monografia 1.5

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UNIVERSIDADE REGIONAL DO CARIRI – URCA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE – CCBS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – DCB
CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MARIA DO SOCORRO COSTA
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO D-LIMONENO PURO E O COMPLEXADO COM β-CICLODEXTRINA E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL MODIFICADOR DA AÇÃO ANTIBIÓTICA CONTRA BACTÉRIAS PADRÕES E MULTIRRESISTENTES
Crato- CE
2017
MARIA DO SOCORRO COSTA
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO D-LIMONENO PURO E O COMPLEXADO COM β-CICLODEXTRINA E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL MODIFICADOR DA AÇÃO ANTIBIÓTICA CONTRA BACTÉRIAS PADRÕES E MULTIRRESISTENTES
 Monografia apresentada ao curso de Ciências Biológicas do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Regional do Cariri – URCA, como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.
Orientador: Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho
Coorientadora: Janaína Esmeraldo Rocha
Crato- CE
2017
MARIA DO SOCORRO COSTA
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO D-LIMONENO PURO E O COMPLEXADO COM β-CICLODEXTRINA E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL MODIFICADOR DA AÇÃO ANTIBIÓTICA CONTRA BACTÉRIAS PADRÕES E MULTIRRESISTENTES
Monografia apresentada ao curso de Ciências Biológicas do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Regional do Cariri – URCA, como requisito parcial à obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.
Aprovada em: _____/_____/__________
BANCA EXAMINADORA:
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Prof. Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho – URCA
(Orientador)
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BSc. Janaína Esmeraldo Rocha
(Coorientadora)
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MSc. Thiago Samapaio de Freitas
(Avaliador Interno)
______________________________________________
Esp. Camila Fonseca Bezerra
(Avaliador Interno)
Dedico este trabalho aos meus pais e ao meu noivo, por ser fonte de inspiração e força para alcançar meus objetivos e por tudo que vocês representam em minha vida.
AGRADECIMENTOS
Á Deus pelo o dom da vida e por me manter de cabeça erguida para continuar. (“tu és meu refúgio e minha fortaleza”).
Aos meus pais Maria Honorina Costa e Afonso Costa do Nascimento pelo apoio e incentivo na construção de minha formação, Obrigado pelo todo amor e confiança!
Ao meu noivo Júlio Cesar do Nascimento pela paciência, confiança, companheirismo, incentivo, amizade e por sempre acreditar na minha capacidade.
A minha família em especial aos meus irmãos: Vanilda (madrinha), Iraneide, Vanzinha, Ilda, Ivone, Maria do Carmo, Ana Maria, Cícero, José Weliton, Francisco (padim), Júnior e Raniele e aos meus sobrinhos: Inara Raiane, Sylmmara, Ana Coralina, Dávila Carolina, Yasmin, Inara Regina, Ana Evenny, Ana Cristinna, Laisa, Jefersson, Anderson, Gean Carlos, Matheus, Yuri Ray, Inácio, José Artur, Davi, Andrei Samuel, Saulo Gabriel e Lucas por toda inspiração e força para continuar (“presentes que Deus me deu, amo vocês”).
Ao meu orientador Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho pela oportunidade de fazer parte da sua equipe de trabalho, pelos ensinamentos, atenção, confiança e incentivo durante esses anos.
A minha coorientadora Janaína Esmeraldo Rocha pelas suas contribuições para a realização deste trabalho, pela amizade, apoio e incentivo!
Aos meus amigos e colegas do Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular à Ana Raquel, Camila Fonseca, Maria Flaviana, Thassya Lucas, Jaqueline, Rafael, Raimundo, Joara, Elba, Yedda, Carolaine, Maciel, Débora, Judson Targino, Audilene Freitas, Saulo Relison, Datiane (da qual considero integrante desta família) por proporcionarem um ambiente prazeroso e familiar e em especial a minha amiga Fábia (minha brother) pela amizade e confiança e ao Thiago Sampaio de Freitas que suas importantes contribuições durante a realização deste trabalho.
Aos meus amigos e colegas de curso de graduação e em especial aos meus amigos Kássia Cristianne, Maciana Alves, Talina Guedes, Gabriel Jefter, Dánubio Lopes e Jennyfer e aos demais colegas de curso, Aline, Elizagêla, Joice, Maraiza, Yasminny, Inty, Dayanne, Sara, Luzia Sáua, Franciel, Igor, Leonardo, Matheus, Luciano, Fábio, Cassiano e Tarrones pela convivência e companheirismo durante estes cinco anos de convivência.
As minhas amigas Sara, Wégila, Franciele, Adriana e Anália que tiveram importância fundamental na minha vida me mostrando o verdadeiro significado da amizade, a vocês deixo esta frase “Amizade cresce no tempo, vive na distância e permanece na eternidade”!
A Universidade Regional do Cariri e aos professores do curso de biologia por me proporcionar aprendizado sobre o estudo da vida.
Ao CNPQ e a URCA pelo auxilio financeiro para o desenvolvimento da pesquisa.
A todos meu muito obrigada!
“A persistência é o menor caminho do êxito”.
 (Charles Chaplin)
RESUMO
Com o aumento da resistência bacteriana aos antibióticos, inúmeras pesquisas têm sido destinadas a procurar novos agentes com atividade antibacteriana, dentre eles os produtos naturais. Estes produtos podem apresentar atividade antibacteriana, como o d-limoneno descrito na literatura. O objetivo desde estudo foi avaliar a atividade antibacteriana d-limoneno, tanto na sua forma simples quanto complexado com a β-ciclodextrina e avaliar sua interação com diferentes classes de antibióticos. A atividade antibacteriana foi determinada pelo método de microdiluição em caldo, obtendo-se desta forma o valor da Concentração Inibitória Miníma (CIM), e a partir do valor da concentração subinibitória (CIM/8) foi determinado à atividade modificadora da ação dos antibióticos. O d-limoneno apresentou uma CIM de 256 µg/mL para S. aureus padrão e de 512 µg/mL para P. aeruginosa resistente. Na atividade modificadora da ação antibiótica em associação com a gentamicina o d-limoneno isolado apresentou sinergismo frente à bactéria S. aureus com a redução de 13,7 µg/mL para 4 µg/mL e frente a E. coli com a redução de 30 µg/mL para 20 µg/mL . Desta forma o d-limoneno demostrou atividade antibacteriana clinicamente relevante, tanto para uma bactéria Gram positiva quanto para uma Gram negativa e efeito sinérgico quando associado à gentamicina. Esses resultados mostram-se promissores no combate à resistência bacteriana, no entanto novos estudos são necessários para uma melhor elucidação do seu mecanismo de ação. 
Palavra-chave: resistência bacteriana, sinergismos, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.
Abstract
With the increase of bacterial resistance to antibiotics, countless researches have been aimed at finding new agents with antibacterial activity, among them the natural products. These products may have antibacterial activity, such as d-limonene described in the literature. The objective of this study was to evaluate the antibacterial activity of d-limonene, both in its simple form and complexed with β-cyclodextrin, and to evaluate its interaction with different classes of antibiotics. The antibacterial activity was determined by the microdilution method in broth, obtaining in this way the value of the Concentration Inhibitory Minimal (CIM), and from the value of the sub-inhibitory concentration (MIC/8) was determined to the activity modifying the action of the antibiotics. D-limonene had a MIC of 256 μg / mL for standard S. aureus and 512 μg / mL for resistant P. aeruginosa. In the activity modifying the antibiotic action in association with gentamicin, d-limonene alone showed synergism with S. aureus bacteria, with a reduction of 13.7 μg/mL to 4 μg/mL and against E. coli with a reduction of 30 μg/mL to 20 μg/mL. In this way, d-limonene demonstrated clinically relevant antibacterial activity, both for Gram positive bacteria andGram negative and synergistic effect when associated with gentamicin. These results are promising in the fight against bacterial resistance, however, new studies are needed to better elucidate its mechanism of action.
