relatorio 3, A água como componentes celular e Bioquímica de macromoléculas (parteII)

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RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA 
	Nome do Aluno: Viviane Aparecida Ferreira 
	Disciplina: Ciências Moleculares e Celulares
	Título do Roteiro de Aula Prática: A água como componentes celular e Bioquímica de macromoléculas (parteII)
	Polo: Anhanguera Telêmaco Borba 
	Turma: A 
	Curso: Enfermagem 
	Semestre: 2º
	Data da aula prática: 12/09/2018 
	Aula Prática: 3
OBJETIVOS: Descrever os objetivos da aula prática.
	Compreender a separação eletroforética de proteínas,
Demonstrar o efeito do tampão biológico a especificidade enzima-substrato
MATERIAL E MÉTODOS: Descrever de forma sucinta quais foram os materiais e equipamentos utilizados.
	Tubos de ensaio;
Pipetas; 
Ureia tamponada com indicador (substrato); 
Uréase; 
Água Destilada. 
Tiouréia tamponada com indicador, 
Becker, 
Vermelho Fenol, 
MÉTODOS
Marcar dois tubos (1 e 2) e distribuir neles as quantidades de 3ml cada um, de ureia tamponada com indicador, logo em seguida adicionar 3 gotas de uréase no tubo 1 e colocar 3 gotas de água destilada no tubo 2. Depois agitar. Observar e anotar os resultados em forma de tabela marcando com um + ou um – a mudança de cor observada.
Marcar dois tubos (1 e 2) de ensaio e distribuir neles as substâncias nas quantidades de 2 ml de ureia tamponada com indicador no tubo 1, 2 ml de tiouréia tamponada com indicador no tubo 2, e adicionar 3 gotas de uréase em ambos os tubos. Depois agitar. Observar e anotar os resultados em forma de tabela marcando com um + ou um – a mudança de cor observada.
Colocar em um tubo (1) de ensaio 3ml de água destilada e 3 gotas de uréase. Agitar. 
Colocar em banho-maria fervente por 3 minutos. Esfriar em água corrente.
	
