Zika Virus Impairs Neurogenesis and Synaptogenesis Pathways in Human Neural Stem Cells and Neurons

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O Zika vírus prejudica as vias da neurogênese e sinaptogênese em células-tronco
neurais humanas e neurônios
Introdução
O Zika vírus (ZIKV) é um Flavivírus que foi isolado pela primeira vez em
primatas não humanos, em 1947 na Floresta ZIKA, em Uganda. Embora os mosquitos
da espécie Aedes sejam considerados os principais transmissores, foram descritas
formas sexuais e transplacentárias de transmissão. Desde a década de 1960 até um
passado recente, a infecção por ZIKV era descrita como assintomática ou associada a
conjuntivite, febre, erupção maculopapular e artralgia. No entanto, recentemente, a
infecção por ZIKV foi associada a uma síndrome congênita em recém-nascidos
chamada Síndrome Congênita do Zika (CZS), que é caracterizada por um espectro de
malformação congênita incluindo microcefalia, calcificações intracranianas,
anormalidades oculares ou outras anormalidades congênitas relacionadas ao sistema
nervoso central. Embora tenham sido relatados distúrbios pulmonares e
musculoesqueléticos, o efeito do ZIKV no sistema nervoso é a característica mais
pronunciada na cepa que circula no Brasil, caracterizando uma nova cepa circulante
denominada de ZIKV-BR. De fato, as células progenitoras neurais (NPC) parecem ser
a principal população afetada pelo ZIKV, com consequente morte celular,
comprometimento da progressão do ciclo celular, diferenciação prematura e divisão
celular defeituosa, levando à depleção de progenitores neurais da camada cortical.
Apesar dos recentes esforços para entender o efeito do ZIKV na biologia
neuronal, as vias envolvidas na fisiopatologia da doença, promovidas por diferentes
cepas em diversos indivíduos, ainda são pouco compreendidas, limitando o
desenvolvimento de opções terapêuticas. Metodologias ômicas abrangentes podem
auxiliar na decifração dessas redes complexas e, especialmente, como elas podem
interagir para afetar o resultado da doença.
Aqui, aplicamos proteômica baseada em espectrometria de massa combinada com
abordagens de microscopia e biologia celular para caracterizar vias moleculares
alteradas em NPCs infectados pela cepa de ZIKV-BR. O efeito da cepa Africana,
ZIKV MR766 (ZIKV-AF), em NPC também foi avaliado. Uma comparação direta
entre a infecção da NPC por ZIKV-BR e ZIKV-AF revelou vias reguladas e fenótipos
específicos da linhagem. Além disso, a análise de neurônios diferenciados de
células-tronco exibiu comprometimento da neurogênese e sinaptogênese na infecção
pelo ZIKV, revelando que os mecanismos sob malformações do SNC estavam além
da morte celular. Em conjunto, nossos resultados destacam os efeitos da infecção pelo
ZIKV no SNC em desenvolvimento, como um mecanismo molecular dinâmico e
abrangente para a malformação cerebral por ZIKV-BR.
Material e Métodos
Sujeitos do estudo
Os sujeitos foram recrutados pelo Projeto Fada dos Dentes (Universidade de São
Paulo - USP), após aprovação do Comitê de Ética do Instituto de Biociências
CEP-ICB/USP (Protocolo CEP/ICB-USP 1001). Após uma descrição completa do
estudo, os pais forneceram um consentimento informado por escrito. A linhagem
celular usada neste estudo foi derivada de um doador caucasiano e foi descrita
anteriormente.
Cultura de Células
Células-tronco de dentes decíduos esfoliados humanos (SHED) foram isoladas,
caracterizadas e reprogramadas como relatado anteriormente. As colônias de células
estaminais pluripotentes induzidas (iPSC) foram plaqueadas em placas revestidas com
matrigel (BD Biosciences) e mantidas durante 5 dias com meio mTSeR (Stem Cell
Technologies). No quinto dia, o meio foi mudado para meio N2 (meio DMEM/F12
suplementado com suplemento 1×N2 - Invitrogen) com duplo inibidor SMAD 1μM
de dorsomorfina (Tocris) e 10 μM de SB431542 (Stemgent), por 48 h. Após 2 dias
nesta condição, as colônias foram removidas da placa e cultivadas em suspensão
como corpos embrióides (EBs), durante 5 dias a 90 rpm, em meio N2 com os
inibidores duplo de SMAD. Os EBs foram plaqueados em placas de matrigel com
meio NGF composto de: meio DMEM/F12, suplementado com 0,5×N2, 0,5×
suplemento Gem21 (Gemini Bio-products), 20 ηg/mL de FGF2 e 1%
penicilina/estreptomicina. As rosetas emergidas foram escolhidas manualmente,
dissociadas e plaqueadas em poliOn e laminina (10 μg/mL de poli-ornitina e 2,5
μg/mL de laminina). A população de NPCs obtida foi expandida usando meio NGF.
O cariótipo de bandeamento G foi realizado em todos os NPCs pelo Hospital Infantil
de Los Angeles (Los Angeles, CA, Estados Unidos). Linhagens celulares de
cariótipos anormais foram descartadas. Para diferenciar NPCs em neurônios, uma
placa confluente foi tratada com 10 μM de inibidor ROCK por 48h (Y-27632,
Calbiochem), na ausência de FGF, com mudanças regulares de meio a cada 4 dias,
por um total de 28 dias. Todas as culturas foram incubadas a 37 °C à 5% de CO2 com
alta umidade.
