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Citoesqueleto Biologia Molecular e Celular II - 2014 Citoesqueleto • Organização dos componentes celulares • Interação mecânica com o ambiente • Movimentos coordenados • Direcionamento do trânsito intracelular • Separação cromossômica na mitose Ações dependentes do citoesqueleto “ossos e músculos” celulares Micrografia de fluorescência de uma célula de fibroblasto corada para evidenciar filamentos intermediários de queratina Componentes do citoesqueleto: filamentos protéicos MT = microtúbulos IF = filamentos intermediários AF = filamentos de actina Distribuição dos filamentos do citoesqueleto em células eucarióticas epiteliais do intestino Filamentos do Citoesqueleto • Formados por subunidades pequenas – associação e distribuição rápidas • Mantidos por interações fracas; • Associam-se com proteínas acessórias – estas regulam sua distribuição espacial e comportamento dinâmico. Estabilidade térmica de filamentos do citoesqueleto com extremidades dinâmicas. (Fonte: Alberts et al.) Filamentos intermediários • Não são polarizados e“intermediários” em referência ao diâmetro; • Encontrados no citoplasma em céls. de alguns animais (vertebrados, moluscos e nematódeos) e lâmina nuclear em eucariotos em geral (metazoários, mas não em plantas e unicelulares) No citoplasma: dão resistência mecânica à tensão; Estendem-se à periferia da célula, ancorando junções cél-cél.; Formam uma rede que reveste a membrana interna do núcleo: a lâmina nuclear, ancorando cromossomos e poros nucleares. From: Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010 November; 2(11): a000547. doi: 10.1101/cshperspect.a000547 The nuclear lamins form a meshwork of filaments within the lamina. (A) Spread nuclear envelope from Xenopus oocytes after detergent extraction and preparation for transmission electron microscopy by freeze-drying/unidirectional metal shadowing. The micrograph shows the nuclear lamina meshwork partially studded with nuclear pore complexes. (Inset) Higher-magnification view of a particularly well-preserved area clearly shows the near-tetragonal lamina meshwork. Bars, 1 µm. Reprinted from Stuurman et al. (1998) Desmossomo Filamentos de queratina em células epiteliais Micrografia de imunofluorescência de uma rede de filamentos de queratina (verde) em células epiteliais em cultura. Os filamentos em cada célula estão indiretamente conectados as células vizinhas pelos desmossomos. Alberts B. et al. Molecular Biology of the Cell. Dímero de filamento intermediário com caudas globulares e domínio central -helicoidal conservado. Estrutura das proteínas que formam os filamentos intermediários cabeça bastão cauda N-terminal C-terminal Filamentos intermediários Filamentos intermediários Particularmente presentes no citosol de células que sofrem estresse mecânico As células permanecem intactas e unidas Ruptura das células Camada de células epiteliais sendo distendida Proteínas acessórias • Interligam os feixes de filamentos intermediários (FI) formando arranjos fortes e estáveis. Ex. plectina mantém os feixes de FI unidos e os conecta a microtúbulos, filamentos de actina e desmossomos Micrografia eletrônica de um fibroblasto. Em vermelho, os microtúbulos; em azul, os filamentos intermediários; e em verde, fibras de conexão de plectina e, em amarelo partículas de ouro ligadas a anticorpos que reconhecem a plectina Microtúbulos • Papel essencial na organização das céls. eucarióticas • Tubos protéicos longos e ocos • Sofrem dissociação e reassociação • Criam vias de transporte para vesículas e organelas • Ancoram organelas e membrana plasmática • Formam o fuso mitótico, cílio e flagelo Microtúbulos geralmente se estendem para fora da estrutura organizadora Estrutura das subunidades de tubulina e sua organização nos microtúbulos heterodímero Arranjo dos protofilamentos em microtúbulos simples, duplos e triplos Estágios na montagem dos microtúbulos Montagem do protofilamento Montagem da folha Elongação do microtúbulo Tubulina Tubulina