Key words: bacterial resistance, synergisms, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.
LISTA DE ILUSTRAÇÃO
Figura 1: Vias biossintéticas dos terpenos.
Quadro 1. Origem bacteriana e perfil de sensibilidade aos antibióticos
Tabela 1. Concentração Inibitória Mínima (μg/mL)
Figura 2: Estrutura química do d-limoneno
Figura 3: Estrutura tridimensional das Ciclodextrinas.
Figura 4: Preparação dos Inóculos
Figura 5: Preparação do Eppendorf® para as placas de microdiluição.
Figura 6: Placa de microdiluição com a presença de óxido-redução da resazurina.
Figura 7: Modulação bacteriana com o antibiótico Gentamicina
Figura 8: Modulação bacteriana com o antibiótico Norfloxacino
Figura 9: Modulação bacteriana com o antibiótico Imipeném
LISTA ABREVIATURAS E SIGLAS
ATCC - American Type Culture Collection
BHI - Brain Heart Infusion 
CDs - ciclodextrinas
CIM - Concentração Inibitória Mínima
DMADP- difosfato de dimetilalilo 
DMSO - dimetilsulfóxido
E.C - Escherichia coli
HIA - Heart Infusion Agar 
IDP - difosfato de isopentenilo 
LFQM - Laboratório de Farmacologia e Química Molecular 
LMBM- Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular
MDR - bactéria multirresistente
MEP - via do metileritritol fosfato 
MVA - via do ácido mevalônico 
P.A - Pseudomonas aeruginosa
S.A - Staphylococcus aureus
UFS - Universidade Federal de Sergipe 
URCA - Universidade Regional do Cariri 
α-CD - α-ciclodextrina 
β-CD - β-ciclodextrina 
γ-CD - γ- ciclodextrina 
LISTA DE SÍMBOLOS
% - porcetagem
< - menor que
> - maior que
≥ - maior ou igual que
® - marca registrada 
C - carbono
ºC - graus celsius
mL- mililitro
UFC/mL - unidade formadora de colônias por mililitros
μg – microgramas 
μg/mL - microgramas de soluto por mililitro de solvente
μL- microlitro
INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
A resistência aos antibióticos tem aumentando consideravelmente nos últimos anos, e o seu mau uso favoreceu a seleção de bactérias multirresistentes (MDR), consequentemente dificultando a ação do tratamento e aumento do seu custo (COUTINHO et al., 2015a). 
 	Inúmeras pesquisas científicas têm-se destinado a procura por novos agentes com potencial antibacteriano. Produtos naturais, principalmente de origem vegetal são investigados na tentativa de descobrir propriedades farmacológicas a fim de combater microrganismos patogênicos (MATIAS et al., 2012). 
Os óleos essenciais de plantas medicinais possuem em sua composição um conjunto de compostos químicos, principalmente dos terpenos, estes compostos podem agir individual, aditiva ou sinergicamente para melhorar a eficácia terapêutica de outras drogas, servindo assim de moléculas protótipos para estudos farmacológicos (COUTINHO et al., 2015b).
Compostos isolados a partir de produtos naturais podem apresentar atividade antibacteriana ou melhorar a eficácia dos antibióticos, aumentando o seu mecanismo de ação e dificultando a adaptação dos microorganismos (TEIXEIRA, 2009). Sendo seu estudo importante para compreender o seu mecanismo de ação farmacológica e toxicidade, incluindo efeitos clínicos benéficos para a saúde humana, assim também como fornece informações para confirmação do seu efeito terapêutico (ALMEIDA et al., 2011).
O d-limoneno é um monoterpeno encontrado na maioria dos óleos essenciais de espécies aromáticas, sendo bastante citado na literatura quanto às suas bioatividades, dentre elas atividade antimicrobiana (SCHUCK et al., 2001; VIEGAS-JUNIOR , 2003; FALCÃO e MENEZES, 2003; PASSOS et al., 2009; DUARTE et al., 2005;). Também tem sido utilizado na fabricação de vários produtos, como cosméticos, aromatizantes, entre outros (FERRARINI et al., 2008).
As ciclodextrinas (CDS) são oligossacarídeos com estrutura de cone truncado sintetizados a partir da degradação do amido da enzima glicosiltransferase. Possui uma estrutura tridimensional com uma cavidade hidrofóbica central e uma superfície exterior hidrofílica. Esta conformidade permite encapsular substratos para formar complexo de inclusão (JUNIOR et al., 2015; XIE et al., 2015). 
A inclusão de substâncias com CDs tem sido bastante estudada para melhorar a segurança e eficácia de produtos, uma vez que pode aumentar a solubilidade, permeabilidade e estabilidade química de diversos compostos como óleos essencias, medicamentos e produtos voláteis (JUNIOR et al., 2015). A β-CD é mais utilizada em indústria farmacêutica, por ser de fácil acesso e baixo custo, além de possuir capacidade de interagir com a maioria das moléculas do interesse farmacêutico (FREITAS, 2017; SILVA, 2015).
Diante do exposto, este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antibacteriana do composto d-limoneno, tanto em sua forma simples quanto complexada com a β-CD e avaliar a atividade moduladora com diferentes classes de antibióticos.
REVISÃO DE LITERATURA
REVISÃO DE LITERATURA
TERPENOS
A eficácia atribuída às plantas para usos terapêuticos depende dos constituintes químicos presentes em sua composição. Os metabólitos secundários como os terpenos formam uma variedade de substâncias na natureza (SOUZA et al., 2015; SIMÕES et al., 2017). 
 Os terpenos são encontrados em aproximadamente cerca de 90% dos óleos essenciais das plantas em seus diversos órgãos, como raízes, caules, flores, folhas e sementes, bem como na casca e entrecasca de caules. Apesar de serem moléculas estruturalmente simples, várias atividades farmacológicas têm sido atribuídas a eles (SOUZA et al., 2015; GUIMARÃES et al., 2014).
São moléculas de tamanho relativamente pequeno, e apresentam em sua constituição seguimentos de unidades isoprênicas com átomos de carbono geralmente múltiplos de cinco ligados entre si (PASSOS et al., 2009; SOUZA et al., 2015). 
O termo terpeno tem sido atribuído para designar todas às substâncias que tem em comum à síntese da unidade do difosfato de isopentenilo (IDP) e seu isômero difosfato de dimetilalilo (DMADP), esta por sua vez podem ser formada a partir de duas rotas biossintéticas: a da via do ácido mevalônico (MVA) e a via do metileritritol fosfato (MEP), a adição de unidades sequenciais de IDP e do seu isômero produzem vários compostos que variam na quantidade de carbono (C), como exemplos: Monoterpenos (C10), Sesquiterpenos (C15), Triterpenos (C30), Diterpenos (C20) e Tetraterpenos (C40) (FREITAS, 2017; SIMÕES et al., 2017). Conforme esquema apresentado na Figura 1. 
Figura 1- Vias biossintéticas dos terpenos
Fonte: FREITAS, 2017.
Monoterpenos 
Representante de uma classe de metabólitos secundários, os monoterpenos são os constituintes de óleos essenciais presentes em espécies de plantas aromáticas (SOUZA et al., 2015) Cuja substância de origem biosintética deriva de duas unidade do isopreno e apresenta dez átomos de carbono (PASSOS et al., 2009).
São encontrados amplamente distribuídos nos tecidos de plantas superiores, tais como em glândulas sebáceas, sendo os principais componentes dos óleos essenciais. Possuem aroma forte e várias atividades biológicas têm sido relatadas, (FENG et al., 2014). 
 Atualmente são encontrados mais de 1.000 monoterpenos naturais e alguns têm sido empregadas nas indústrias de perfumes, fragrâncias, culinária, indústria de alimentos, indústrias farmacêuticas, condimentos, entre outras (VIEIRA et al., 2013). 
Quanto as suas atividades farmacológicas têm apresentando potencial para o tratamento de diversas inflamações e assim também como efeitos analgésicos, antimicrobianos e anti-inflamatórios (GUIMARÃES et al., 2014).
Por vários anos as indústrias tem dado grande interesse​​nas transformações catalíticas dos terpenos aos produtos químicos mais valiosos. Estes têm ocorridos por meio de destilação ou extração através de reações de hidroformilação, entre os monoterpenos utilizados encontra-se o limoneno (VIEIRA et al., 2013).
 