Infecção por ZIKV in vitro
As preparações virais usadas aqui foram descritas anteriormente. NPCs e
neurônios foram infectados com 1 MOI de ZIKV-BR, ZIKV AF e MOCK (controle
sem vírus). Para adsorção viral, as células em monocamada foram incubadas durante
1h a 4°C com agitação suave a cada 10 min. Em seguida, o inoculo foi removido e as
células foram lavadas uma vez com PBS. O meio de cultura foi adicionado a cada
poço e as células foram incubadas a 37 °C e 5% de CO2. 24h após a infecção, as
NPCs foram raspadas e mantidas sob agitação para formar neuroesferas 3D (NS),
durante a duração dessa experiência. Medidas do diâmetro das neuroesferas de NPCs
foram realizadas nas condições infectadas e MOCK. One-way ANOVA com teste de
comparação múltipla de Tukey foi usado para identificar as comparações
estatisticamente significativas. Valor de p ajustado ≤ a 0,05. ∗ ∗ ∗ Valor de p
ajustado ≤ de 0,001. Ns, não significativo com valor de p ajustado > de 0,05.
Além disso, para avaliar se o ZIKV era capaz de causar comprometimento da
neurogênese ou da sinaptogênese, as NPCs em monocamada foram infectadas com 1
MOI e diferenciadas em neurônios por 28 dias. Para controles MOCK, o mesmo
volume de sobrenadante foi adicionado a cada experimento, e os mesmos
procedimentos foram seguidos.
PCR em tempo real
O RNA foi extraído do sobrenadante das células, utilizando o reagente TRIzol,
seguindo as instruções do fabricante (Invitrogen). Todo o sedimento de RNA foi
ressuspendido em 30 ul de água destilada isenta de RNase, quantificado usando um
espectrofotometro NanoDrop (NanoDrop Technologies) e armazenado a -80 °C. O
conjunto de primer/sonda específica para ZIKV foi sintetizado pela Sigma Life
Science, com 5- FAM como corante repórter para a sonda. O conjunto de
primers/sonda de ZIKV 835, ZIKV 911c e ZIKV 860-FAM já foram descritos
anteriormente. A reação em tempo real foi realizada com 10 μL de cada amostra e 10
μL dos reagentes One-Step RT-PCR AgPath-IDTM (Applied Biosystems). A
amplificação foi feita em um sistema de PCR em tempo real da Applied Biosystems
7500 e envolveu ativação a 45 °C por 15 min, 95 °C por 15 min seguido por 40 ciclos
de amplificação de 95 °C por 15s, 60 °C por 15s e 72 °C por 30s. Os dados foram
analisados usando o software SDS da Applied Biosystems.
Preparação das Amostras para Proteômica Baseada em Espectrometria de
Massa
Digestão Enzimática de Proteína
Os sedimentos celulares foram ressuspensos em tampão de desnaturação
contendo 6 M de ureia, 2 M de tioureia, 50 mM de bicarbonato de trietilamónio
(TEAB) e inibidores de protease e fosfatase. As proteínas extraídas foram reduzidas a
uma concentração final de 10 mM de DTT durante 30 min em temperatura ambiente e
subsequentemente alquiladas em 40 mM de iodoacetamida (IAA) durante 30 min no
escuro. A solução foi incubada à temperatura ambiente durante 3 h após a adição de
Endoproteinase Lys-C(10μg). Subsequentemente, a concentração de ureia foi diluída
para menos de 1 M e a digestão de proteínas foi completada com a adição de tripsina
a 2% (w/w) durante a noite, à temperatura ambiente. As amostras foram acidificadas
para ácido fórmico a 1% e centrifugadas a 14.000 x g durante 10 min para parar a
digestão com a tripsina e remover o material insolúvel (por exemplo, lípidos). O
sobrenadante foi coletado e seco antes da dessalinização na microcoluna de fase
reversa POROS Oligo R3. A quantificação de proteínas e peptídeos foi realizada
utilizando quantificação fluorométrica, QubitTM (Thermo Fisher Scientific). Um total
de 50 μg de péptidos de cada amostra de urina foram diluídos para uma concentração
final de 100 mM de TEAB e marcados com reagente de rotulagem TMT10plex
(Thermo Fisher Scientific), de acordo com as instruções do fabricante. Após os
péptidos marcados terem sido combinados, uma aliquota de 50 μg foi dessalinizada
numa microcoluna de fase reversa da POROS Oligo R3 e os péptidos eluídos foram
secos por centrifugação a vácuo para produzir a fração peptídica total.
Cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC)
O péptido total foi reconstituído a 90% de ACN, 0,1% de TFA e injetado numa
coluna de HPPLC TSKgel Amide-80 HILIC (Tosoh, 5 μm) 320 μm × 170 mm μH,
utilizando o sistema Agilent 1200 HPLC. Ambas as amostras foram eluídas utilizando
um gradiente de 90 a 60% de ACN, 0,1% de TFA por 42 min a uma taxa de fluxo de
6 ul/min. As frações foram automaticamente recolhidas a intervalos de 1 min após
detecção por UV a 210 nm e as frações foram combinadas para um total de 11 frações,
de acordo com a detecção por UV. Todas as frações foram secas por centrifugação a
vácuo.
