TRAB_Biomol (PCR)

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Prof. Rita Martins
Bianca Ribeiro, Carina Batista, Mariana Arigoni, Milena Sales, Renata Ferreira
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Artigo:
Diagnóstico pré-natal da toxoplasmose no líquido amniótico através da técnica de PCR
A Toxoplasmose e o 
diagnóstico fetal
A ​​toxoplasmose é uma das infecções mais comuns em todo o mundo. A maioria dos casos é assintomática, exceto em indivíduos imunodeprimidos e fetos, que podem ser seriamente danificados. Diagnóstico pré-natal deve ser feita o mais rapidamente possível uma vez que o tratamento da mãe pode minimizar sequelas fetal. 
Objetivo do estudo
O objetivo deste estudo foi testar a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) em 86 amostras de líquido amniótico de mulheres que apresentaram soroconversão durante a gravidez.  
Avaliar a sensibilidade, especificidade e valor preditivo negativo (VPN) da técnica do PCR no LA para o diagnóstico de toxoplasmose congênita em mulheres com infecção primária durante a gestação	
Embora PCR não deve ser utilizado como único teste diagnóstico da toxoplasmose congênita, é um método promissor e merece mais estudos para aumentar a sua eficácia. 
A técnica PCR
É uma das técnicas mais empregadas nas diversas áreas do diagnóstico molecular. A sua introdução resultou em grande revolução tecnológica, permitindo a amplificação de uma seqüência contida em uma amostra de DNA, possibilitando a adoção de métodos para a análise de uma grande variedade de amostras.
Histórico
Karys Mullis descreveu a PCR no final da década de 1980.
Em 1989, a Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation patenteou este processo .
O Prêmio Nobel da Química foi atribuído à Karys Mullis pelo seu trabalho em 1993.
Atualmente, método PCR é usado habitualmente nos laboratórios de investigação médica e biológica para uma variedade de tarefas.
APLICAÇÕES
Diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas
Identificação de patógenos 
Paternidade
Estudo de expressão gênica
Investigação forense
AS PRINCIPAIS TÉCNICAS
Entre as principais técnicas resultantes de modificações da reação em cadeia da polimerase, podemos citar:
 RT-PCR (utiliza uma enzima chamada transcriptase para o estudo de vírus de RNA e análises de expressão gênica.)
Nested PCR (visa aumentar a sensibilidade e especificidade do método.)
Multiplex PCR (reação de amplificação desenhada para detectar múltiplas seqüências-alvo numa mesma amostra.)
TÉCNICAS 
Para a realização da PCR, utiliza-se:
 Uma enzima termoestável ( TAQ DNA polimerase) 
 Um par de oligonucleotídeos iniciadores (primers) 
Nucleotídeos (bases nitrogenadas
 #Amplifica a região de interesse a partir de uma pequena quantidade de DNA#
PCR a partir de primers randômicos (utiliza seqüências curtas de oligonucleotídeos para amplificar regiões repetitivas do DNA genômico e é bastante empregado em estudos epidemiológicos)
PCR em tempo real.(permite a amplificação e a detecção ocorram num sistema fechado, sendo necessário um termociclador que possua sistema de de emissão de fluorescência. Esta técnica é empregada para quantificação de amostras, como para testes de carga viral e monitoramento de doença residual mínima.)
Esta amplificação ocorre durante repetidos ciclos de temperatura, a saber: 
95°C (desnaturação do DNA)
50°C a 70°C para hibridização dos oligonucleotídeos às seqüências-alvo e 
72°C (síntese do DNA, em equipamentos chamados de termocicladores.)
 #O DNA amplificado pode, ser separado e visualizado em géis de agarose (Brometo de Etídeo – corante intercalado) ou poliacrilamida (Nitrato de Prata)#
PASSOS DA PCR
O Estudo
Amniocentese
Punção da cavidade 
Amniótica com
 o objetivo 
de obter
 amostra de LA
Realizada a partir 
de 15 semanas
O Estudo
O DNA foi amplificado utilizando iniciadores externos e, em uma segunda etapa, os iniciadores internos, num sistema de PCR aninhada. As amostras também foram inoculados em ratinhos e o recém-nascido foram avaliadas por T. Gondii sorologia, crânio de raios-x, ultrassom transfontanelar, exame de fundo de olho, punção lombar e exame clínico. 
Pacientes e o Método
Foram estudadas 86 amostras de líquido amniótico de mulheres nas quais adquiridos T. gondii infecção durante a gravidez ocorreu. A infecção foi detectada durante um programa de triagem sorológica de rotina realizada na Unidade de pré-natal do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais (HC-UFMG) e Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte, Minas Gerais. 
Inicialmente sorologia (ELISA, ELIFA, imunofluorescência) foi realizada em cada trimestre de gestação. No caso de um resultado positivo, era então realizada mensal. 
Para o diagnóstico de infecção do feto, parte do fluido amniótico foi submetido a PCR e a outra parte foi inoculada em ratinhos. 
Após o nascimento, os bebês foram acompanhados periodicamente pela equipe do infectologista do HC-UFMG. A infecção congênita foi confirmada (sinais e / ou sorologia clínicos) ou descartados (sinais clínicos sorologia ausente e negativo) após pelo menos seis meses de follow-up
Extração do DNA
Amplificação do DNA
Resultado
A partir dos 86 casos de toxoplasmose aguda gestacional estudada, a transmissão materno-fetal ocorreu em 8 (9,3%). As manifestações clínicas dos recém-nascidos infectados eram variáveis. 
PCR no líquido amniótico foi positiva em cinco dos oito casos de transmissão materno-fetal (três casos falso-negativos). No grupo sem ). No grupo sem transmissão fetal, a PCR foi positivo em duas (dois falsos-positivos) 
 Nas amostras positivas por PCR (cinco resultados corretos e duas falso-positivo), em apenas um caso o resultado foi alcançado após a primeira amplificação; em todos os outros, o segundo passo foi necessário. Isto ocorreu quando o mesmo par de iniciadores (internas) foi utilizada para ambas as amplificações ou quando o sistema exterior e interior (neste PCR) foi aplicado.
Bibliografia
Autores do Estudo:
Vidigal, Paula Vieira Teixeira (Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Medicina. Departamento de Anatomia Patológica e Medicina Legal);
Santos, Daniel Vítor Vasconcelos (Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Medicina. Departamento de Anatomia Patológica e Medicina Legal);
Castro, Flávia Cipriano (Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Medicina. Departamento de Ginecologia e Obstetrícia);
Couto, Júlio César de Faria (Santa Casa de Misericórdia);
Vitor, Ricardo Wagner de Almeida (Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. Departamento de Parasitologia);
Brasileiro Filho, Geraldo (Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Medicina. Departamento de Anatomia Patológica e Medicina Legal).
 ​​Site de referência
Vidigal, Paula Vieira Teixeira; Santos, Daniel Vítor Vasconcelos; Castro, Flávia Cipriano; Couto, Júlio César de Faria; Vitor, Ricardo Wagner de Almeida; Brasileiro Filho, Geraldo. O DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL DA TOXOPLASMOSE FLUIDO AMNIÓTICO POR PCR. Disponível em: < http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0037-86822002000100001#back1 >. Acesso em 19 junho de 2015.