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Arlindo Ugulino Netto – MICROBIOLOGIA – MEDICINA P3 – 2008.2 1 FAMENE NETTO, Arlindo Ugulino. MICROBIOLOGIA GENOMA BACTERIANO – MECANISMO GENTICOS DA RESISTNCIA (Professora Socorro Vieira) Para se discutir os mecanismos genticos da resistncia antimicrobiana, deve-se antes conhecer o genoma bacteriano, uma vez que a multiresistência de uma bactéria está ligado à genes cromossomais da mesma. O genoma representa o conjunto do material genético que uma célula apresenta. A organização genômica das bactérias é dinâmica e composta por diferentes modalidades de moléculas de DNA: cromossomo, plasmídios, transposons e bacteriófagos. O cromossomo bacteriano contém todos os genes requeridos para o metabolismo e ciclo vital da bactéria. Plasmídios, transposons e bacteriófagos são entidades moleculares independentes que ocorrem indistintamente em diferentes grupos bacterianos e que funcionam como elementos genéticos acessórios. Os genes que transportam não são essenciais à sobrevivência da bactéria, mas podem condicionar características tais como fatores de virulência, resistência a agentes antimicrobianos, bacteriocinas, toxinas, fixação de nitrogênio e utilização de fontes não usuais de carbono. Tais características adicionais podem ter importância adaptativa em determinadas situações. Todo material genético de uma bactéria, seja constitutivo ou acessório, está em contato direto com o citoplasma. Em processos de divisão (a cada 20 minutos), uma bactéria copia totalmente seus genes para a nova bactéria, o que explica a dificuldade de se controlar processos infecciosos. Cromossomos e plasmídios constituem replicons, ou seja, unidades moleculares capazes de replicação autônoma. Transposons e bacteriófagos não são capazes de replicação autônoma e precisam estar inseridos em um replicon para se duplicarem. A figura acima mostra um mapa gênico de uma célula procariótica. A célula bacteriana tem cerca de 2400 genes codificantes de proteínas necessárias para sua sobrevivência. CLULA PROCARITICA X CLULA EUCARITICA Enquanto a célula eucariótica apresenta todo seu genoma organizado e compartimentalizado por um núcleo (lembrando, é claro, do material genético mitocondrial), o cromossomo bacteriano existe na forma de uma molécula circular única de DNA de cadeia dupla, altamente enovelada e livre no citoplasma. Clulas Procari ticas Clulas Eucari ticas 1. Contém apenas um cromossomo (único e circular) 2. Consiste de uma única molécula de DNA de fita dupla na forma circular 3. Não possui membrana nuclear: o cromossomo se localiza em uma região denominada nucleóide (em que o cromossomo se associa a proteínas). 4. É enrolado, espiralado e de forma altamente compacta - é cerca de 1200 vezes maior que o tamanho da célula 5. É rara a presença íntrons 1. Há mais do que um cromossomo por célula 2. Cada cromossomo consiste em uma única molécula longa de DNA de fita dupla enrolado em agregados de proteínas histonas em intervalos regulares 3. Possui membrana nuclear 4. Apresenta forma linear, e a molécula de DNA é cerca de 10 vezes mais longa 5. Presença marcante de íntrons 6. Mitocôndrias e cloroplastos apresentam material genético. Além do cromossomo uma célula bacteriana pode conter uma ou mais estrutura de DNA chamados plasmídeos - moléculas de DNA de fita dupla menores que os cromossomos e que podem replicar-se independentemente destes. Outra diferença é o cromossomo da célula eucariótica, que é predominantemente constituído por íntons (sequencias não codificadoras) do que por éxons (sequencia codificadora). Já o cromossomo bacteriano apresenta uma grande maioria de exons em relação aos introns (que são quase raros). As bactérias, como já