Cromatografia Nano-Líquida de Fase Reversa/Espectrometria de Massa
Tandem (nLC-MS/MS)
Cada fração de HILIC foi ressuspensa em 0,1% de FA e os péptidos foram
carregados numa pré-coluna (2 cm × 100 μm de diâmetro interno) utilizando um
sistema Easy-nanoLC (Thermo Fisher Scientific) e separados por um gradiente de 3 a
28% de solvente B em 100 min, 28-45% em 20 min, 45-100% em 5 min e 100% em 8
min. (A = 0,1% FA; B = 90% ACN, 0,1% FA) a um fluxol de 250 nL/min numa
coluna analítica Reprosil-Pur C18-AQ (17 cm x 100 μm, 3 μm de diâmetro interno).
O sistema Easy-nanoLC foi conectado online a um espectrômetro de massa QExactive
HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific). operando em modo
iônico positivo e usando aquisição dependente de dados. O Orbitrap adquiriu a
varredura completa da MS com um valor alvo de AGC de 3 × 106 íons e um tempo
máximo de preenchimento de 100 ms. Cada escaneamento de MS foi adquirido em
resolução de 120.000 com um intervalo de massa de 400-1600 Da. Os 10 íons
peptídicos mais abundantes foram selecionados para fragmentação de HCD (energia
de colisão: 29). A fragmentação foi realizada a uma resolução de 60.000 para um alvo
de 1×105 e um tempo máximo de injeção de 200 ms, usando uma janela de
isolamento de 1,2 m/z, exclusão dinâmica de 30 s e fixação da primeira massa a 110
m/z.
Pesquisas de banco de dados e análises de bioinformática
Dados brutos de experimentos de proteômica DDA de larga escala foram
processados usando o Proteome Discoverer v2.1.1.21 (Thermo Fisher Scientific) e
pesquisados em um banco de dados de referência, o human Uniprot (lançamento em
abril de 2016, 20.201 sequências), incluindo a sequência de poliproteínas do genoma
do MR766 ZIKV e contaminantes comuns, usando a versão 2.2.04 do servidor
Mascot (Matrix Science Ltd.) e o servidor Sequest HT. Pesquisas de banco de dados
foram realizadas com os seguintes parâmetros: tolerância de massa precursora de 10
ppm, tolerância de massa iônica do produto de 0,02 Da, permitindo duas clivagens
para tripsina. Carbamidometilação de cisteína e marcação de TMT10plex para lisina e
N-terminal como modificação fixa. As modificações variáveis foram estabelecidas
como segue: Oxidação da Metionina, acetilação da proteína N-terminal e
desamidação da asparagina. O algoritmo percolador foi usado para selecionar
peptídeos com FDR <1% e um valor q de até 0,01. A quantificação foi realizada
usando o fluxo de trabalho do Proteome Discoverer, “quantificando íons repórter” e
realizada nos valores de log2 das abundâncias peptídicas normalizadas.
Três repetições biológicas foram consideradas para a análise estatística
quantitativa e todas as proteínas identificadas com dois ou mais peptídeos foram
processadas usando Perseus v1.5.3.2. A análise de componentes principais (PCA) foi
realizada como uma abordagem exploratória de análise de dados em todas as
proteínas identificadas com dois ou mais peptídeos únicos. A análise quantitativa foi
realizada nos valores log2 das abundâncias normalizadas. Proteínas
significativamente reguladas de comparações pareadas foram avaliadas pela análise
do teste t, enquanto a regulação entre três condições foi acessada pela ANOVA,
ambas seguidas pela correção de Benjamini-Hochberg ao nível de significância de 5%.
O termo “up-regulated” é usado para descrever proteínas e peptídeos mais abundantes
em uma comparação, enquanto “downregulated” se refere àqueles menos abundantes.
Dados específico de 253 proteínas associadas à microcefalia foram extraídos do banco
de dados human Uniprot.
As proteínas reguladas diferencialmente foram analisadas usando o software
Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Qiagen). Vias Overrepresented, reguladores a
montante e funções biológicas e celulares foram derivadas da INGENUITY Pathway
Analysis. As redes de interação proteína-proteína foram construídas usando o software
STRING com o parâmetro High confidence (0,700), carregado no Cytoscape (versão
3.5.1), seguido de análise de enriquecimento com o pUG-in BINGO (versão 3.0.3)
com 5% de FDR. Ontologia gênica, análise de enriquecimento de vias e doença
também foram realizadas com a função ToppFun do pacote toppGene, com correção
de FDR de 1%.
Análise do monitoramento da reação paralela
A monitoração da reação paralela foi realizada no sistema Easy-nanoLC
conectado online a um espectrofotômetro de massas, o QExactive HF
Quadrupolo-Orbitrap Híbrido (Thermo Fisher Scientific), operando em modo de íon
positivo. O gradiente de cromatografia de fase reversa foi de 3 a 28% de solvente B
por 52 min, 28-47% de B em 5 min, 45-100% de B em 5 min e 100% de B em 8 min.
A varredura completa da MS foi adquirida com resolução de 120.000, alvo AGC 3 ×
106, tempo máximo de injeção de 100 ms e faixa de massa de 150 a 2000 Da. A
fragmentação HCD foi realizada usando uma lista de inclusão com os seguintes
parâmetros: 60.000 para um alvo de 2 × 105 e um tempo máximo de injeção de 100
ms usando uma janela de isolamento de 1,2 m/z e energia de colisão de 29, primeira
massa fixa de 110 m/z .