D-limoneno
O limoneno é o monoterpeno monocíclico mais abundante encontrado na natureza, está presente principalmente nos óleos essenciais do gênero Citrus, são conhecidos por possuir baixa toxicidade aos seres humanos e por apresentar ação inibitória contra bactérias, tanto Gram-positivas quanto Gram-negativas (JING et al., 2013; FERRARINI et al., 2008; DUETZ et al., 2003; FISHER & PHILLIPS, 2008).
Encontrado na natureza em várias formas enantiômeras, o d-limoneno 4-isoprenil-1-metil-ciclo-hexeno, conforme estrutura química na figura 2, tem despertado grande interesse nas indústrias por ser uma fonte de fácil acesso e baixo custo, onde quantidades expressivas podem ser obtidas através de resíduos de indústrias de sucos Citrus ou sintetizadas através de alguns microorganismos (JING et al., 2013; BADEE, HELMY, MORSY, 2011; ARRIETA et al., 2013; AYOOLA et al., 2008). 
Figura 2- Estrutura química do d-limoneno
Fonte: Autoria própria
O limoneno tem sido encontrado em concentrações que variam de 32% a até 98% do total de sua composição química de espécies do gênero Citrus, como na laranja doce contendo 68-98%, limão 45-76% e bergamota 32-45% (FISHER & PHILLIPS, 2008; MOUFIDA & MARZOUK, 2003; WANG et al., 2012). 
Vários estudos têm demostrado diversas atividade farmacológicas para o limoneno, assim também como nos seus derivados, tais como: atividade antimicrobiana das aminas de limoneno, óxido do limoneno, e nos óleos essenciais que possuem o limoneno em sua composição contra vários tipos de microorganismos patógenos (FERRARINI et al., 2008; DUARTE et al., 2005; OBIDI et al., 2013; DORMAN & DEANS, 2000). Assim também por apresentar atividade acaricida, inseticida e carrapaticida (VIEGAS JUNIOR, 2003; KURDELAS et al., 2012; FERRARINI et al., 2008). Este composto também tem sido utilizado em indústrias como componente na fabricação de produtos tais como agentes de limpeza, cosméticos e produtos alimentares (FERRARINI et al., 2008). 
Outras atividades também vêm sendo atribuídas a ele, como auxiliar na digestão e desintoxicação do sistema, por facilitar a constipação, aliviar a retenção de água, promover a circulação, aumentar absorção de vitamina C, ajudar o sistema imunológico no combate de gripes e resfriados, fortalecer e rejuvenescer a pele (OBIDI et al., 2013).
O estudo de cada composto químico indivídual é importante para compreender o seu mecanismo de ação farmacológica e toxicidade, que inclui os efeitos clínicos benéficos para a saúde humana, assim também como fornecer informações para confirmação do efeito terapêutico (ALMEIDA et al., 2011).
CICLODEXTRINA
Estrutura 
As ciclodextrinas são oligossacarídeos de cone truncado sintetizados a partir da degradação do amido da enzima glicosiltransferase sintetizada por alguns microrganismos como, por exemplo, Baccillus macerans (JUNIOR et al., 2015; XIE et al., 2015). 
Atualmente são conhecidos três tipos de ciclodextrina (CD) naturais: α-ciclodextrina (α-CD), β-ciclodextrina (β-CD), γ- ciclodextrina (γ-CD), consistindo respectivamente em seis, sete ou oito moléculas de glucose. Tem sido utilizada para dar melhoramento em aplicações farmacêuticas, química, alimentícia, agricultura, higiênica, ambiental, dentre outras (JUNIOR et al., 2015).
Sendo o seu principal foco de estudo a sua capacidade de formar complexos de inclusão em associação com outros compostos. Dessa forma, podendo agir melhorando a estabilidade química das substâncias, aumentar a resistência à hidrólise, oxidação, calor, luz, metal, sais entre outros, podendo até diminuir ou eliminar sabores e odores desagradáveis (VALLE, 2004; MORAES et al., 2007).
 As CDs possuem estrutura tridimensional, uma cavidade hidrofóbica central e uma superfície exterior hidrófila, esta conformidade permite encapsular substratos para formar complexo de inclusão (XIE et al., 2015). A borda mais estreita da estrutura cônica é formada por grupos de hidroxilas primários e a borda mais larga é formada por grupos de hidroxilas secundários, esta conformação é formada por uma cavidade central lipofílica e uma superfície exterior hidrofílica, permitindo um encaixe ligação de moléculas hidrofóbicas (convidado) no seu interior, formando uma molécula de complexação molecular (FREITAS, 2017). A estrutura tridimensional das CDs está esquematizada na Figura 3.
Figura 3- Estrutura tridimensional das Ciclodextrinas
Fonte: GUEDES et al. (2008).
 Formação do Complexo
A conformação da ciclodextrinas é essencial para formação do complexo de inclusão, com o encaixe de moléculas lipofílicas na sua cavidade central hidrofóbica, este processo não ocorre através de ligações covalentes, mas por forças intermoleculares (CHIERENTIN, 2013). 
A inclusão de substâncias com CDs tem sido bastante estudada para melhorar a segurança e eficácia de produtos, uma vez que pode aumentar a solubilidade, permeabilidade e estabilidade química de diversos compostos como óleos essencias, medicamentos e produtos voláteis (GUEDES et al., 2008; JUNIOR et al., 2015). 
A complexação ocorre no nível supramolecular através da substituição de moléculas de água presentes no interior da CD pelo o da molécula hóspede (MANAKKER et al., 2009).
Para que ocorra a complexação é importante haver um ajuste tridimensional entre a CD e a molécula hóspede, assim como o equilíbrio entre as forças que atuam na formação do complexo (MENEZES, 2015). As principais forças intermoleculares são as interações hidrofóbicas (GUEDES et al., 2008), modificações na superfície do solvente (MANAKKER et al., 2009), pontes de hidrogênio, interação de Vander Waals e interação de transferência de carga (GUERRERO, 2006; MENEZES, 2015).
A β-CD é mais utilizada em indústria farmacêutica, por ser de fácil acesso e baixo custo, além de possuir capacidade de interagir com a maioria das moléculas do interesse farmacêutico (FREITAS, 2017; SILVA, 2015).
BACTÉRIAS 
Escherichia coli
 Escherichia coli é uma bactéria Gram-negativa mais conhecida pela comunidade científica, utilizada em vários modelos bioquímico e genético (TENAILLON et al., 2010). O gênero Escherichia envolve cinco espécies, ambas pertencentes à família Enterobacteriaceae (MURRAY et al., 2011).
As E. coli são bactérias que fazem parte da microbiota do intestino de animais de sangue quente, vivendo como comensais auxiliando na digestão de alimentos (DENG et al., 2014). Apesar de serem integrantes da microbiota intestinal, cepas virulentas podem causar infecções responsáveis por cerca de um milhão de mortes humanas ao ano (LESCAT et al., 2016; TOURRET et al., 2016; TENAILLON et al., 2010). 
Uma das infecções que mais acomete o sistema urinário é causada por cepas resistentes de E. coli, sendo estas bactéria responsáveis por mais de 50-90% das infecções (TOURRET et al., 2016; FOXMAN, 2010). Diarreias causadas por E. coli estão também entre os casos de maior importância clínicos, acometendo tanto crianças como adultos, sendo facilmente transmitida por água e alimentos contaminados por tolerar uma diversidade de condições ambientais (CESTARI et al., 2016).
Staphylococcus aureus
Bactérias pertencentes ao gênero Staphylococcus são bactérias que apresenta células em formato de cocos Gram positivos, crescendo em formato que se assemelham a cachos de uva, são anaeróbios facultativo crescendo tanto na presença quanto como na ausência de oxigênio (MURRAY et al., 2011).
Os Staphylococcus apresentam grande importância clinica, pois são capazes de causar infecções que comprometem a vida do hospedeiro, podendo afetar os tecidos moles, ossos, pele, trato urinário, bem como infecções sistêmicas e oportunistas. Sendo um dos principais patógenos encontrados em infecções hospitalares. As doenças podem ser causadas pela produção de toxinas,invasão direta ou destruição dos tecidos (MURRAY et al., 2011; NAVARRO et al., 2011; NAVES, TRINDADE, GONTIJO –FILHO; 2012).