Em outro tubo (2) pipetar 2 ml de ureia tamponada e juntar ml da uréase fervida do tubo 1. Agitar.
DESENVOLVIMENTO DA AULA: Descrever os resultados obtidos durante a aula prática.
	Procedimento 1- Eletroforese de Proteínas 
Fundamentos da técnica é a parte teórica, quais são os fundamentos físicos químicos, que são aplicados nesta técnica, que nos ajudam com a bioquímica das proteínas, aplicações da análise de proteínas por eletroforese.
Electro (energia da eletricidade) /Grego phoros(migração), as proteínas elas migram dentro de um campo elétrico, devida as cargas (campo elétrico).
O campo elétrico é um campo de atração formado entre duas placas de diferentes cargas, uma placa de polo positivo e a outra placa de polo negativo, este campo elétrico apresenta uma energia onde partículas positivas são repelidas pela placa positiva e atraídas pela negativa, ao passo que as partículas negativas são atraídas para positivas, esta separação de cargas que gera o campo elétrico, chamamos de DDP ou diferença de potencial que é medida em voltagem, ela define o quanto de carga elétrica eu tenho ali, quanto maior a diferença de potencial maior será a corrente elétrica do meu tampão, é um meio liquido, a solução tampão é um acido fraco + base conjugada( ÍONS), estes íons numa base em potencial eles se movem dentro de um campo elétrico, precisa de um suporte pra colocar a amostra q será analisada, este suporte vai servir de resistência para a migração das proteínas na eletroforese, pode ser um suporte de diferentes materiais pode ser de papel, acetato de celulose ou géis.
A eletroforese é uma técnica usada para separar, e algumas vezes purificar, macromoléculas, especialmente ácidos nucleicos e proteínas, que diferem em tamanho, carga e conformação. 
Como tal, é uma das técnicas mais usadas em laboratórios de bioquímica e de biologia molecular. Proteínas e ácidos nucleicos são submetidos à eletroforese em matriz porosa ou “gel”. Normalmente, o gel é preparado e depositado em cubas com canaletas ou poços para serem preenchidos com as amostras. O gel é imerso em uma solução que fornece os íons para conduzir a corrente, com poder tamponante para manter o pH em faixa relativamente constante. Quando moléculas carregadas são colocadas sob um campo elétrico, elas migram para o polo positivo ou negativo, de acordo com sua carga. Diferentemente das proteínas, que podem ter carga total tanto positiva como negativa, ácidos nucleicos sempre possuem carga total negativa, em função dos grupamentos fosfato presente nessas moléculas; assim, migram sempre para o polo positivo. Os géis utilizados para eletroforese podem ser compostos de agarose ou de poliacrilamida, tendo cada uma delas atributos particulares úteis em diferentes situações. A agarose é um polissacarídeo extraído de algas marinhas. É normalmente usada em concentrações entre 0,5 e 2%. Quanto maior for à concentração de agarose, mais rígido é o gel. Géis de agarose tem uma faixa de separação bastante ampla, mas baixo poder de resolução. Por meio da variação de concentração de agarose, fragmentos de DNA de 200 a 50.0 pares de bases podem se separados usando procedimentos simples.
A poliacrilamida é um polímero ramificado de acrilamida. O comprimento das cadeias do polímero é determinado pela concentração de acrilamida pela concentração de acrilamida utilizada, normalmente entre 3,5 e 20%. Géis de poliacrilamida possuem uma faixa de separação relativamente pequena, mas alto poder de resolução. No caso de DNA, géis de poliacrilamida são usados para separar fragmentos menores do que 500 pares de bases. Em condições apropriadas, fragmentos de DNA com diferença de apenas um par de bases em tamanho podem se facilmente separados. Diferentemente da agarose, géis de poliacrilamida são bastante utilizados para separação e caracterização de proteínas.
A separação de proteínas por tamanho é obtida com o uso do gel de sódio dodecil sulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE). A eletroforese SDS-PAGE é capaz de separar todos os tipos de proteínas incluindo proteínas de membrana e em pequenas quantidades. A mobilidade das proteínas no gel de poliacrilamida depende do seu tamanho e a concentração de acrilamida. O gel funciona como uma peneira molecular, quanto mais alta a concentração de acrilamida, menores são os poros e as proteínas se movem mais lentamente. 
Os géis com alta concentração de acrilamida são usados para determinar proteínas de tamanho pequeno, e géis com baixas concentrações de acrilamida são usados na determinação de proteínas grandes. Antes de iniciar a eletroforese, nas amostras deve ser adicionado um tampão contendo SDS. O SDS é um detergente aniônico que desnatura proteínas e forma uma camada de cargas negativas, o qual as proteínas passam a ter uma carga intrínseca. Assim, as proteínas assumem uma forma de haste e carregadas por uma malha de carga negativa. Quando estas proteínas são colocadas em eletroforese no SDS-PAGE, as proteínas migram para o eletrodo positivo. Desta forma, as proteínas podem ser separadas pelos seus pesos moleculares. A cada novo ensaio com nova proteína (proteína desconhecida) deve-se ajustar a concentração de acrilamida e tempo de corrida no gel. conclui-se que a eletroforese no SDS-PAGE realizada de forma padronizada e cuidadosa é uma excelente ferramenta que ajuda a determinar, por exemplo, o peso molecular de uma proteína desconhecida quando comparada outra de peso molecular conhecido.
Procedimento 2- Reação de especificidade da enzima-substrato.
As enzimas são proteínas especializadas na catálise de reações biológicas. Elas estão entre as biomoléculas mais notáveis devido a sua extraordinária especificidade e poder catalítico, que são muito superiores aos dos catalisadores produzidos pelo homem. Praticamente todas as reações que caracterizam o metabolismo celular são catalisadas por enzimas, sendo assim, consideradas as unidades funcionais do metabolismo celular. À uréase foi à primeira enzima a ser purificada e cristalizada, numa altura em que a maior parte dos cientistas acreditava ser impossível cristalizar enzimas. A uréase catalisa a hidrólise de ureia em dióxido de carbono e amônia. Encontra-se principalmente em sementes, micro-organismos e invertebrados. Nas
plantas, a uréase é um hexâmetro (consiste em seis cadeias idênticas) e localiza-se no citoplasma. Em bactérias, é constituída por duas ou três subunidades diferentes. Para ser ativada, a uréase precisa ligar-se a dois íons níquel por subunidade. Todos os organismos decompõem ácidos nucléicos e proteínas produzindo resíduos nitrogenados, pois os ácidos nucléicos e as proteínas contêm nitrogênio. Os mamíferos, anfíbios e alguns invertebrados libertam resíduos azotados na forma de ureia, que é produzida no fígado. A ureia é um composto especialmente indicado para a eliminação de azoto, pois é solúvel em água e menos tóxica que a amônia, no qual é o produto da excreção nos peixes, por exemplo. A urina humana contém 2% de ureia.
A atividade da enzima pode ser demonstrada fazendo-a reagir com uma solução de ureia a pH=7, muito fracamente tamponada. A solução contém um indicador, vermelho de fenol, que muda de amarelo para rosa pela subida dos valores de pH. Estando a enzima ativa ocorrera liberação de amônia em quantidades suficientes para sobrepujar a ação do tampão tornando o meio da reação alcalino. Como conseqüência da subida do pH, a solução, originalmente amarela, passa a cor rósea.
Tabela 1. Resultado da mudança de cor do experimento I:
	Tubos
	 Ureia tamponada c/ indicador
	Uréase
	Água destilada
	AGITAR
	Mudança de cor
	1
	3ml
	3 gotas
	