Análise de dados PRM-Like
Os arquivos brutos foram importados para o MaxQuant versão 1.5.2.8 e o
buscador de banco de dados Andromeda foi usado para pesquisar espectros de
MS/MS em um banco de dados composto pelo banco de dados Uniprot Human
Protein Database (lançado em abril de 2016; 20.201 entradas), com tolerância de 4.5
ppm para MS e 20 ppm para MS/MS. O íon repórter MS2: 10Tplex TMT foi incluído
nos parâmetros de pesquisa e a especificidade enzimática foi definida para tripsina,
com um máximo de duas clivagens perdidas. O íon repórter MS2: 10Tplex TMT foi
incluído nos parâmetros de pesquisa e uma especificidade enzimática foi definida,
com um máximo de duas clivagens perdidas. A normalização foi realizada dividindo a
intensidade de íons repórter de cada peptídeo alvo, pela soma das respectivas
intensidades de íons repórter dos dois peptídeos ACTB. A análise do teste T foi
realizada entre MOCK (n = 3) vs. ZA (n = 3) e MOCK (n = 3) vs. ZB (n = 3) e ovalor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Imunofluorescência
As células foram fixadas utilizando paraformaldeído a 4% em PBS (USB
Corporation) durante 15 min à temperatura ambiente. Após a lavagem, as células
foram permeabilizadas com Triton X-100 a 0,1% (Promega) e diluídas em dPBS
durante 15 min. Após o bloqueio com 2% de BSA durante 4h, os anticorpos primários
(descritos abaixo) foram incubados durante a noite a 4 °C e no dia seguinte os
anticorpos secundários (Life Technologies) foram adicionados e mantidos durante 1h
à temperatura ambiente. As células foram lavadas e o núcleo foi corado com DAPI.
As lâminas foram montadas usando o reagente Pro-Long antifade Gold (Invitrogen).
Quantificação de punctas Neuronais
As células neuroprogenitoras foram diferenciadas conforme descrito
anteriormente. Após 4 semanas em cultura, as células foram fixadas e coradas com
SYN1 (proteína pré-sináptica) e Homer1 (proteína pós-sináptica), juntamente com
MAP2 (Proteína 2 associada a microtúbulos, uma proteína neuronal), para
identificação de células. As imagens foram tiradas a 63 × e a puncta sináptica foi
caracterizada por proteína pré-sináptica e co-localização de proteína pós-sináptica. A
quantificação de puncta foi realizada usando o número considerando de puncta por
comprimento de neurite. Cinco experimentos independentes foram realizados e as
estatísticas do teste t foram aplicadas (∗ ∗ p-valor ≤ 0,01).
Resultados e Discussão
As cepas ZIKV-AF e ZIKV-BR induzem respostas celulares diferentes em NPCs
infectadas
Para identificar as vias moleculares alteradas nas células do SNC afetadas pela
infecção pelo ZIKV, geramos células progenitoras neurais humanas (NPCs) e
neurônios das iPSCs e as infectamos com ZIKV-BR e a cepa MR-766 (ZIKV-AF)
(Figura 1). As NPCs foram cultivadas como neuroesferas 3D (NS) e uma abordagem
abrangente de proteômica baseada em MS foi aplicada após 96 h de exposição ao
ZIKV-AF, ZIKV-BR (1 MOI) ou MOCK (Figura 2A). Um total de 6.080 proteínas
foram identificadas e 4.579 proteínas foram quantificadas com dois ou mais peptídeos,
baseado na intensidade do íon repórter TMT, antes da análise estatística. Todas as
proteínas quantificadas foram primeiramente exploradas pela análise de componentes
principais (PCA) que exibiu três clusters distintos de acordo com sua variação de
abundância (Figura 2B). A comparação quantitativa relativa mostrou 935 proteínas
diferencialmente reguladas entre NS MOCK, NS ZIKV-BR e NS ZIKV-AF (FDR
<5%). Essas mudanças são independentes da taxa de infecção, que foi similar entre as
duas linhagens (Figura 2C). A análise de agrupamento hierárquico não supervisionado
de proteínas reguladas, mostrou perfil de proteína distinto entre NS MOCK e NS
ZIKV-BR, enquanto NS ZIKV-AF apresentou um perfil discreto com pequena
variação de proteína (Figura 2D). De fato, o ZIKV-AF não tinha nenhuma proteína
significativamente regulada em comparação com o MOCK. ZIKV-AF foi a primeira
cepa isolada e inicialmente usada para testar a capacidade do vírus de infectar NPCs e
neurônios imaturos in vitro. Independentemente de sua capacidade de induzir a parada
do crescimento celular, as respostas moleculares causadas pelo ZIKV-AF contrastam
com aquelas obtidas pelo ZIKV em surtos mais recentes. De fato, antes dos surtos
mais recentes relatados nas ilhas do Pacífico e nas Américas, os isolados africanos do
ZIKV foram descritos como uma infecção leve, sem associação com malformações
congênitas.
Figura 1 - Impacto da infecção por ZIKV na regulação das proteínas neuronais
revelada pela abordagem proteômica, baseada em espectrometria de massa.