Vários mecanismos explicam a sua capacidade de provocar enfermidades, dentre elas, a presença de cápsula celular, camada de peptideoglicano espessa, ácidos teicoicos, síntese de enzimas e toxinas extracelulares (COUTINHO et al., 2010; NOSTRO et al., 2004).
Pseudomonas aeruginosa 
Os membros pertencentes aos gêneros Pseudomonas tem uma ampla diversidade ambiental, podendo ser encontrados em diversos habitats como na matéria orgânica em decomposição, no solo, na água, nos vegetais e em ambiente hospitalar. Nos humanos são encontrados comumente na pele, orofaringe, mucosa nasal, períneos e mais frequentemente no trato gastrointestinal (MANDELL et al., 2010; MURRAY et al., 2011). 
Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa, capaz de se adaptar em diversos tipos de ambientes, desde os mais favoráveis aos mais pobres em termos nutricionais (VAZ et al., 2016). São aeróbicos, ou seja, precisam do oxigênio para sua sobrevivência, apresenta motilidade e não é capaz de fermentar a glicose, tem como uma de suas principais características a capacidade de produzir pigmento azul-esverdeado (MURRAY et al., 2011).
É um microorganismo que possui uma exigência alimentar bastante simples e tolera uma ampla variedade de temperatura, desde 4°C á 42°C, sendo, portanto considerado um patógeno muito comum devido a sua capacidade de crescer em vários habitats, e por possuir vários fatores de virulência e resistência aos antibióticos. No entanto as principais infecções causadas por estes microorganismo são consideradas oportunistas, principalmente em infecções pulmonares e em pacientes imunocomprometidos (MURRAY et al., 2011; HALL et al., 2017).
As mudanças ambientais relacionadas com o uso de antimicrobianos favoreceram o desenvolvimento de cepas patogênicas e o mecanismo de resistência causada por infecções de P. aeruginosa difíceis de serem combatidas (STOVER et al., 2000).
RESISTÊNCIA BACTERIANA
Um dos grandes avanços da medicina moderna foi à descoberta dos antibióticos. Que teve início no século XX, porém o desenvolvimento da resistência adquirida aos antimicrobianos surgiu rapidamente e hoje é um processo de preocupação crescente (TOTORA, 2012).
A resistência aos antibióticos é um processo natural, mas que vem sendo acelerado nos últimos anos devido à má utilização dos antimicrobianos, dificultando o tratamento e consequentemente aumentando a morbidade e a mortalidade nas populações (COUTINHO et al., 2015b).
As bactérias podem desenvolver vários mecanismos que causam resistências às drogas, dentre eles, mutação na permeabilidade da membrana, produção de enzimas que inativam a ação dos antibióticos, como também alteração na estrutura molecular do mesmo, alvos modificadores da enzima DNA-girase, bombas de efluxo, dentre outros (TOTORA, 2012).
ANTIBIÓTICOS
Antibiótico é uma substância produzida a partir de microorganismos, que em pequenas concentrações conseguem inibir o crescimento de outros (TORTORA, 2012). Neste trabalho foram utilizados os antibióticos pertencentes à classe dos aminoglicosídeos, fluoroquinolonas e carbepenêmicos.
Gentamicina
Os aminoglicosídeos foram descobertos em 1940, recebem esse nome por ser formado de dois ou mais aminoaçúcares ligados por ligações glicosídicas, desde então este tem sido bastante utilizado na terapia antibacteriano. A gentamicina é pertencente a esta classe de antibióticos, e tem sido um poderoso agente antibacteriano contra principalmente bactérias Gram-negativa desde a sua descoberta em 1963 (OLIVEIRA, CIPULLO, BURDMANN, 2006).
 A gentamicina tem sido eficaz no tratamento de bactérias Gram-negativa incluindo espécies pertencentes aos gêneros Pseudomonas. Seu mecanismo de ação é na síntese protéica, alterando a porção 30S e 70S dos ribossomos, levando assim a leitura incorreta do código genético para o mRNA (TORTORA, 2012). 
Entretanto devem-se ter cuidados quanto a sua utilização, uma vez que os aminoglicosídeos podem causar grandes efeitos colaterais, como toxicidade e nefrotoxicidade. (SOUZA et al., 2008).
Norfloxacino
A norfloxacino pertence à classe dos antibióticos da primeira geração das fluoroquinolonas, estes apresentam um amplo espectro de ação. São utilizadas principalmente contra infecção urinária causada por bactérias Gram-negativa (GOYAL et al., 2012).
A norfloxacino é amplamente utilizada contra infecções tantos de bactérias Gram-positivas como de Gram- negativas, como Neisseria gonorrhoeae, P. aeruginosa resistente à gentamicina, Haemophilus influenzae e S. aureus resistente à meticilina (CÓRDOBA-BORREGO et al., 1999; RAO & NAGARAJU, 2004; LIM, PARK, YUN, 2002). 
São utilizadas principalmente no tratamento de infecções urinárias, respiratórias e gastrointestinais (RAO, NAGARAJU, 2004). Os antibióticos pertencentes aos fluoroquinolonas possuem baixa toxicidade, porém a resistência pode surgir rapidamente, mesmo durante o tratamento (TORTORA, 2012).
Imipeném
O imipeném pertence à classe dos antibióticos carbepenêmicos compostos também pertencentes à classe dos betalactâmico, tendo com mecanismos de ação inibir a parede celular tanto de bacilos Gram-negativos quanto de cocos Gram- positivos (COUTINHO et al., 2015b; TORTORA, 2012). 
O imipeném esta entre os antibióticos mais eficazes e prescritos para pacientes principalmente contra microorganismos Gram- negativo por apresentar baixos riscos neurológicos (TEIXEIRA, 2015).
A resistência desenvolvida pelas as bactérias Gram- negativa as carbapenens geralmente ocorre devido às modificações ou desativação dos antibióticos, diminuindo assim a permealidade, modificação do local do alvo ou através de bombas de efluxo, contudo, a resistência a esses antibióticos geralmente ocorre com a combinação de dois ou mais mecanismos de resistência (TEIXEIRA, 2015).
MATERIAL E MÉTODOS 
MATERIAL E MÉTODOS 
COMPOSTOS UTILIZADOS
O composto d- limoneno foi cedido pelo Laboratório de Farmacologia e Química Molecular (LFQM) da Universidade Regional do Cariri – URCA. A β-ciclodextrina foi adquirida junto à empresa Sigma-Aldrich® (EUA) e o complexo do d- limoneno/β-ciclodextrina foi preparado no Laboratório de Farmácia da Universidade Federal de Sergipe-UFS.
MEIOS DE CULTURA
Os meios de culturas utilizados foram os seguintes: Heart Infusion Agar - HIA (Difco Laboratories ltda.) que foi preparado segundo a especificação do fabricante e o meio de cultura em caldo Brain Heart Infusion Broth – BHI (Acumedia Manufacturers Inc.) que foi preparado na concentração de 10%. As cepas bacterianas estavam mantidas sobre refrigeração a 4 ºC e antes dos testes foram previamente cultivadas em HIA, incubadas em estufa bacteriológica na temperatura a 37 ºC por um período de 24 horas antes do início dos experimentos dos experimentos. 
DROGAS E REAGENTES 
Os antibióticos utilizados no teste foram os seguintes: gentamicina, norfloxacino e imipeném (Sigma Co., St. Louis, USA). Os antibióticos foram dissolvidos em água destilada e estéril na concentração de 1.024 μg/mL. Quanto aos compostos utilizados eles foram pesados 10 mg que foram posteriormente dissolvidas em 1 mL de dimetilsulfóxido-DMSO e em água destilada e estéril até concentração de 1.024 μg/mL.
Para leitura dos testes foi utilizado o reagente resazurina sódica (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO) como um indicador colorimétrico do crescimento bacteriano por óxido-redução (SALES et al., 2014; SALVAT et al., 2001).
CEPAS MICROBIANAS
Os microorganismos utilizados nos testes foram obtidos através do Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular (LMBM) da Universidade Regional do Cariri (URCA). Foram utilizadas as seguintes linhagens padrões: Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027; e as linhagens multirresistentes: Escherichia coli 06, Staphylococcus aureus 10, Pseudomonas aeruginosa 24. O perfil de resistência dasbactérias multirresistente e sua origem esta descrita no quadro 1.
Quadro 1- Origem bacteriana e perfil de sensibilidade aos antibióticos
	Bactérias
	Origem
	Perfil de Sensibilidade 
	