foi dito e será discutido, possuem, além do seu cromossomo único e circular imerso no citoplasma, os seguintes elementos: plasmídeos, vírus e transposons. Arlindo Ugulino Netto – MICROBIOLOGIA – MEDICINA P3 – 2008.2 2 PROCARIOTOS O Reino Monera reúne os organismos procariontes, unicelulares, coloniais ou não, de vida livre ou parasita, autótrofos (fotossintetizantes ou quimiossintetizantes) ou heterotróficos que se alimentam por absorção. Mesmo possuindo uma estrutura e organização celular rudimentar, uma tendência evolutiva desde o primórdio dos seres vivos, essas demonstram um grande potencial biológico, coexistindo em todos os tipos de ambientes, seja terrestre, aéreo ou aquático. Esse Reino compreende as bactérias e algas azuis (atualmente denominadas de cianobactérias). Devido à contribuição da Biologia molecular esse Reino passou a ser classificado em dois sub-reinos de organismos procarióticos bem diferentes: Eubactérias e Arqueas (Archaeobactérias). As arqueobactérias são muito semelhantes às eubactérias e só foram diferenciadas destas há poucas décadas, graças ao desenvolvimento das técnicas de análise molecular. Uma dirença importante entre arqueas e bactérias é quanto a constituição química da parede célular. As arqueas não apresentam, em sua parede celular, o peptidoglicano, constituinte típico das bactérias. As arqueobactérias podem ser dos seguintes tipos: Arqueobactérias metanogênicas Termófilas extremas: vivem em condições extremas de temperatura (600ºC) Halófilas extremas: vivem em condições extremas de salinidade (NaCl a 25%). PLASMDIOS São moléculas extracromossomais circulares de DNA autoreplicativo encontradas em muitas espécies bacterianas e em algumas espécies de eucariotos (ex: o anel de 2-micra em Saccharomyces cereviesiae). São geralmente moléculas de DNA de fita dupla em forma de círculos fechados e passam às células-filha durante a divisão celular. Quando o plasmídio está integrado ao cromossomo, recebe outro nome: epíssomo. OBS1: Os epissomas são plasmídeos que conseguem se integrar no DNA cromossómico do hospedeiro Por esta razão, podem permanecer intactos durante muito tempo, ser duplicados em cada divisão celular do hospedeiro, e transformar- se numa parte básica da sua constituição genética. A maioria das bactérias conhecidas transporta um ou mais tipos de plasmídios. Os genes que transportam não são essenciais à sobrevivência da bactéria, mas podem condicionar características adicionais tais como fatores de virulência, resistência a agentes antimicrobianos, bacteriocinas, toxinas, fixação de nitrogênio e utilização de fontes não usuais de carbono. Muitas das características condicionadas por genes plasmidianos contribuem para a adaptabilidade da bactéria em condições especiais. As bactérias não constroem seus próprios plasmídios, mas os adquirem através do fenômeno da conjugação bacteriana, na qual uma bactéria transportando um plasmídio o transfere para uma outra bactéria, mantendo para si uma cópia deste. REPLICAÇÃO DO PLASMÍDIO A replicação dos plasmídeos pode ser de dois tipos: por replicação de entidades independentes ou por replicação de epíssomo integrado. A replicação do plasmídeo também pode ocorrer em dois momentos: (1) quando a célula bacteriana se divide, o DNA plasmidal também se divide, assegurando que cada célula filha receba uma cópia deste; (2) durante o processo de conjugação, a molécula de DNA replicada pode entrar na célula receptora. TIPOS DE PLASMÍDIO Existem dois grupos básicos de plasmídeos: os conjuntivos e os não-conjuntivos. Os plasmídeos conjuntivos contém um gene chamado tra-gene, que pode iniciar a conjugação, isto é, a troca sexual de plasmídeos com outra bactéria. Os plasmídeos não-conjuntivos