Legenda: Fluxo de trabalho de proteômica abrangente aplicado para a caracterização da regulação de
proteínas da infecção pelo ZIKV no neurodesenvolvimento e na resposta do hospedeiro. As NPCs
derivadas de iPSC humanas foram infectadas e cultivadas como neuroesferas (3D) por 96h. Em
paralelo, as NPCs infectadas com ZIKV-BR foram diferenciadas em neurônios (2D) por 28 dias. Após
a extração das proteínas, adotou-se a estratégia de marcação química (TMT10plex) seguida de
fracionamento com HILIC e análise por nLC-MS/MS. Esta abordagem possibilitou o estudo da
regulação de proteínas na infecção viral, para distinguir as assinaturas moleculares da infecção por
ZIKV-AF e ZIKV-BR, avaliando a influência do hospedeiro na regulação da proteína e o efeito do
ZIKV-BR sobre o desenvolvimento neurológico in vitro.
Figura 2 - (A) Microscopia de imunofluorescência representativa de neuroesferas
infectadas por MOCK e ZIKV-BR. DAPI (azul), ZIKV (verde) e SOX2 (vermelho).
(B) A análise dos principais componentes de todas as proteínas quantificadas a partir
de neuroesferas humanas revela diferentes regulações proteicas entre as cepas virais.
(C) Carga viral detectada pelo RT-qPCR. (D) Agrupamento hierárquico de proteínas
reguladas após 96 horas de exposição ao ZIKV-BR, ZIKV-AF ou MOCK (FDR
<5%).
Um estudo filogenético do ZIKV pode lançar alguma luz sobre a evolução da
doença. Como relatado anteriormente, cepas pertencentes à linhagem asiática foram
associadas à CZS. Além disso, um estudo associou a microcefalia a uma única
mutação na cepa asiática de ZIKV.
Além disso, foi sugerido um componente etiológico autoimune para o fenótipo
CZS, já que a resposta imune antiviral poderia potencialmente reagir de forma
cruzada com proteínas humanas baseadas em peptídeos comuns e com a poliproteína
de ZIKV-AF. Uma vez que a reatividade cruzada após a infecção do patógeno poderia
gerar resposta auto-imune. Oligopeptídeos in silico gerados e compartilhados entre
136 poliproteínas das cepas do ZIKV e proteínas humanas associadas à microcefalia
foram avaliados. Um total de 13 linhagens africanas compartilharam 341
oligopeptídeos, enquanto 126 linhagens asiáticas compartilharam 3.243
oligopeptídeos com proteínas humanas envolvidas na microcefalia. Oligopeptídeos
específicos foram associados às diferentes cepas do ZIKV, destacando uma resposta
específica da cepa (Figura 3A). Além disso, as análises de agrupamento hierárquico
revelaram que as sequências hexaméricas compartilhadas eram informativas para
discriminar as principais linhagens de ZIKV: asiática e africana (as setas na figura
indicam os nós), apontando uma estrutura filogenética nos oligopeptídeos
compartilhados entre as linhagens de Zika e as proteínas humanas da microcefalia
(Figura 3B). Curiosamente, de acordo com o banco de dados do IEDB4, parte dos
epítopos compartilhados foi atribuído a proteínas humanas associadas à resposta
imune do DENV (Figura 3C). Como o ZIKV-AF não apresentou alteração estatística
significativa em uma comparação pareada (NS ZIKV-AF vs. NS MOCK), nós nos
concentramos nas vias reguladas durante a infecção por ZIKV-BR em NS.
Figura 3 - (A) As linhagens de ZIKV-BR e ZIKV-AF possuem diferentes epítopos
que correspondem a proteínas relacionadas à microcefalia humana. (B) Perfil
filogenético de ZIKV-AF (linha azul) e ZIKV-BR (linha vermelha) baseado em
sequências de oligopeptídeos hexaméricos compartilhados com proteínas da
microcefalia humana. (C) Lista de epítopos selecionados e respectivas proteínas
humanas mostram que parte dos epítopos partilhados foi atribuído a proteínas
humanas associadas a resposta imunitária de DENV, de acordo com a base de dados
do IEDB.
ZIKV-BR Promove Maior Expressão de Proteína Diferencial e Ativação de
Maquinaria de Transcrição Viral em Neuroesferas Infectadas
Com foco no efeito do ZIKV-BR sobre as neuroesferas de NPCs, a comparação
entre as células infectadas com ZIKV e MOCK mostrou 897 proteínas reguladas,
sendo 466 positivas e 431 negativas (Figura 4A). A distribuição da expressão protéica
regulada, de acordo com sua função ou localização, mostrou que as proteínasmitocondriais, histonas e ribossômicas eram reguladas positivamente, enquanto as
proteínas de choque térmico eram reguladas negativamente. A análise de Ontologia
Genética mostrou “dobramento de proteínas” como o Processo Biológico mais
enriquecido entre as proteínas downregulated, enquanto “expressão gênica viral” e
“transcrição viral” estavam entre os Processos Biológicos mais enriquecidos de
proteínas up-regulated (Figura 4B). O processo e a regulação positiva da replicação
do vírus podem ser encontrados tanto como up-regulated como downregulated
(Figuras 4C, D). Aa análises das doenças e das biofunções de todas as proteínas
diferencialmente reguladas na infecção pelo ZIKV-BR, mostraram Doença
Neurológica, Transtorno Esquelético e Muscular e Desenvolvimento Embrionário
(FDR <5%) (Figura 4E).