Extremidade (+) Extremidade (-) Há polaridade... Centros organizadores de microtúbulos • Número, posicionamento e orientação no citoplasma são controlados • Em células animais = o centrossomo é o principal centro organizador de microtúbulos (MTOC) -tubulina é o sítio de nucleação O crescimento do microtúbulo é orientado. Micrografia eletrônica do centrossomo (centro organizador de microtúbulos) em uma célula animal. Polimerização da tubulina nucleada pelos complexos de γ- tubulina (A) Modelo para a nucleação do crescimento do microtúbulo pela γ- TuRC. (B) Micrografia eletrônica de complexos de anéis γ-tubulina purificados (acima) e microtúbulos individuais nucleados a partir dos complexos de anéis de γ-tubulina (meio e abaixo). (A, modified from M. Moritz et al., Nature Cell Biol. 2:365–370, 2000; B, courtesy of Y. Zheng et al., Nature 378:578–583, 1994.) Instabilidade dinâmica dos microtúbulos • Crescimento e encurtamento do microtúbulo de forma dinâmica. • Deve-se a capacidade da tubulina de hidrolisar GTP Observação direta da instabilidade dinâmica de microtúbulos numa célula viva Microtúbulos em uma célula epitelial do pulmão de salamandra observados após a cél. ter sido injetada com uma pequena quantidade de tubulina marcada com rodamina. Quatro microtúbulos estão destacados para facilitar a observação. Microscopia crioeletrônica permite a observação de microtúbulos Extremidades desalinhadas Desmontagem (encurtamento) Montagem (alongamento) Balanço entre montagem e dissociação • Há uma remodelação rápida e contínua dos microtúbulos no citosol. Colchicina X Taxol no fuso mitótico (desestabiliza MT) x (estabiliza MT) Drogas antimitóticas A tubulina pode ser estabilizada, evitando a despolimerazação atendendo às necessidades da célula. Efeito do taxol a organização de microtúbulos Microscopia de imunofluorescência mostrando a organização dos microtúbulos numa célula epitelial do fígado antes da adição do taxol (B) e depois (C). (D) Taxus, a fonte natural de taxol. Dinâmica dos microtúbulos Fonte: Lodish et al. Tau x microtúbulos Nature Reviews Drug Discovery 6, 464- 479 (June 2007) | doi:10.1038/nrd2111 Os microtúbulos organizam a célula • Contribuem para a polarização das células animais; • Auxiliam no posicionamento das organelas e “guiam” o trânsito entre os diversos compartimentos celulares. Componentes do citoesqueleto: filamentos protéicos MT = microtúbulos IF = filamentos intermediários AF = filamentos de actina Filamentos de actina • Encontrados em todas as células eucarióticas • Essenciais para seu movimento: – Migração, fagocitose, divisão celular • Assim como os microtúbulos, podem formar estruturas estáveis nas células; • Subunidade é extremamente conservada entre eucariotos (~90%) • Diferentes proteínas de ligação à actina conferem diferentes funções A actina entre diferentes vias Molecular Biology of the Cell. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.,2002. Os filamentos de actina são finos e flexíveis (7nmde diâmetro) Há polaridade estrutural no filamento; Associação e dissociação ocorrem Polimerização da actina in vitro As subunidades de actina podem “viajar”pelo filamento Actina concentra-se no córtex celular • Os filamentos de actina são frequentemente nucleados na membrana citoplasmática, regulados por sinais ext. • proteínas de ligação à actina conectam os microfilamentos, formando uma trama de sustentação (Arps) ou feixes não ramificados (forminas); - Revisão em: K. G. Campellone & M. D. Welch. A nucleator arms race: cellular control of actin assembly.Nature Reviews Molecular Cell Biology 11, 237-251 (April 2010); doi:10.1038/nrm2867 • Essa trama coordena morfologia e propriedades mecânicas da membrana plasmática e superfície da célula Rede de microfilamentos na base de um queratinócito: filamentos de actina ramificados com complexo Arp 2/3 nos pontos de ramificação (Arp= proteína relacionada à actina, catalisa a nucleação de actina) Estruturas de Arp 2 e Arp 3, comparadas à actina e modelo de nucleação do complexo Arp Molecular