Staphylococcus aureus-10
	
Swab retal
	Sensível:
Tec 
Resistente:
Amc, Amox, Amp, Asb, Azi, Ca, Cef, Cfo, Cip, Cla,Clin, Eri, Lev, Mox, Oxa, Pen
	
Pseudomonas aeruginosa-24
	
Secreção nasal
	Sensível:
Pol
Resistente:
Ami, Cip, Cpm, Ctz, Imi, Lev, Mer, Ptz,
	
Escherichia coli-06
	
Cultura de Urina
	Sensível
Ami, Cip, Etp, Imi, Lev, Mer, Nit,
Resistente
Asb, Ca, Cef, Cfo, Cmp, Cro,
Legenda: Amc- Amoxicilina + Ac. Clavulâmico, Ami- Amicacina, Amox– Amoxicilina, Amp – Ampicilina, Asb - Ampicilina + Sulbactam, Azi – Azitromicina, Ca - Cefadroxil; Cef – Cefalexina, Cfo- Cefoxitina, Cip – Ciprofloxacino, Cip-Ciprofloxacina, Cla – Claritromicina, Clin – Clindamicina, Cmp- Cefepime, Cpm- Cfepime, cro-Ceftriaxona, Ctz- Ceftazidime, Eri – Eritromicina, Etp- Ertapenem, Imi- imipeném, Lev- Levofloxacina, Mer- Meropenem, Mox – Moxifloxacino, Nit-Nitrofurantoina, Oxa – Oxacilina, Pen – Penicilina, Pol- Polomixina B, Ptz-Piperacilina, Tec- Teicoplanina
Fonte: SANTOS, 2011 (Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal de Paraíba-UFPB).
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA- CIM
A determinação da Concentração Inibitória Mínima- CIM foi realizada pelo método de microdiluição em caldo adaptado de Javadpour et al. (1996). Para os procedimentos foram preparados inóculos a partir das culturas do crescimento de 24 horas. Uma alçada das cepas foram suspensas em solução salina a 0,9% e comparada com a turvação da escala 0,5 de McFarland (1 x 105 UFC/mL), conforme o esquema mostrado na figura 4. 
Figura 4- Preparação dos Inóculos
Fonte: Freitas, 2017.
Foram preparados tubos de eppendorfs® com volume de 1,5 mL da solução, 10% foi correspondente ao inóculo bacteriano 105 unidades formadoras de colônia-UFC e o restante da solução foi completado com meio de cultura BHI (1350 μL). Posteriormente 100 μL desta solução foram adicionados em placa de microdiluição de 96 poços. Logo após foi feita a microdiluição seriada das substâncias de 1:1 até a penúltima cavidade, sendo o último poço utilizado para o controle do crescimento microbiano. As concentração variaram de 512 a 0,5 μg/mL. Em seguida as placas foram levadas à estufa de crescimento microbiano por 24 horas a 37 ºC. A preparação dos eppendorfs® está ilustrada na Figura 5. 
Figura 5- Preparação do Eppendorf® para as placas de microdiluição
Fonte: Freitas, 2017.
Para a leitura da CIM foi utilizado 20 μL da solução de resazurina e observado através da mudança de coloração a reação da óxido-redução em temperatura ambiente num período de 2 horas. A mudança de coloração do azul para rosa é evidenciada como crescimento bacteriano, conforme ilustração da figura 6 (SALES et al., 2014; SALVAT et al., 2001). Os procedimentos foram realizados em triplicata e a CIM foi obtido através de uma média geométrica.
Figura 6- Placa de microdiluição com a presença de óxido-redução da resazurina
Crescimento bacteriano
Inibição de crescimento bacteriano
Fonte: autoria própria
EFEITO MODULADOR DOS COMPOSTOS NA ATIVIDADE DE ANTIBIÓTICOS DE USO CLÍNICO
Para examinar se os compostos modificaria a ação dos antibióticos frente às bactérias multirresistente, foi utilizado o método proposto por Coutinho et al. (2008a). Os compostos utilizados foram avaliados em concentração sub-inibitória mínima (CIM/8) para que não houvesse a inibição do crescimento por ação direta. 
Para os procedimentos, foram preparados tubos de eppendorf® com o volume de 1.500 μL da solução (10 % foram correspondente ao inóculo bacteriano (150 μL), o volume correspondente a concentração sub-inibitória mínina (CIM/8) dos compostos utilizados e o meio de cultura BHI). Para o controle da modulação foram utilizados tubos eppendorf® com 1.350 μL de BHI e 150 μL de suspensão bacteriana. Logo em seguida, foram preenchidas as placas de microdiluição com 100 μL da solução. Posteriormente foram feita microdiluição com 100 μL dos antibióticos numa proporção de 1:1 até a penúltima cavidade, o último poço foi utilizado para o controle do crescimento microbiano. Todos os procedimentos foram realizados em triplicata e a leitura realizada através da resazurina.
ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS 
Os resultados foram obtidos em triplicata e a análise estatística foi realizada através do teste duas vias ANOVA, tendo como dados centras as média geométricas e o desvio Padrão da média, em seguida o teste de Bonferroni post hoc (onde p < 0,05 e p <0,0001 são considerados significativos e p > 0,05 não significativos). Foi utilizado software GraphPad Prisma 5.0
RESULTADOS E DISCUSSÃO
RESULTADOS E DISCUSSÃO
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
 Após a realização dos testes da atividade antimicrobiana a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi obtida através de uma média geométrica e os resultados estão mostrados na tabela 1. 
Tabela 1- Concentração Inibitória Mínima (μg/mL)
	Bactéria
	S.A ATCC
25923
	P.A ATCC
9027
	E.C ATCC
25922
	S.A 10
	P.A 24
	E.C 06
	d- limoneno
	
256
	
≥ 1024
	
≥ 1024
	
≥ 1024
	
512
	
≥ 1024
	d- limoneno complexado/β-ciclodextrina
	
≥ 1024
	
≥ 1024
	
≥ 1024
	
≥ 1024
	
≥ 1024
	
≥ 1024
	β-ciclodextrina
	
≥ 1024
	
≥ 1024
	
≥ 1024
	
≥ 1024
	
≥ 1024
	
≥ 1024
Legenda: S.A- Staphylococcus aureus; P.A- Pseudomonas aeruginosa, E.C- Escherichia coli.
A partir dos resultados foi observado que a CIM da maioria das substâncias foram iguais ou maiores a 1024 μg/mL, tanto para as bactérias padrões quanto para as multirresistentes, com exceção do d-limoneno isolado que teve a CIM de 256 μg/mL para uma bactéria padrão Gram-positiva (S.A ATCC 25923) e para uma bactéria multirresistente Gram- negativa (PA 24) com CIM de 512 μg/mL. Esses resultados estão de acordo com a literatura sobre o efeito antibacteriana do limoneno (VUUREN & VILJOEN, 2007; AYOOLA et al., 2008; WANG et al., 2012; OBIDI et al., 2013; CIRINO, 2014).
A menor CIM foi vista para a bactéria S.A ATCC 25923 corroborando com outros trabalhos sobre a atividade antibacteriana de extratos, óleos essenciais ou substâncias isoladas do gênero Cítrus, onde o composto limoneno é largamente encontrado, os quais demostram possuir um melhor efeito sobre as bactérias Gram-positivas do que sobre Gram-negativas. Isso é devido à diferença da estrutura da parede e membrana celular que faz com que as Gram-positivas sejam mais sensíveis aos componentes dos óleos essenciais (WANG et al., 2012 e OBIDI et al., 2013; AYOOLA et al., 2008). A natureza da membrana celular das Gram-negativas restringem a absorção de moléculas e seu movimento para dentro das células através dos canais de porinas (TORTORA, 2012).
Além dos efeitos comuns dos terpenos sobre a cepa Gram-positiva, o d-limoneno também teve atividade antibacteriana para Gram-negativa, provavelmente devida sua característica lipofílica que funciona com um efeito tóxico na estrutura e função da membrana bacteriana, resultando no aumento de fluidez e permeabilidade da membrana, desordenando as proteínas e ocasionando a perda de função (VALERIANO et al., 2012).
Embora a β-ciclodextrina tenha sido citada por aumentar a solubilidade, permeabilidade e melhorar a aderência a parede celular bacteriana (JUNIOR et al., 2015; TEIXEIRA, 2008), a β-ciclodextrina e o complexo não apresentaram atividade antimicrobiana direta sobre as cepas testadas. Resultados similares foram encontrados em Sousa et al. (2017) e Andrade et al. (2017) envolvendo atividade antimicrobiana da β-ciclodextrina para estas cepas.
Em trabalhos de Andrade et al. (2017) envolvendo o complexo inclusão com β-ciclodextrina também foram relatados a falta de atividade antimicrobiana, o que corrobora com esses resultados. A complexação resulta em mudanças estruturaise propriedades físico-químicas diferentes, o que justifica os resultados distintos envolvendo o complexo (ANDRADE et al., 2017; SOUSA, 2017). 
ATIVIDADE MODULATÓRIA NA ATIVIDADE DOS ANTIBIÓTICOS
	