Figura 4 - A infecção de neuroesferas por ZIKV-BR induz a regulação de proteínas
no neurodesenvolvimento e nas vias associadas à microcefalia.
Legenda: (A) O ZIKV-BR promove mudanças na expressão de proteínas em neuroesferas, como
mostrado pelo mapa de calor baseado em agrupamento hierárquico não supervisionado. Foram
encontradas 466 proteínas reguladas positivamente, enquanto 431 proteínas foram encontradas
reguladas negativamente, em neuroesferas infectadas pelo ZIKV-BR, em comparação com a condição
controle (MOCK) (FDR <5%). (B) Processo Biológico de Ontologia de Genes (GO) de alto
enriquecimento para proteínas reguladas positivamente (vermelho) e reguladas negativamente (azul)
em neuroesferas infectadas pelo ZIKV-BR (p <0,01). (C) Distribuição da expressão proteica
relacionada ao vírus em neuroesferas infectadas pelo ZIKV-BR. (D) Padrão de expressão das proteínas
envolvidas na replicação viral. (E) Doenças e funções enriquecidas em neuroesferas infectadas pelo
ZIKV-BR (FDR <5%). (F) Rede protéica envolvida na regulação negativa do fator de crescimento
TGFβ1 e (G) Fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF), (proteínas e processos regulados
positivamente são representados em vermelho e negativamente em azul). (H) Agrupamento hierarquico
de proteínas relacionadas com a microcefalia (FDR <5%), mostrando padrões de expressão distintos
entre MOCK e ZIKV-BR e discretas alterações após exposição a ZIKV-AF. (I, J) O monitoramento da
reação paralela confirmou a regulação negativa da HSPB1 (p <0,001). Os peptídeos
LATQSNEITIPVTFESR e AQLGGPEAAK pertencentes à proteína HSPB1 foram monitorados quanto
à sua abundância nas condições MOCK, ZIKV-AF e ZIKV-BR.
A análise de predição também revelou proteínas que podem apresentar um papel
fundamental na CSZ. O fator de crescimento TGFB1 (Figura 4F), identificado aqui
como regulador inibido, está presente nas zonas proliferativas neocorticais e
neurônios da placa cortical e regula diferentes vias biológicas em muitos tipos de
células, incluindo proliferação e migração celular. No cérebro em desenvolvimento, o
TGFB1 desempenha um papel na migração neuronal durante a laminação cortical e é
responsável pela manutenção da integridade neuronal. Camundongos com expressão
reduzida de TGFB1 apresentam processo neurológico degenerativo marcado por
aumento do número de neurônios apoptóticos e redução da integridade pré-sináptica
neocortical. Além disso, a redução da expressão de laminina, uma proteína
matricelular associada à diferenciação e crescimento neuronal, é uma característica
comum entre camundongos Tgfb1 -/- e neuroesferas infectadas com ZIKV-BR,
contribuindo para um fenótipo neurodegenerativo.
O fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF), uma proteína matricelular
envolvida na condrogênese e cicatrização de feridas, foi previsto como um regulador
a montante inibido (Figura 4G). O CTGF funciona como um mediador a jusante do
TGFB1, sendo capaz de se ligar diretamente ao TGFβ1. Essa interação tem sido
descrita na proliferação de células-tronco mesenquimais e a remoção de CTGF causa
aberrações na formação óssea e defeitos congênitos craniofaciais em camundongos.
Além disso, proteínas previamente relacionadas à microcefalia foram encontradas
reguladas na SN infectada pelo ZIKV-BR (Figura 4H).
Infecção por ZIKV-BR promove regulação negativa de proteínas de choque
térmico em neuroesferas
A HSPB1 foi a proteína menos regulada nas NPCs infectadas (0,32
ZIKV-BR/MOCK), o que foi confirmado pela análise de PRM (Figuras 4I, J). A
regulação negativa de HSPB1 foi previamente observada no estudo de proteínas
envolvidas na diferenciação neuronal. Além disso, o silenciamento da HSPB1
promoveu a diferenciação em neurônios que possuem as características dos neurônios
funcionais glutamatérgicos. A regulação negativa da HSPB1 durante a progressão de
doenças neurodegenerativas resultou em uma diminuição do comprimento neurítico e
complexidade em neurônios adultos e foi associada à morte celular neuronal.
Diferentes flavivírus exploraram HSPs e sua relação com a célula hospedeira. HSP70
e 90 foram descritos como possíveis receptores para a entrada celular do vírus da
encefalite japonesa, e ele é pensado para ser um ‘’acompanhante’’ em fases do ciclo
do vírus da Dengue. Além disso, a resposta de HSPs exerce um papel citoproteto,
regulando o curso da diferenciação de células neuronais, crescimento neurítico e
polaridade axonal. A SN infectada pelo ZIKV-BR apresentou um downregulation
global de HSPs (razão de 0,34 a 0,85 - ZIKV-BR/MOCK), o que poderia reduzir a
proteção celular contra a morte celular programada e promover diferenciação de
precursores neuronais prematuros e com falhas.
Células neuronais derivadas de NPCs são vistas na regulação de proteínas
alteradas, após infecção por ZIKV-BR
Para modelar os efeitos da infecção por ZIKV-BR na neurogênese, as NPCs
foram infectadas com ZIKV-BR (MOI 1) e induzidas a diferenciação neuronal por um
total de 28 dias (Figura 1), após o qual o RNA viral foi detectado por RT-qPCR .