	
	+
	2
	3ml
	
	3 gotas
	
	
A partir dos resultados obtidos na tabela 1, pode-se inferir que no tubo 1 houve mudança na cor da reação devido a presença da ureia no meio, onde a mesma é o substrato da uréase. Com isso o produto final dessa reação é a amônia constatada pela mudança na coloração, pois ao ocorrer a reação CO(NH2)2 + H2O → 2 NH3 + CO2 há um aumento do pH e o indicador vermelho de fenol presente na solução muda para uma tonalidade rósea.
No entanto no tubo 2 não foi observado nenhuma mudança na coloração, visto que no mesmo só foi adicionado água destilada e uréase e com isso a enzima não pode ser ativada uma vez que o seu substrato estava ausente na solução. Por isto, com o tubo 2, pode-se ainda concluir a natureza da atividade da uréase X ureia, sendo o tubo 2 um padrão para o experimento.
A uréase é altamente especifica para a ureia. Isto pode ser demonstrado fazendo a enzima reagir com um composto com estrutura semelhante à do substrato, a tiouréia H2N-CS-NH2, e verificar se houve mudança de cor.
Tabela 2. Resultado da mudança de cor do experimento II:
	Tubos
	Ureia tamponada c/ indicador
	Tiouréia tamponada c/ indicador
	Uréase
	AGITAR
	Mudança de cor
	1
	2 ml
	