são incapazes de iniciar a conjugação e, por esse motivo, o seu movimento para outra bactéria, mas podem ser transferidos com plasmídeos conjuntivos durante a conjugação. Plasmídeos de Fertilidade (F): contém apenas tra-genes. A sua única função é a iniciação da conjugação bacteriana. A bactéria que apresenta o plasmídio F (chamada de F+ ou macho) tem a capacidadede produzir fímbrias associadas na reprodução sexuada com outras bactérias. A bactéria receptora é denominada F-. Plasmídeos de Resistência (R): contém genes que os tornam resistentes a antibióticos ou venenos, ou seja, é responsável pela resistência da bactéria a antimicrobianos. Plasmídeos Col: contém plasmídeos que codificam (determinam a produção de) colicinas, proteínas que podem matar outras bactérias, inibindo o crescimento de outras células que não possuem esse plasmídio. Plasmídeos Degradativos: permitem a digestão de substâncias pouco habituais, como o toluole ou o ácido salicílico, ou até mesmo derivados do petróleo (sendo usados para limpar poluições causadas por vasamento destes produtos). Plasmídeos de Virulência: transformam a bactéria num agente patogénico, estando associado então, a patogenicidade da bactéria. Como por exemplo o plasmídeo Ti, da bactéria Agrobacterium tumefaciens, que é usado atualmente na genética para a produção de plantas transgênicas. Arlindo Ugulino Netto – MICROBIOLOGIA – MEDICINA P3 – 2008.2 3 TRANSPOSONS Transposons so fragmentos de DNA linear. Os transposons so elementos genticos mveis capazes de se inserirem em diferentes pontos do cromossomo bacteriano. Aps inserir-se em um determinado stio do cromossomo, o transposon pode deixar uma cpia neste stio e inserir-se em outro ponto do cromossomo, um fenmeno denominado transposi o. A transposi o ocorre devido presen a, no transposon, de seqncias especficas de DNA denominadas seqncias de inser o (IS). As IS so pequenas sequncias de DNA que codificam a enzima transposase, responsvel pela transposi o. Quando o transposon se liga ao cromossomo da bactria, isso a confere uma maior mutagenicidade (por induzir muta es) bem como o isolamento de parte de seu material gentico (“DNA egosta”). Os transposons codificam uma ou mais protenas que conferem caractersticas como resistncia a drogas antimicrobianas, enterotoxinas e enzimas degradativas. Os transposons possuem genes de resistncias, como por exemplo, a TN1AMP (resistente ampicilina). RECOMBINA O: TRANSFERNCIA GNICA BACTERIANA A maioria das bactrias possui uma nica cadeia de DNA circular. As bactrias, por serem organismos assexuados, herdam cpias idnticas do genes de suas progenitoras (ou seja, elas so clonais). Algumas bactrias tambm transferem material gentico entre as clulas. A transferncia de genes particularmente importante na resistncia antibiticos. A resistncia a antibiticos acontece devido "coloca o" de um plasmdio que vai dar essa resistncia ao antibitico. A maioria das batrias no apresentam reprodu o sexuada, mas podem ocorrer misturas de genes entre indivduos diferentes, o que chamado de recombinação genética. Esse processo leva forma o de novos indivduos com caracterstias genticas diferentes, resultando na mistura de material gentico. Uma bactria pode adquirir genes de outra bactria e mistura-la aos seus de trs maneiras diversas: TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA Ocorre pela absor o de molculas ou fragmentos de molculas de DNA que estejam dipostos no ambiente, proveniente de bactrias mortas e decompostas; a clula bacteriana transformada (receptora) passa a apresentar novas caractersticas hereditrias, condicionadas pelo DNA incorporado. Este no precisa ser de bactrias da mesma espcie; em princpio, qualquer tipo de DNA pode ser capturado