Utilizando nLC-MS/MS, pudemos identificar 7.317 proteínas das quais 5.870 foram
quantificadas com dois ou mais peptídeos. Durante a neurogênese, o número de
células apoptóticas (caspase 3 clivada) foi aumentado em culturas de células
infectadas com ZIKV-BR quando comparado ao MOCK.
A comparação entre células infectadas com ZIKV e MOCK revelou 736 proteínas
reguladas negativamente e 1031 proteínas reguladas positivamente (Figura 5A). De
maneira semelhante à observada em SN, os neurônios infectados pelo ZIKV-BR
mostraram um processo viral enriquecido entre proteínas reguladas positivamente,
enquanto a neurogênese, a diferenciação neural e o desenvolvimento da projeção de
neurônios estavam entre os processos biológicos mais enriquecidos em proteínas
reguladas negativamente (Figura 5B). O comprometimento neurológico e o distúrbio
esquelético e muscular foram as doenças previstas, associadas a todas as proteínas
reguladas, como observado na CZS (Figuras 5C, D).
Figura 5 - Neurônios diferenciados de NPCs, mostram regulação proteica alterada
após a infecção pelo ZIKV-BR.
(A) O ZIKV-BR é capaz de promover maiores respostas de regulação de proteínas em neurônios, como
mostrado pelo mapa de calor baseado em agrupamento hierárquico não supervisionado (FDR <5%). (B)
Processo Biológico de Ontologia de Gene (GO) com alto enriquecimento para proteínas reguladas
positivamente (vermelho) e negativamente (azul) em neurônios infectados pelo ZIKV-BR (p <0,01). (C)
Doença altamente enriquecida e funções para proteínas diferencialmente reguladas em neurônios
infectados pelo ZIKV-BR (p <0,05). (D) Análise de enriquecimento de proteínas envolvidas no
transporte de vesículas sinápticas e endocitose de acordo com a base de dados do IPA. (E) Rede
proteica envolvida na regulação negativa de NFASC e (F) fator de crescimento TCF7L2 (proteínas
reguladas negativamente e processos são representadosem azul).
A neurofascina, uma molécula de adesão celular associada à indução do
crescimento de neuritos, entre diferentes papéis no desenvolvimento neural, é outra
proteína identificada como regulada negativamente em neurônios infectados pelo
ZIKV-BR (0,65 ZIKV-BR/MOCK) (Figura 5E). Outra proteína expressa na
proliferação e diferenciação de células-tronco neurais é o TCF7L2, que foi previsto
como inibidor do regulador de transcrição, em nosso modelo (Figura 5F). Os defeitos
de alongamento dos axônios do tálamo foram observados na ausência do TCF7L2,
associado à downregulation dos receptores de orientação NRP2, ROBO1 e ROBO2,
que foram encontrados regulados negativamente nos neurônios infectados pelo
ZIKV-BR (0,88, 0,70 e 0,77 ZIKV-BR/MOCK, respectivamente) ( Figura 5F). A rede
TCF7L2 e NFASC pode estar associada a células neuronais disfuncionais observadas
em CZS.
Infecção de NPCs com ZIKV-BR leva ao comprometimento sináptico em
neurônios diferenciados
Sinapse/neurotransmissores e axônios foram enriquecidos entre os termos de GO,
indicando diminuição funcional neuronal após a infecção pelo ZIKV-BR, com
downregulation global das proteínas sinápticas (Figura 6A). Além disso, os neurônios
infectados pelo ZIKV-BR apresentavam regulação negativa de proteínas associadas à
montagem de complexos precursores pré-sinápticos e à liberação de
neurotransmissores, como VAMP2 e complexina 2, juntamente com componentes da
zona ativa pré-sináptica, como Piccolo, Fagote e SNDA. Além disso, a proteína de
densidade pós-sináptica, SHANK2, foi encontrada regulada negativamente. Além da
extensa regulação negativa das proteínas sinápticas, a perda sináptica nos neurônios
infectados pelo ZIKV-BR foi confirmada pela quantificação de puncta pré-sináptica
colocalizada (SYN1) e pós-sináptica (Homer1) (Figuras 6B, C). A regulação negativa
de proteínas de adesão celular, Caderina-13 e neurexina, adicionadas as vias
envolvidas na diminuição da densidade de sinapses, observou neurônios infectados
pelo ZIKV-BR. Uma triagem prévia baseada em RNAi projetada para estudar o
mecanismo molecular de desenvolvimento de sinapses mostrou que o knockdown da
caderina-13 reduzem a densidade de sinapses in vitro. De maneira semelhante, a
ruptura da neurexina mostrou reduzir o conteúdo proteico da zona ativa, Bassoon
mais específico e RIM. Em conjunto, esses dados mostram que a infecção pelo
ZIKV-BR é capaz de perturbar a formação sináptica e a estabilidade axodendrítica.
Além da morte celular neuronal, a expressão de proteína aberrante na região sináptica
acompanhada de perda sináptica, poderia contribuir para o retardo mental e para as
incapacidades motoras associadas à CZS.
Figura 6 - A infecção por ZIKV-BR prejudica a transmissão sináptica e o
neurodesenvolvimento.