 Estudos com a combinação de drogas e produtos naturais vêm sendo uma prática bastante utilizada na tentativa de reverter à resistência aos antibióticos, podendo dessa forma aumentar a atividade do mesmo ou reverter o quadro de resistência (COUTINHO et al., 2015b; COUTINHO et al., 2008a).
O efeito modulatório das substâncias foi testado em associação com os antibióticos: gentamicina, norfloxacino e imipeném com o objetivo de avaliar uma possível interação entre eles e os compostos, d-limoneno, o complexo d-limoneno/β-CD e β-CD, buscando desta forma, observar se existiria atividade sinérgica ou antagônica, ou seja, se as substâncias em associação melhorariam ou não a ação antibiótica (CANTON & ONOFRE, 2010). 
Figura 7- Modulação bacteriana com a gentamicina
Legenda: Efeito modulador do d-limoneno, complexo: d-limoneno/β-CD e β-CD em associação com gentamicina contra S. aureus 10, E. coli 06 e P. aeruginosa 24. O controle refere-se ao antibiótico-gentamicina.
**** valor estatisticamente significante com p < 0,0001; não estatisticamente significante quando p > 0,05.
O d-limoneno demostrou sinergismo frente a S. aureus 10, com a redução da CIM de 13,71 μg/mL para 4 μg/mL em associação com a gentamicina (figura 7). Este efeito pode ser devido ao caráter lipofílico dos terpenos que aumenta o influxo do antibiótico para dentro da célula por alteração na permealidade na membrana celular (MAIA et al., 2014; RIBEIRO, et al., 2012). A característica lipofílica dos terpenos, como o d-limoneno, faz com que a membrana fique mais permeável aos prótons e íons devido ao desarranjo da estrutura, inclusive das proteínas de efluxo, que pode levar uma maior interação com as substâncias utilizada e ocasione a morte celular bacteriana (OLUWATUYI et al., 2004; CRISTANI et al., 2007). 
A associação do d-limoneno com a gentamicina frente a E.coli conseguiu reduzir a CIM do antibiótico estatisticamente, levando assim a um efeito sinérgico (figura 7). Os aminoglicosídeos têm como função interagir na síntese protéica alterando conformação do ribossomo bacteriano (JANA & DEB, 2006; TORTORA, 2012), sendo um dos prováveis mecanismos de resistência causado por E.coli é a inativação enzimática e o efluxo do antibiótico (COUTINHO et al., 2008b). 
O complexo d-limoneno/β-CD, bem como a β-CD isolada, não demonstraram atividades sinérgicas quando comparadas ao controle. Porém, quando comparamos o d-limoneno complexado com o d-limoneno puro, notamos uma CIM mais baixa no composto puro (figura 7). Este efeito pode ser devido a mudanças estruturais no composto complexado, indicando que a complexação alterou na organização e na interação físico-químicas com o sistema celular. Dentre estas, a forma de interação composto/antibiótico (ANDRADE et., 2017; OLIVEIRA, 2007).
Figura 8- Modulação bacteriana com o antibiótico norfloxacino
Legenda: Efeito modulador do d-limoneno, complexo: d-limoneno/β-CD e β-CD em associação com norfloxacino contra S. aureus 10, E. coli 06 e P. aeruginosa 24. O controle refere-se ao antibiótico-norfloxacino.
 **** valor estatisticamente significante com p < 0,0001; não estatisticamente significante quando p > 0,05.
De acordo com os resultados mostrados na figura 8, a associação do d-limoneno com a norfloxacino para S. aureus 10 foi antagônica, ou seja, esta associação possibilitou um aumento da CIM. Cirino (2014) avaliou o d-limoneno para a linhagem de S. aureus 1199B em associação com o norfloxacino e esta apresentou resultados indiferente com relação ao controle, com ausência de sinergismo e antagonismo para a linhagem testada.
Em E. coli a combinação das substâncias associada com o norfloxacino foi antagônica, porém quando comparamos o d-limoneno isolado com o complexado observamos diminuição da CIM na substância complexada (figura 8). Entretanto, ao comparamos esta associação com o imipeném notarmos um aumento na CIM na substância complexada (figura 9). O antagonismo das substâncias em associação com os antibióticos pode ser explicado pela ligação dos compostos no local onde o antibiótico se ligaria ou a um possível mecanismo de quelação com o antibiótico, diminuindo o espectro de ação da droga (OLIVEIRA et al., 2017; COUTINHO et al., 2015a).
Para P. aeruginosa também em associação com o norfloxacino (figura 8) o resultado mostrou-se antagônico tanto no complexo quanto na β-CD isolada, com aumento da CIM de 3,42 μg/mL para 32 e 64 μg/mL respectivamente, indicando que a β-CD não melhorou a atividade antibiótica, resultados similares foram encontrados em trabalhos de Freitas, (2017) e Oliveira et al, (2017).
 Figura 9- Modulação bacteriana com o antibiótico Imipeném
Legenda: Efeito modulador do d-limoneno, complexo: d-limoneno/ β-CD e β-CD em associação com Imipeném contra S. aureus 10, E. coli 06 e P. aeruginosa 24. O controle refere-se ao antibiótico-imipeném.
 **** valor estatisticamente significante com p < 0,0001; não estatisticamente significante quando p > 0,05.
Na literatura existem outros trabalhos sobre o melhoramento da atividade antimicrobiana do d-limoneno, como por exemplo, a nanoemulsão com a nisina (ZHANG et al., 2014) e a nanoemulsão com ε-polilisina (ZAHI et al., 2017), porém para o nosso conhecimento este é o primeiro trabalho que relata a atividade antimicrobiana do d-limoneno complexado com a β-ciclodextrina no melhoramento da atividade antibiótica.
CONCLUSÃO
CONCLUSÃO
O d-limoneno demostrou atividade antibacteriana direta tanto para cepa Gram-positiva quanto para cepa Gram-negativa.
O complexo d-limoneno/β-ciclodextrina e a β-ciclodextrina isolada não apresentaram atividade antibacteriana direta contra as cepas testadas.
O d-limoneno e o complexo d-limoneno/β-ciclodextrina apresentaram efeito sinérgico para S. aureus e E. coli em associação com a gentamicina.
As substâncias em associação com o norfloxacino e o imipeném apresentaram efeito antagônico ou indiferente para as cepas testadas.
O d-limoneno isolado apresentou efeito promissor tanto na atividade antibacteriana quanto em associação com antibiótico, já quando complexado com a β-ciclodextrina não apresentou atividades promissoras na atividade antimicrobiana e nem em associação com antibiótico.
	
REFERÊNCIAS
REFERÊNCIAS
ALMEIDA, R. N. et al. Essential Oils and Their Constituents: Anticonvulsant Activity. Molecules,v. 16, n. 3, p. 2726-2742, 2011.
ANDRADE, T. A. et al. Physico-chemical characterization and antibacterial activity of inclusion complexes of Hyptis martiusii Benth essential oil in β-cyclodextrin. Biomedicine & Pharmacotherapy, v. 89, n.1, p. 201-207, 2017.
ARRIETA, M. P. et al. Characterization of PLA-limonene blends for food packaging applications. Polymer Testing, v. 32, n. 4, p. 760-768, 2013.
	