	3 gotas
	
	+
	2
	
	2 ml
	3 gotas
	-
	
De acordo com a tabela 2, pode concluir que a uréase tem alta especificidade com o seu substrato, ou seja, a ureia, visto que no experimento anterior foi usado como um controle a água destilada, no qual a enzima não reagiu, mas esse dado obtido não pode ser tido como uma especificidade da uréase com a ureia uma vez que a água é completamente diferente da ureia. Por isto, nesse experimento, onde a tioureia é utilizada no tubo 2 a solução final aparentemente ficou semelhante a inicial, mostrando que não houve produção de amônia e consequentemente inalteração de cor. Já no tubo 1 pode ser visto o mesmo fenômeno do experimento I, aquele em que testa a atividade da enzima.
Desnaturação Pelo Calor
Devido à sua natureza protéica, as enzimas são sensíveis à ação de temperaturas elevadas, que podem destruir a função catalítica do seu centro ativo.
No primeiro tubo, onde foi adicionada água e uréase não foi observado mudança de cor nem na textura da solução;
No segundo tubo, onde foi adicionado a uréase fervida do tubo anterior contendo ureia, houve uma mudança de cor para o rosa fracamente, quase que imperceptível;
Após 5 minutos houve uma mudança na textura da solução, aparecendo um precipitado.
A estrutura da proteína ou peptídeos das enzimas está correlacionada com suas funções biológicas, isto leva a uma grande variedade e especificidade reproduzível. A especificidade das enzimas depende da região chamada de sitio ativo, lugar responsável pela ligação com o substrato.
A uréase possui um grau de especificidade alto para a uréia. Isto pode ser provado com uma reação entre a enzima e o composto que possui uma estrutura semelhante à do substrato, a tiouréia, verificando a mudança de cor.
O primeiro tubo trazia tampão com uréia e esperava-se a presença de uma tonalidade rosa, já que a uréase catalisando a reação com uréia tornaria a solução alcalina pela liberação de amônia. No outro tubo que se acrescentou a tioureia não se esperava mudança na coloração, já que a uréase é específica para catalisar reações com uréia e não reagem da mesma forma com a tioureia. Entretanto, por erros operacionais na realização do procedimento não foi obtido os resultados esperados.
A eletroforese é utilizada em inúmeros processos de biologia molecular, entre eles:
Ciência forense– para comparar o DNA encontrado no local do crime com o de possíveis suspeitos.
Genética– teste de paternidade, diferenciação de espécies ou linhagens e engenharia genética.
Microbiologia– detecção de diferentes patógenos como vírus, bactérias e fungos.
Bioquímica– detecção da expressão de proteínas. 
Catalisadores são substâncias com a capacidade de acelerar reações químicas, sem participar delas como reagentes. Ou seja: eles participam da reação, aumentam sua velocidade, mas são recuperados inalterados ao final dela. Na maioria das vezes, as velocidades das reações catalisadas por enzimas têm um aumento da ordem de 106 a 1012 vezes em relação às velocidades das reações não catalisadas. 
As enzimas são classificadas de acordo com o tipo de reação que catalisam. Assim, temos: 
	CLASSIFICAÇÃO
	TIPO DE REAÇÃO QUE CATALISA
	EXEMPLOS
	MODO DE ATUAÇÃO
	Oxirredutases
	reações de óxido-redução
	desidrogenase
oxidase
	remove átomos de hidrogênio
adiciona átomos de oxigênio
	Transferases
	transferências de grupos funcionais
	metil transferase
	transfere grupos metil (-CH3)
	Hidrolases
	reações de hidrólise
	lipases
proteases
	quebra lipídios 
quebra proteínas
	Liases
	quebra de ligações duplas
	descarboxilase
	remoce CO2
	Isomerases
	isomerizações
	cis-trans isomerase
	converte formas cis e trans.
	Ligases
	formação de ligações
	sintetase
	combina dois grupos
	 No exemplo acima temos uma substância inicial (sacarose), que é transformada em produtos (glicose + frutose).
 À substância inicial, que é transformada na reação catalisada pela enzima, dá-se o nome de SUBSTRATO. 
 O mecanismo de ação é praticamente o mesmo para todas as enzimas: a enzima forma um complexo com o 
 substrato, a reação desenvolve-se e obtém-se o (s) produto (s). A equação geral do processo descrito pode ser
 representada assim: 
	
	
	