(A) Rede protéica envolvida em sinapses, neurotransmissores e termos de GO relacionados a axônios
(proteínas reguladas negativamente são exibidas em azul e reguladas positivamente em vermelho). (B)
Imagem representativa de uma puncta co-localizado. (C) Nenhuma diferença no número de proteínas
pré e pós-sinápticas em neurônios infectados pelo ZIKV-BR foi observada. Diminuição de SYN1 e
Homer1 co-localizados em neurônios infectados pelo ZIKV-BR foi observada, com o mesmo número
de células em cultura. Os dados são representados como média ± EPM, a estatística de teste t foi
aplicada. ∗ ∗ valor p ≤ 0,01.
Infecção por ZIKV-BR promove padrão aberrante de progressão da
neurogênese
A neurogênese embrionária é orquestrada por vários eventos de sinalização
celular que influenciam o destino celular da vasta diversidade de células neuronais e
gliais que povoam o cérebro maduro. Marcadores pertencentes a 12 células neuronais
foram avaliados em NPCs e neurônios infectados com ZIKV e MOCK. A análise de
agrupamento revelou a regulação negativa de células de Schwann e neurônios
maduros e a regulação positiva de glia radial e marcadores de neurônios imaturos em
SN infectados pelo ZIKV (Figuras 7A, B). Duplicecortina (DCX), uma proteína de
microtúbulos associada ao processo de migração através do córtex. expresso em
neurônios jovens, foi encontrada regulada positivamente na SN infectada pelo
ZIKV-BR (razão 1,75 ZIKV-BR/MOCK). A supra-regulação de DCX foi confirmada
por análise de PRM de células infectadas com ZIKV-BR, enquanto nenhuma
regulação significativa foi encontrada em SN infectada por ZIKV-AF (Figura 7C). A
análise da expressão de marcadores neurais em neurônios infectados pelo ZIKV-BR
mostrou um padrão único com regulação global negativa da glia radial, neurônios
imaturos e células de Schwann (Figura 7B). Esses dados concordam com dados
anteriores que demonstraram diferenciação prematura em NPCs infectadas por ZIKV,
associada a comprometimento de neurogênese
Figura 7 - Infecção por ZIKV-BR causa padrão aberrante de progressão da
neurogênese.
Legenda: Proteínas estatisticamente reguladas entre NPCs e neurônios infectados com MOCK e
ZIKV-BR foram classificadas de acordo com marcadores celulares neuronais. Os marcadores de
células neurais são: 1. Células neuroepiteliais, 2. Glia radial, 3. Neurônios imaturos, 4.
Oligodendrócitos, 5. Células de Schwann, 6. Astrócitos, 7. Microglia, 8. Neurônios maduros, 9.
Neurônios glutamatérgicos, 10 Neurônios GABAérgicos e 11. Neurónios dopaminérgicos. (A) efeito
do ZIKV-BR em marcadores de células neurais em NPCs. (B) O efeito do ZIKV-BR nos neurônios é
mostrado pelo mapa de calor baseado no agrupamento hierárquico não supervisionado de marcadores
celulares neuronais (FDR <5%). (C) Monitoramento da reação paralela confirmou a regulação positiva
da duplocortina (DCX) nas neuroesferas de NPCs (p <0,001). Os peptídeos TAHSFEQVLTDITEAIK
e SFDALLADLTR pertencentes à proteína DCX foram monitorados quanto à sua abundância nas
condições MOCK, ZIKV-AF e ZIKV-BR.
Conclusão
O recente surto de ZIKV atraiu a atenção dos sistemas de saúde pública devido ao
neurotropismo do vírus, que induz a microcefalia, entre outras malformações
cerebrais em recém-nascidos. Entender os mecanismos moleculares da microcefalia
induzida pelo ZIKV é um passo crucial para identificar potenciais alvos terapêuticos.
Como as vias moleculares por trás da patogenicidade do ZIKV permanecem
desconhecidas, muito esforço tem sido feito para caracterizar as respostas celulares à
infecção viral. Embora alguns estudos tenham abordado as alterações transcricionais
na infecção pelo ZIKV, outros avaliaram a regulação global de proteínas,
desencadeada pela infecção pelo ZIKV em NPCs, revelando alterações de várias vias
envolvidas na progressão do ciclo celular e na morte celular.
No presente estudo, a vulnerabilidade de NPCs humanas e neurônios, resultante
da infecção pelo ZIKV é explorada usando uma abordagem proteômica quantitativa
de larga escala e imparcial. De fato, as NPCs infectadas com ZIKV-AF e ZIKV-BR
mostraram vias moleculares específicas desreguladas, levando à morte celular e à
diferenciação anormal das NPCs. Uma modulaçãoo proteica específica nas NPCs foi
detectada com o ZIKV-BR, induzindo profundas alterações nas neuroesferas das
NPCs, em comparação com o ZIKV-AF. Esses dados destacam a importância da
adaptação viral e correlação com a doença. Além disso, a análise de neurônios
diferenciados, após infecção, foi aplicada com um modelo in vitro de
neurodesenvolvimento embrionário, após a exposição ao ZIKV. Neurônios maduros
infectados mostraram não apenas extensa regulação negativa de proteínas
relacionadas a sinapses, mas também diminuíram a densidade de sinapses. Este estudo
amplia a compreensão das alterações da expressão protéica em NPCs e neurônios
infectados pelo ZIKV, revelando uma adaptação viral específica e comprometimento
funcional dos neurônios sobreviventes.