AYOOLA, G. A. et al. Evaluation of the chemical constituents and the antimicrobial activity of the volatile oil of Citrus reticulata fruit (Tangerine fruit peel) from South West Nigeria. African Journal of Biotechnology, v. 7, n. 13, p. 2227-2231, 2008.
BADEE, A. Z. M.; HELMY, S. A.; MORSY, N. F.S. Utilisation of orange peel in the production of α-terpineol by Penicillium digitatum (NRRL 1202). Food Chemistry, v. 126, n. 3, p. 849-854, 2011.
CANTON, M.; ONOFRE, S. B. Interferência de extratos da Baccharis dracunculifolia DC., Asteraceae, sobre a atividade de antibióticos usados na clínica. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 20, n.3, p.348-354, 2010.
CESTARI, E. S. et al. Caracterização genotípica de fatores de virulência de Escherichia coli enterotoxigênica isoladas de água para consumo humano. Revista de Ciências Médicas e Biológicas, v. 15, n. 2, p. 139-143, 2016.
CIRINO, I. C.S. Modulação da resistência a drogas por óleos essenciais em linhagens de Staphylococcus aureus. Dissertação de Mestrado- Universidade Federal de Paraíba, João Pessoa- PB, 2014.
CÓRDOBA-BORREGO, M.; CÓRDOBA-DIAZ, M.; CÓRDOBA-DIAZ, D. Validation of a high-performance liquid chromatographic method for the determination of norfloxacin and its application to stability studies (photo-stability study of norfloxacin). Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, v. 18, n. 6, p. 919-926, 1999.
COUTINHO, H. D. M. et al. Atividade antimicrobiana in vitro de Geraniol e Cariofileno sobre Staphylococcus aureus. Revista Cubana de Plantas Medicinales, v. 20, n. 1, p. 98-105, 2015a.
COUTINHO, H. DM. et al. A atividade anti-estafilocócica in vitro de Hyptis martiusii Benth contra estirpes de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina. Revista Brasileira de Farmacognosia, n. 18, v. 1, p. 670-75, 2008a. 
COUTINHO, H.D.M. et al. In vitro additive effect of Hyptis martiusii in the resistance to aminoglycosides of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Pharmaceutical Biology, v. 48, n. 9, p. 1002–1006, 2010. 
COUTINHO, H. D. M. et al. Avaliação comparativa da modulação de antibióticos, frente às cepas bacterianas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus. Revista Ciencias de la Salud, v. 13, n. 3, p. 345-354, 2015b.
COUTINHO, H. DM. et al. Enhancement of the antibiotic activity against a multiresistant Escherichia coli by Mentha arvensis L. and chlorpromazine.  Chemotherapy, v. 54, n. 4, p. 328-330, 2008b. 
CRISTANI, M. et al. Interaction of four monoterpenes contained in essential oils with model membranes: implications for their antibacterial activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 55, n.15, p. 6300-6308, 2007.
CHIERENTIN, L. Análise Químico-Farmacêutica de Norfloxacino comprimidos e estudos de complexação com β-Ciclodextrina e Polimorfismo. Dissertação de Mestrado - Universidade Estadual Paulista, São Paulo. 2013.
DENG, D.et al. Differentiating enteric Escherichia coli from environmental bacteria through the putative glucosyltransferase gene (ycjM). water research, v. 61,n.1, p. 224-231, 2014.
DORMAN H. J. D.; DEANS, S. G. Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. Journal of Applied Microbiology, v. 88, n.1, p. 308–316, 2000.
DUARTE, M. C. T. et al. Anti-Candida activity of Brazilian medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology, v. 3, n. 97, p. 305-311, 2005.
DUETZ, W. A. et al. Biotransformation of limonene by bacteria, fungi, yeasts, and plants. Applied microbiology and biotechnology, v. 61, n. 4, p. 269-277, 2003.
FALCÃO, D. Q.; MENEZES, F. S. Revisão etnofarmacológica, farmacológica e química do gênero Hyptis. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 84, n. 3, p. 69-74, 2003.
FENG, L. et al. Flowery odor formation revealed by differential expression of monoterpene biosynthetic genes and monoterpene accumulation in rose (Rosa rugosa Thunb.). Plant physiology and biochemistry, v. 75, n.1, p. 80-88, 2014. 
FERRARINI, S. R. et al. Acaricidal activity of limonene, limonene oxide and β-amino alcohol derivatives on Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Veterinary parasitology, v. 157, n. 1, p. 149-153, 2008.
FISHER, K; PHILLIPS, C. Potential antimicrobial uses of essential oils in food: is citrus the answer?. Trends in food science & technology, v. 19, n. 3, p. 156-164, 2008.
FOXMAN, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology, v. 7, n. 12, p. 653–660, 2010.
FREITAS, T.S. Atividade antibacteriana do óleo essencial das folhas de Hyptis martiusii benth e de seu complexo de inclusão em β–ciclodextrina- Dissertação de Mestrado-Universidade Regional do Cariri-URCA, Crato-CE, 2017.
GAMSIZ, E. D. et al. Model predicting impact of complexation with cyclodextrins on oral absorption. Biotechnology and bioengineering, v. 110, n. 9, p. 2536-2547, 2013.
GOYAL, R. N.; RANA, A. R. S.; CHASTA, H. Electrochemical sensor for the sensitive determination of norfloxacin in human urine and pharmaceuticals. Bioelectrochemistry, v. 83, n.1, p. 46-51, 2012.
GUIMARÃES, A. G.; SERAFINI, M. R.; QUINTANS-JÚNIOR, L. J. Terpenes and derivatives as a new perspective for pain treatment: a patent review. Expert opinion on therapeutic patents, v. 24, n. 3, p. 243-265, 2014.
GUEDES, F. L. et al. Ciclodextrinas: como adjuvante tecnológico para melhorar a biodisponibilidade de fármacos. Revista Brasileira de Farmácia, v. 8, n. 92, p. 220-235, 2008.
GUERRERO, S.A.N. Evaluación del efecto antifúngico In Vitro del aceite esencial de hoja de canela (Cinnamomum zeylanicum) puro y microencapsulado. Monografia de Graduação - Zamorano: Escuela Agrícola Panamericana, Honduras. 2006.
HALL, B.M. et al. Two isoforms of Clp peptidase in Pseudomonas aeruginosa control distinct aspects of cellular physiology. Journal of Bacteriology, v. 199, n. 3, p. e00568-16, 2017. 2017.
JANA, S; DEB, J. K. Molecular understanding of aminoglycoside action and resistance. Applied microbiology and biotechnology, v. 70, n. 2, p. 140-150, 2006.
JAVADPOUR, M. M. et al. De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity. Journal of Medicinal Chemistry, v. 39, n.16, p. 3107–3113, 1996.
 JING, L. et al. Preventive and ameliorating effects of Citrus D-limonene on dyslipidemia and hyperglycemia in mice with high-fat diet-induced obesity. European journal of pharmacology, v. 715, n. 1, p. 46-55, 2013. 
JUNIOR, J. A. C. N. et al. Análise dos pedidos de patentes recentes envolvendo ciclodextrinas no setor farmacêutico.  Revista Interdisciplinar de Pesquisa e Inovação, v. 1, n. 1, p.1-7, 2015.
KURDELAS, R. R. et al. Chemical composition, anti-insect and antimicrobial activity of Baccharis darwinii essential oil from Argentina, Patagonia. Industrial crops and products, v. 40,n. 1, p. 261-267, 2012
LESCAT, M. et al. Using long‐term experimental evolution to uncover the patterns and determinants of molecular evolution of an Escherichia coli natural isolate in the streptomycin‐treated mouse gut. Molecular ecology, v. 26, n. 7, p. 1802-1817, 2017.
LIM, J.; PARK, B.; YUN, H. Sensitive liquid chromatographic - mass spectrometric assay for norfloxacin in poultry tissue. Journal of Chromatography B, v. 772, n. 1, p. 185-189, 2002.
MAIA, A. J. et al. Óleo essencial de alecrim no controle de doenças e na indução de resistência em videira. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 49, n. 5, p. 330-339, 2014.
MANDELL, G. L. et al . Principles and practice of infectious diseases. 7 edição. Elsevier, 2010. 