se as condi es forem adequadas. Entretanto, um DNA capturado s ser introduzido no cromossomo bacteriano se for semelhante ao DNA da bactria receptora. TRANSDUÇÃO BACTERIANA Consiste na transferncia de segmentos de molculas de DNA de uma bactria para outra. Isso ocorre porque, ao formarem-se no interior das clulas hospedeiras, os baterifagos (vrus) podem eventualmente incorporar peda os do DNA bacteriano. Depois de ser liberados a infectar outra bactria, os bacterifagos podem transmitir a ela os genes bacterianos que transportavam. A bactria infectada eventualmente incorpora em seu cromossomo os genes recebido do fago. Se este no destruir a bactria, ela pode multiplicar-se e originar uma linhagem "transduzida" com novas caractersticas, adquiridas de outras bactrias via fago. CONJUGAÇÃO BACTERIANA Consiste na transferncia de DNA diretamente de uma bactria doadora para uma receptora atravs de um tubo de protena denominado pêlo sexual ou pili, que conecta duas bactrias. Os pili esto presentes apenas em bactrias doadoras de DNA. Quando a recombina o gentica foi descoberta pelo bilogo Joshua Lederberg, pensou-se que se tratava de um processo sexual comparvel ao dos seres eucariontes . Por isso, na poca, as bactrias doadoras de DNA foram denominados machos e as receptoras, fmeas. A continuidade dos estudos mostrou que a capacidade de doar DNA est ligada presen a de um plasmdio denominado F (de fertilidade); bactrias portadoras do plasmdio F, Arlindo Ugulino Netto – MICROBIOLOGIA – MEDICINA P3 – 2008.2 4 denominadas F+, atuam como doadoras de DNA e as que no possuem o plasmdio F atuam como receptoras, sendo chamadas de F-. Hoje sabe-se que o DNA transferido de uma bactria para outra, na conjuga o, quase sempre o plasmdio F. Algumas vezes, porm, um pequeno peda o de DNA cromossmico une-se ao plasmdio e transferido junto com ele na conjuga o. Na bactria receptora pode ocorrer recombina o gentica entre o cromossomo e o fragmento de DNA unido ao plasmdio recebido da bactria doadora. ASPECTOS GENTICOS DA RESISTNCIA BACTERIANA A DROGAS O genoma procarioto e sua fun o determina um dos maiores problemas de sade pblica atual: mecanismo de resistncia antibitico. Para isso, devemos iniciar definindo os seguintes termos: quimioterpicos e antibiticos. Quimioterápico: substncia com a o antimicrobiana produzida por sntese em laboratrio. Antibiótico: substncia de a o antimicrobiana produzida naturalmente por fungos e pelas prprias bactrias. Ex: Penicillium Penicilinas Cephalosporium Cefalosporina Streptomyces Estreptomicina, neomicina, canamicina, tobramicina, eritromicina, etc. Micromonospora Gentamicina, sisomicina Bacilus Polimixinas, bacitracina Chromobacterium Aztreonam OBS2: Admite-se que o “cheiro de chuva” que predomina na terra aps a chuva resultado de geoprodutos liberados pelas bactrias Streptomyces presentes no solo. AÇÃO DOS ANTIMICROBIANOS Bacteriostática: inibe o processo de multiplica o do microorganismo. Bactericida: inibe o crescimento do microorganismo. HISTÓRICO Como se sabe, antibiótico uma substncia que tem capacidade de interagir com microorganismos unicelulares ou pluricelulares que causam infec es no organismo. Os antibiticos interferem com estes microorganismos, matando-os ou inibindo seu metabolismo e ou sua reprodu o, permitindo ao sistema imunolgico combat-los com maior eficcia. O primeiro antibitico fabricado pelo homem foi a penicilina. Alexander Fleming, bacteriologista do St. Mary's Hospital, de Londres, j vinha havia algum tempo pesquisando substncias capazes de matar ou impedir o crescimento de bactrias nas feridas infectadas, pesquisa justificada pela experincia adquirida na Primeira Grande Guerra 1914- 1918, na qual muitos combatentes morreram em