Biology of the Cell. 5th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.; 2002. Phenotypes of wild-type and brk2 (Arp) mutant leaves. Frank M J et al. Development 2003;130:753-762 The Major Mechanisms of Actin Nucleation in Cells and Some of their Accessory Proteins Both the Arp2/3 complex and formins use actin monomers to polymerize actin filaments. Robert H. Insall , Laura M. Machesky Actin Dynamics at the Leading Edge: From Simple Machinery to Complex Networks Developmental Cell Volume 17, Issue 3 2009 310 - 322 http://dx.doi.org/10.1016/j.devcel.2009.08.012 Filamentos de actina • Cerca de 5% da proteína total de uma célula animal é actina. ½ associada a filamentos e ½ monomérica no citosol [alta], por que não se associam todas? Monômeros estão ligados a outras proteínas no citosol (timosina) Ou há proteínas de ligação ao filamento... Profilina timosina Fonte: Lodish et al. Uma microvilosidase. (A) um feixe de filamentos de actina paralelos ligados pelas proteínas vilina e fimbrina. As extremidades + dos filamentos estão na ponta do microvilus (B) Micrografia eletrônica de crio-fratura da superfície apical de uma célula do epitélio intestinal (C) Micrografia eletrônica de uma fina secção de uma microvilosidase. A migração celular depende da actina: ex. de um fibroblasto Forças produzidas pela montagem da rede de actina Alteração do formato das plaquetas durante a coagulação: resultado de rearranjo de actina interligada à membrana plasmática. em repouso exposta a agentes expandida coagulantes Adesão • Quando lamelipódios e filopódios fazem contato com uma superfície favorável, eles ADEREM. Integrinas = proteínas transmembrana de adesão Pontos de acoramento p/ a actina e Ponto de apoio externamente (MEC ou céls.) Adesão Adesão focal extensão adesão translocação desadesão Adesão antiga Movimento do corpo celular Nova adesão lamelipódio Direção do movimento Proteínas motoras: motores moleculares • Proteínas motoras usam a energia da hidrólise de ATP para o transporte de organelas, vesículas e outros; • As vias citoplasmáticas são providas de microtúbulos (MT) e filamentos de actina; • O movimento é saltatório • As proteínas motoras: – Ligam-se aos MT ou aos filamentos de actina – Diferem quanto ao tipo de filamento ao qual se ligam e direção – Para os MT, pertencem à 2 famílias: cinesinas (preferencialmente +) e dineínas (-) – Possuem cabeças globulares de ligação à ATP e uma cauda (liga o cargo) Modelo de transporte no microtúbulo catalisado pela cinesina Estrutura da cinesina haste pescoço Cadeia leve cauda cabeça cabeça pescoço Sítios de ligação ao MT A maioria das cinesinas é orientada para as extremidades mais. http://www.youtube.com/watch?v=YAva4g3Pk6k As cabeças globulares têm atividade ATPásica Cílios e flagelos • Microtúbulos estáveis sustentam cílio e flagelo • O padrão desses microtúbulos é peculiar (9+2) em eucariotos; Deslizamento controlado dos microtúbulos duplos externos levam aos batimentos ciliares e flagelares. O movimento da dineína levando à curvatura do flagelo Actina + miosina = estrutura contrátil • Miosina = proteína motora dependente de actina Hidrólise de ATP = energia p/ movimento cabeça de miosina Microfilamento de actina Domínio cabeça: interação com actina Funções do domínio cauda da miosina Miosina V Miosina I Miosina II: associação pelo domínio cauda Caudas de miosina II cabeças de miosina II Zona lisa O modelo do filamento deslizante na contração do músculo estriado http://www.youtube.com/watch?v=RmQzIS9IGUE&feature=plcp The titin-nebulin filament system stabilizes the alignment of thick and thin filaments in skeletal muscle. Figure 18-30, Lodish 4th edition. A molécula de miosina caminha ao longo do filamento de actina sofrendo um ciclo de mudanças estruturais. - + + - - + + - Estrutura cristalográfica das cabeças de miosina e cinesina: indicação de origem comum T tubules and the sarcoplasmic reticulum. (Figure 16-73, Molecular Biology of the Cell, 4th edition)
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