. (ed.). Recombinant DNA – Part H. San 
Diego: Academic Press, p. 483-510, 1993. 
 
SCHMÜLLIN, T.; SCHELL, J. Transgenic tobacco plants regenerated from leaf disks 
can be periclinical chimeras. Plant Molecular Biology, 21:705-708, 1993. 
 
TEIXEIRA, O.A.; LAGES, V.N. Do produtivismo à construção da agricultura 
sustentável: duas abordagens pertinentes à questão. Cadernos de Ciência e 
Tecnologia, 13:347-368, 1996. 
 
 
35 
TEXEIRA, L.R.; BRACCINI, A.L.E; CHURATA, B.G.M.; VIEIRA, E.S.N.; MARTINS, 
P.K.; SCHUSTER, I. Evaluation of soybena cultivars on the embryogenic and 
organogenic potential. Acta Scientiarum Agronomy, 33:67-74, 2011. 
 
TRICK, H.N.; FINER, J.J. Sonication-assisted Agrobactérium-mediate transformation 
of soybean [Glycine max (L) Merril] embryogenic suspension culture tissue. Plant 
Cell Report, 17:482-488, 1998. 
 
VEGA, J.M.; YU, W.; KENNON, A.; CHEN, X.; ZHANG, Z.J. Improvement of 
Agrobacterium-mediated transformation in Hi-II maize (Zea mays) using standard 
binary vectors. Plant Cell Reports, 27:297-305, 2008. 
 
WEBB, K.J.; MORRIS, P. Methodologies of plant transformation. In: GATEHOUSE, 
A.M.R.; HILDER, V.A.; BOULTER, D. Plant genetic manipulation for crop 
protection: Wallingford: CAB International, 1992. p. 8-44. 
 
WIEBKE, B. Transformação genética de embriões somáticos de soja [Glycine 
max (l.)Merr.] utilizando o bombardeamento e o sistema Agrobacterium de 
maneira integrada. Porto Alegre: Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2005. 
88p. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular). 
 
ZHANG, Z.; XING, A.; STASWICK, P.; CLEMENTE, T.E. The use of glufosinate as a 
selective agent in Agrobacterium mediated transformation of soybean. Plant Cell, 
Tissue and Organ Culture, 56:37-46, 1999.