conseqncia da infec o em ferimentos profundos e mal-tratados por falta de tratamento adequado. No ano de 1922 Fleming descobre uma substncia antibacteriana na lgrima e na saliva, a qual dera o nome de lisozima. E em 1928 Fleming desenvolveu pesquisas sobre estafilococos, quando descobriu a penicilina. A descoberta da penicilina deu-se em condi es peculiarssimas, gra as a uma seqncia de acontecimentos imprevistos e surpreendentes. No ms de agosto de 1928Fleming tirou frias e, por esquecimento, deixou algumas placas com culturas de estafilococos sobre a mesa, em lugar de guard-las na geladeira ou inutiliz-las, como seria natural, ao retornar ao trabalho, em setembro do mesmo ano, observou que algumas das placas estavam contaminadas com mofo, fato este relativamente freqente. Colocou-as ento, em uma bandeja para limpeza e esteriliza o com lisol. Neste exato momento entrou no laboratrio um seu colega, Dr. Pryce, e lhe perguntou como iam suas pesquisas. Fleming apanhou novamente as placas para explicar alguns detalhes ao seu colega sobre as culturas de estafilococos que estava realizando, quando notou que havia, em uma das placas, um halo transparente em torno do mofo contaminante, o que parecia indicar que aquele fungo produzia uma substncia bactericida. O assunto foi discutido entre ambos e Fleming decidiu fazer algumas culturas do fungo para estudo posterior. O fungo foi identificado como pertencente ao gnero Penicilium, de onde deriva o nome da penicilina dado substncia por ele produzida. Fleming passou a empreg-lo em seu laboratrio para selecionar determinadas bactrias, eliminando das culturas as espcies sensveis sua a o. A descoberta de Fleming no despertou inicialmente maior interesse e no houve a preocupa o em utiliz-la para fins teraputicos em casos de infec o humana at a ecloso da Segunda Guerra Mundial, em 1939. Nesse ano e em decorrncia do prprio conflito, a fim de evitarem-se baixas desnecessrias, foram ento ampliadas as pesquisas a respeito da penicilina e seu uso humano. Em 1935, Gerhard Domark cria em laboratrio a sufa, substncia com atividade antimicrobiana. Em 1940, Sir Howard Florey e Ernst Chain, da Universidade de Oxford, retomaram as pesquisas de Fleming e conseguiram produzir penicilina com fins teraputicos em escala industrial, inaugurando uma nova era para a medicina denominada a era dos antibiticos. Para a II Guerra Mundial, os antibiticos eram vistos como “Balas Mgicas”. Ainda nesse perodo, menos que 1% dos S. aureus estudados eram resistentes a penicilina. Em 1946, 60% dos S. áureos j se apresentavam resistentes penicilina: apresentavam genes produtores de penicilinases, enzimas que quebram o anel β-lactamico da penicilina (responsvel por matar a bactria). Arlindo Ugulino Netto – MICROBIOLOGIA – MEDICINA P3 – 2008.2 5 RESISTÊNCIA BACTERIANA A DROGAS A resistência bacteriana pode ser dar por duas formas: resistência natural (toda a espécie bacteriana é naturalmente resistente a um certo antibiótico. Ex: Escherichia coli não pode ser tratada com benzilpenicilina por ser resistente à essa droga) e resistência adquirida (ao longo de seu desenvolvimento, adquire resistência devido a processos de conjugação, transformação, etc.). O antibiótico não induz resistência. A resistência adquirida é um fenômeno espontâneo da bactéria, sendo os antimicrobianos apenas agentes seletores de amostras resistentes. Isso demonstra que antibióticos devem ser administrado da maneira e intervalos corretos. CAUSAS DA RESISTÊNCIA A capacidade de adaptação ao novo ambiente garante à bactéria variabilidade genética gerada por mutação e mecanismos de transferência. As condições que favorecem a seleção e disseminação de genes de resistência aos antibióticos são: Uso