MANAKKER, F. et al. Cyclodextrin-based polymeric materials: synthesis, properties, and pharmaceutical/biomedical applications. Biomacromolecules, v. 10, p. 3157–3174, 2009.
 MATIAS, E. F. F.et al. Screening the in vitro modulation of antibiotic activity of the extracts and fractions of Ocimum gratissimum L. African Journal of Microbiology Research, v. 6, n. 9, p. 1902-1907, 2012.
MORAES, C. M. et al. Preparação e caracterização físico-química de complexos de inclusão entre anestésicos locais e hidroxipropil-beta-ciclodextrina. Química Nova, v. 30, n. 4, p.777-784, 2007.
MOUFIDA, S.; MARZOUK, B. Biochemical characterization of blood orange, sweet orange, lemon, bergamot and bitter orange. Phytochemistry, v. 62, n. 8, p. 1283-1289, 2003.
MURRAY, P. R. et al. Microbiologia Médica. 6 edição. Rio de Janeiro: Elservier editora Ltda, 2011.
NAVARRO, L. R. et al. Bacterial colonization patterns in neonates transferred from neonatal intensive care units. International journal of hygiene and environmental health, v. 214, n. 2, p. 167-171, 2011.
NAVES, K. S. C; TRINDADE, N. V; GONTIJO -FILHO, P. P. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus bloodstream infection: risk factors and clinical outcome in non-intensive-care units. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 45, n. 2, p. 189-193, 2012.
NOSTRO,A. et al. Susceptibility of methicillin-resistant Staphylococcus aureus to oregano essential oil, carvacrol and thymol. FEMS Microbiology Letters, v. 230, n.2, p. 191–195, 2004.
OBIDI, O. F. et al. Antimicrobial activity of orange oil on selected pathogens.The International Journal of Biotechnology, v. 2, n. 6, p. 113-122, 2013.
OLIVEIRA, H.F.D. Nanoagregados baseados em ciclodextrinas em associação com a tetraciclina: caracterização físico-química e avaliação antimicrobiana. Dissertação de Mestrado – Universidade Federal de Minas Gerais,Minas Gerais- BH, 2007. 
OLIVEIRA, J.F. P.; CIPULLO, J. P; BURDMANN, E. A. Nefrotoxicidade dos aminoglicosídeos. Revista Brasileira de Cirurgia Cardiovascular, v. 21, n. 4, p. 444-452, 2006.
OLUWATUYI, M., et al. Antibacterial and resistance modifying activity of Rosmarinus officinalis. Phytochemistry Reviews.; v. 65, n. 1, p. 3249-3254, 2004.
PASSOS, C. S. et al. Terpenoides com atividade sobre o Sistema Nervoso Central (SNC). Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 19, n. 1, p. 140-149, 2009.
RAO, R.N.; NAGARAJU, V. Separation and determination of synthetic impurities of norfloxacin by reversed-phase high performance liquid chromatography. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, v.34, n.5, p.1049-1056, 2004. 
RIBEIRO, S. D.et al. Avaliação do óleo essencial de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) 
como modulador da resistência bacteriana. Semina: Ciências Agrárias, v. 33, n. 2, 2012.
SALES, G.W.P. et al. Efeito antimicrobiano e modulador do óleo essencial extraído da casca de frutos da Hymenaea courbaril L. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, v. 35, n. 4, p. 709-715, 2014.
SALV,;AT, A.et al. Screening of some plants from North Argentin for their antimicrobial activity. Letters in Applied Microbiology and Biotechnology, V. 32, n. 5. p. 293-297, 2001. 
SANTOS, B. H. C. Origem bacteriana e perfil de sensibilidade aos antibióticos. Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal de Paraíba-UFPB, 2011.
SCHUCK, V. J. A. et al. Avaliacao da atividade antimicrobiana de Cymbopogon citratus. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, n.37, v. 1, p. 45-49, 2001.
SILVA, P. V. Avaliação da Atividade Antimicrobiana de Compostos de Inclusão Formados Entre Sulfadiazina de Sódio e Ciclodextrinas. Dissertação de Mestrado- Universidade Federal de Itajubá, ITAJUBÁ-MG, 2015.
SIMOES, C. M. O. et al. Farmacognosia do produto natural ao medicamento. Porto Alegre: Artmed, 2017.
SOUSA, O. F. et al. Evaluation of the antibacterial and modulatory potential of α-bisabolol, β-cyclodextrin and α-bisabolol/β-cyclodextrin complex. Biomedicine & Pharmacotherapy, v. 92, n.1, p. 1111-1118, 2017.
SOUZA, A. A. et al. Terpenos com aplicação cardiovascular. Revista GEINTEC, v. 5, n. 2, p.1948-1954, 2015.
SOUZA, V. B. et al. Alterações renais por aminoglicosídeos. Arquivos de medicina, v. 22, n. 4-5, p. 131-135, 2008.
STOVER, C. K. et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature, v. 406, n. 6799, p. 959-964, 2000.
TEIXEIRA, A. B. Avaliação das atividades antimicrobiana e antioxidante dos óleos essenciais das folhas dos quimiotipos I, II e III de Lippia alba (Mill.) NE Brown.Tese de Doutorado- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2009
TEIXEIRA, K. I. R. Estudo das alterações da membrana celular de microorganismos por compostos de inclusão de clorexidrina: Beta-ciclodextrina em diferentes proporções molares usando microscopia de força atômica e microscopia eletrônica de varredura. Dissertação de Mestrado - Universidade Federal de Minas Gerais, Minas Gerais-BH, 2008. 
TEIXEIRA, M. O. Estudo de prescrições de antimicrobianos na unidade de terapia intensiva de um hospital terciário do Distrito Federal. Trabalho de conclusão de curso-TCC- Universidade de Brasília Faculdade de Ceilândia, Ceilândia-DF, 2015.
TENAILLON, O. et al. The population genetics of commensal Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology, v. 8, n.1, p. 207 –217, 2010.
TORTORA, G. J; FUNKE, B. R; CASE, C. L; Microbiologia. 10ª Edição. Porto Alegre: Artmed, 2012.
TOURRET, J. et al. Small Intestine Early Innate Immunity Response during Intestinal Colonization by Escherichia coli Depends on Its Extra-Intestinal Virulence Status. PLOS ONE, v. 11, n. 4, p. e0153034, 2016.
VALERIANO, C. et al. Atividade antimicrobiana de óleos essenciais em bactérias patogênicas de origem alimentar. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 14, n. 1, p. 57-67, 2012.
VALLE, E. M. M. Cyclodextrins and their uses: a review. Process biochemistry, v. 39, n. 9, p. 1033-1046, 2004.
VUUREN, V. S. F.; VILJOEN, A. M. Antimicrobial activity of limonene enantiomers and 1, 8‐cineole alone and in combination. Flavour and fragrance journal, v. 22, n. 6, p. 540-544, 2007.
VAZ, R. A. P. et al. Microaerophilic growth characteristics of Pseudomonas aeruginosa importance to the successful treatment of chronic infections in cystic fibrosis lungs. Biofilms 7-Microbial Works of Art, n. P3: 25, 2016.
VIEGAS-JÚNIOR. C. Terpenos com atividade inseticida: uma alternativa para o controle químico de insetos. Química Nova, v. 3, n. 26, p. 390-400, 2003.
VIEIRA, C. G.et al. Synthesis of fragrance compounds from acyclic monoterpenes: rhodium catalyzed hydroformylation and tandem hydroformylation/acetalization of linalool and β-citronellene. Applied Catalysis A: General, v. 466, n.1, p. 208-215, 2013.
WANG, Y.W. et al. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of Kumquat (Fortunella crassifolia Swingle) Peel. International journal of molecular sciences, v. 13, n. 3, p. 3382-3393, 2012.
XIE, H. et al. Host–guest inclusion system of artesunate with β-cyclodextrin and its derivatives: Characterization and antitumor activity. Journal of Molecular Structure, v. 1085, n.1, p. 90-96, 2015.
ZAHI, M. R. et al. Enhancing the antimicrobial activity of d-limonene nanoemulsion with the inclusion of ε-polylysine. Food chemistry, v. 221, n.1, p. 18-23, 2017.
ZHANG, Z. et al. Effects of nisin on the antimicrobial activity of D-limonene and its nanoemulsion. Food chemistry, v. 150, n.1, p. 307-312, 2014.
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