	
	E é nesse ponto que devemos destacar mais uma característica que faz das enzimas moléculas tão interessantes: elas apresentam especificidade notável diante dos substratos e produtos. Esta especificidade é muito maior que a da maioria dos catalisadores químicos. Isso quer dizer que uma dada enzima catalisa uma única reação das várias que um único substrato pode sofrer. Essa especificidade é determinada estreita relação que existe entre a estrutura da molécula enzimática e suas propriedades biológicas: provavelmente, apenas uma fração (denominada sítio ativo) da molécula é responsável pela ligação da enzima ao (s) substrato (s). Diante disso, Emil Fischer propôs, em 1894, a hipótese da chave e fechadura, que diz que a especificidade de uma enzima (fechadura) e do seu substrato (chave) provém da complementaridade das respectivas formas.
CONSIDERAÇÕES FINAIS: Descrever quais são as conclusões da aula, segundo os objetivos descritos no primeiro item e sua aplicabilidade na vida profissional.
	A realização da prática de extração e purificação de DNA; e eletroforese em gel de agarose foi muito importante para a
obtenção de novos conhecimentos. Foi possível identificar todo o material necessário para a realização das técnicas e todos os objetivos propostos foram alcançados com êxito.
Pode-se observar que através de indicadores usados nas reações, estes mostram prováveis faixas de pH.
Modelo Chave/Fechadura que prevê um encaixe perfeito do substrato no sítio de ligação, que seria rígido como uma fechadura.
Como são ácidos ou bases fracas, em meio aquoso os indicadores de pH ligam-se aos íons H+ ou OH- sofrendo alteração de configuração e por possuírem propriedades halacrômicas altera-se também as suas cores.
As alterações de cores foram observadas em todos os testes realizados nesse trabalho.
Na reação de bureta obtivemos mudança de cor para violeta quando há presença de proteína na solução, o teste é positivo. Em soluções sem a presença de proteína a cor é azul-claro, logo o teste é negativo.
No teste de atividade enzimática utilizado com Vermelho de fenol houve mudança de cor na reação, o que pode ser explicado pelo fato do vermelho de fenol perder prótons à medida que o pH aumenta.
Na desnaturação da enzima por calor a alta temperatura fez mudanças na estrutura da enzima devido à quebra das pontes de hidrogênio, afetando suas funções fazendo com que ocorram reações diferentes quando comparada com uma antes de aquecida.
Na Inibição de Enzimas por Sais de Mercúrio foi observado cor na tonalidade laranja devido aos grupos SH presentes no centro ativo se combinaram aos sais de metal não tendo reação pois, a uréase sofreu uma desconformação estrutural e com isso perdeu sua função. Já a cor na tonalidade avermelhada deve-se ao fato de uréase ter reagido com a ureia produzindo amônia, aumentando o pH fornecendo ao indicador a coloração.
Por causa da especificidade de cada enzima para catalisar reações apenas com substratos adequados ao lugar em que ocorre a reação (sito ativo), substratos diferentes não são catalisados pela enzima devido à forma do sitio ativo.
Com a realização desta prática podemos concluir que as enzimas possuem um alto grau de especificidade em relação ao substrato e que fatores como concentração de substrato e da própria enzima estão intimamente ligados a ocorrência e velocidade destas reações de catálise. Além de que, pode-se observar propriedades das enzimas semelhantes aos das proteínas, como a desnaturação em função de altas temperaturas.
A aula foi satisfatória, pois conseguimos realizar a atividade proposta e conclui seque: Os métodos de eletroforese convencionais são baseados na habilidade de um gel separar moléculas, com base no tamanho, sob a influência de um campo elétrico unidirecional. Em contraste, utilizam-se sucessivos campos elétricos alternados que forçam as moléculas a mudarem continuamente a direção de migração. A separação é baseada, provavelmente no fato que as moléculas maiores mudam de direção mais lentamente que as menores. Entretanto, o mecanismo preciso da separação ainda não é totalmente conhecido, embora seja objeto de numerosos estudos. 
OBSERVAÇÕES GERAIS DE PRÁTICAS E RELATÓRIOS
O Projeto Pedagógico do Curso (PCC), provisiona carga horária específica de tele aula e carga horária específica para aula prática, sendo assim, os cronogramas estabelecidos pela coordenação levam em consideração que o aluno deverá comparecer pelo menos 3 vezes na semana ao Polo, uma vez dedicada ao dia da oferta do curso, sendo a presença na tele aula e os outros dois para o desenvolvimento de aula prática, quando necessário; 
O relatório deverá ser desenvolvido individualmente e entregue ao tutor presencial, observando o cronograma disponibilizado pela coordenação de curso;
A coordenação pedagógica do polo também deverá providenciar uma validação do relatório, que poderá ser desenvolvida com um carimbo.
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ALUNO: Viviane APº Ferreira TUTOR: Érica Fabiana Gazola
MATR. 2795593661