abusivo dos antimicrobianos nos hospitais Venda livre/Aquisição direta pelo doente (Automedicação) Indicação indiscriminada por médicos Uso como aditivo em ração animal A tecnologia do DNA recombinante, que gera organismos transgênicos, pode criar vetores plasmídios resistentes Pressão seletiva natural de muitos antibióticos (fungos e bactérias) Exposição a outros agentes seletivos como mercúrio Fatores atuais: Maior imunodepressão (decorrente da AIDS, quimioterapia anticâncer e maior freqüência de transplantes) Modernos meios de transportes, o que facilita o transporte de pessoas ao redor do mundo, carregando consigo bactérias de variados meios de resistência. OBS3: Mecanismo de Resistência: Versatilidade Genética Aquisição de Novo Dna Mutação e Recombinação Mecanismos ee Tranferência do Material Genético COMO SALVAR OS ANTIMICROBIANOS Para evitar cada vez mais a resistência dos micróbios aos medicamentos, deve-se tomar algumas medidas, tais como: A busca de novos antimicrobianos Modificar ou rejuvenescer drogas já existentes Obtenção de Vacinas por Técnicas Convencionais ou Moleculares Admitir que a resistência bacteriana é um sério problema de saúde pública (Fenótipo=Genótipo + Ambiente) Adotar ações que reduzam o uso dos antimicrobianos: Só usá-los se indispensável (Diagnóstico); Realizar antibiogramas; Programas de vigilância hospitalar e comunitária; Usar vacinas que aumentem as defesas do organismo e reduzam as necessidades de drogas. OBS4: A Anvisa, com o intuito de evitar a prescrição de antibióticos sem parcimônia, instituiu, desde 2010 (por meio da RDC Nº 44, DE 26 DE OUTUBRO DE 2010), preconiza no DOU, que a prescrição de antibióticos seja feita a partir do preenchimento de Receituário de Controle Especial, o que exige duas vias, dados gerais do paciente e carimbo do médico responsável. Arlindo Ugulino Netto – MICROBIOLOGIA – MEDICINA P3 – 2008.2 6 ANTIBIOGRAMA Um antibiograma é um ensaio que mede a susceptibilidade/resistência de uma bactéria a um ou mais agentes antimicrobianos. Seu objetivo é tanto a análise do espectro de sensibilidade/resistência a drogas de uma bactéria quanto a determinação da concentração mínima inibitória. O Ágar de Mueller Hinton é recomendado pelo U.S. Food and Drug Administration (FDA) e pela Organização Mundial da Saúde (OMS) para o teste de sensibilidade/resistência a antibióticos de bactérias Gram positivas e Gram negativas, aeróbicas ou anaeróbicas facultativas, comumente encontradas em alimentos e espécimes clínicos. O teste, denominado antibiograma, é feito utilizando-se discos de difusão antibióticos depositados sobre a superfície do meio onde se inoculou, por espalhamento, uma amostra de uma cultura bacteriana previamente crescida em meio líquido. Material: Pipetador com volume fixo de 100 µl, ponteiras esterilizadas, alça de Drigalski esterilizada, placas de Petri contendo meio Mueller Hinton, discos de difusão de antibióticos, cultura bacteriana em Caldo Nutriente ou meio LB. Procedimento : Semear, por espalhamento com alça de Drigalski ou com uma zaragatoa esterilizada, uma alíquota de 100 µl da cultura bacteriana em uma placa de Petri contendo meio Ágar de Mueller Hinton. Em seguida, depositar discos de papel filtro impregnados, separadamente, com quantidades determinadas de um antibiótico específico sobre a superfície do meio em disposição ordenada. Incubar a placa, invertidas, a 37ºC por cerca de 24 horas. Resultados: A formação de um halo transparente sobre a superfície do meio, ao redor de um disco de antibiótico, indica uma região com ausência de crescimento bacteriano, revelando a ação inibitória do agente antimicrobiano sobre a bactéria ensaiada.
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