Estresse salino nas plantas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ 
CENTRO DE CIÊNCIAS 
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR 
LABORATÓRIO EM FISIOLOGIA VEGETAL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Estresse Salino
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FORTALEZA 
2019 
		
SUMÁRIO 
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 3
2 DESENVOLVIMENTO.................................................................................. 4 
2.1 OBJETIVO GERAL....................................................................................... 4
2.2 METODOLOGIA............................................................................................ 4 
2.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS........................................................ 4-6
2.4 RESULTADOS.............................................................................................. 6 -9
3 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES....................................................... 10
REFERÊNCIAS............................................................................................. 11
INTRODUÇÃO 
Peroxidação de Lipídeos e Quantificação de Sódio e Potássio.
Existem três componentes do estresse salino que levam à redução do crescimento e produtividade das culturas: desbalanço nutricional, quando a alta concentração de Na+ no solo reduz a disponibilidade de K + , Ca2+ e Mg 2+ (a baixa disponibilidade é refletida nas concentrações iônicas da planta, que pode ser medida pela fotometria de chama, contribuindo para o estudo do dano causado em diferentes níveis de estresse), ou quando o Na+ desloca o Ca2+ ligado às membranas, alterando a sua integridade estrutural e funcional; toxidez por íons, quando o Na+ em altas concentrações na planta interfere na estrutura e função de algumas enzimas, ou na função do K + como cofator em várias reações; e efeito osmótico restringindo a absorção de água pelas raízes sob baixo potencial hídrico na solução do solo, o que pode ocasionar queda no potencial de turgescência das células, comprometendo o crescimento (Marschner, 1995). Devido esse estresse, que também ocasiona déficit hídrico, ocorre um desbalanço entre a absorção e a utilização da energia luminosa nos cloroplastos. Tal desbalanço pode causar um expressivo aumento na produção de espécies reativas de oxigênio, as quais estão associadas a diversos danos celulares, tais como a oxidação de lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos, o quê, em última instância, pode causar a morte do tecido vegetal (TAIZ; ZEIGER, 2013). A oxidação de lipídeos pode ocasionar danos secundários devido a produção de substâncias que agravam o estado oxidativo da planta, entre elas, o ácido malondialdeído (MDA), por estar sempre presente nesse processo, o mesmo é usado como parâmetro para a estimativa dos danos causados pelo estresse. Isso é possível devido a um teste com base na reação do ácido tiobarbitúrico com o MDA, pois essa reação tem como produto um precipitado de cor amarelada (que absorve a 532nm), permitindo a visualização e quantificação do MDA presente na amostra.
OBJETIVO 
 
Analisar as consequências do estresse salino em plantas de feijão por meio do nível de peroxidação lipídica, estimado pela reação do ácido malondialdeído (MDA) com o ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), essa reação forma um complexo de cor amarelado, que pode ser medido por absorbância; e do desbalanço nutricional por meio da quantificação de Sódio e Potássio com o auxílio da técnica de fotometria de chama. Para isso os testes foram feitos em solo, com plantas irrigadas com água e irrigadas com (água + NaCl) por cinco dias, para simular o estresse salino.
MATERIAIS E MÉTODOS
Para se obter a determinação do conteúdo de Malondialdeído (MDA) em tecidos vegetais foram utilizados os seguintes materiais:
Balança analítica, espátula, Becker, agitador e barra magnética, funil de transferência, almofariz e pistilo, balões volumétricos de 100 e 500mL, pipetas automáticas P500 e P1000, tubos de ensaio e agitador, pisseta com água destilada, banho maria, banho de gelo, centrífuga refrigerada, espectrofotômetro UV/Vis e cubeta.
Para a quantificação de íons sódio e potássio por fotometria de chama foram usados os seguintes materiais:
Balança analítica, espátula, Becker, funil de transferência, almofariz e pistilo, papel filtro, pipetas automáticas P500 e P1000, tubos de ensaio e agitador, pisseta com água deionizada, centrífuga, fotômetro de chama e balão volumétrico.
Procedimento experimental
- MDA
Primeiramente foi preparada a solução de tricloroacético (TCA) a 5%, 5g de ácido tricloroacético foi transferido para um balão volumétrico de 100mL e o volume foi aferido adicionando água destilada, também foi necessário a preparação da solução de ácido tiobarbitúrico (TBA) a 0,5% em TCA a 20%, foi dissolvido 20g de TCA em 60mL de água destilada e o volume aferido para 100mL, posteriormente foi utilizado 60mL dessa solução para dissolver 0,5g de TBA e o volume aferido para 100mL em um balão volumétrico.
Preparação das amostras
Primeiramente foram pesadas cinco repetições (para cada tratamento) de 0,2 g do tecido fresco das folhas de plantas de feijão, cada repetição foi então macerada juntamente com 2,0mL de ácido tricloroacético (TCA) a 5% por 5 min. O macerado foi então transferido para um tubo de ensaio de 2,0mL e centrifugado a 12.000 x g, por 15min, a 4 ºC. Em um outro tubo de ensaio foi adicionado volumes iguais do sobrenadante(extrato) e da solução de TBA-TCA, 1,0mL de cada (para o controle foi adicionado 1mL de TCA a 5% + 1mL de TBA – TCA) , os tubos foram agitados e submetidos a um banho maria por 20min a 95 ºC, tendo decorrido o tempo de reação, os tubos foram transferidos para o banho de gelo a fim de parar a reação. As amostras foram então transferidas para tubos eppendorfs de 2,0mL e levados a centrifuga por 10min, a 3000 x g, após a centrifugação a amostra está pronta para ser lida no espectrofotômetro na faixa de 532 e 600nm.
Vale ressaltar que somente o sobrenadante foi usado para a leitura no equipamento e a leitura a 600nm é usada para estimar o erro de leitura.
- Para a quantificação de íons sódio e potássio
Primeiramente houve o preparo das amostras dos dois tratamentos: Sob estresse salino e controle, para cada repetição e tratamento foi feita a pesagem de 50mg de tecido (tecido seco), tendo então cinco repetições para cada tratamento foi feita a maceração de cada um em almofariz, onde se acrescentou 5mL de água deionizada. Após a maceração o homogeneizado foi transferido para tubos de ensaio devidamente identificados, levou-se então as amostras para o banho maria por 45min – 1h à 75ºC. Passado o tempo do banho maria, as amostras foram levas a centrífuga por 15min a 3000 x g, á temperatura ambiente, o sobrenadante foi então diluído 5X (400uL extrato + 1600uL); 20X (100uL extrato + 1900uL água deionizada) e 40X (50uL extrato + 1950uL água deionizada). 
Calibração do fotômetro de chama 
(é recomendado que seja feita 20 – 30min antes de realizar as leituras). 
Para isso foi feita uma curva padrão de Na+ e K+ contendo 0, 5, 10, 20, 30, 40, e 50 mg/L (ppm) de cada um destes cátions, partindo de uma solução estoque de 1000 mg/L. Para isto, foi pipetado para balões volumétricos de 100mL, respectivamente, 0; 0,5; 1; 2; 3; 4 e 5mL da solução estoque, em seguida, o volume do balão volumétrico foi completado com água deionizada.
O fotômetro de chama foi então calibrado com água deionizada (leitor indicando 0) e com a solução padrão (leitor indicando 100), tendo o equipamento calibrado, foram feitas as diluições das amostras de maneira que a leitura fique dentro da curva padrão entre 20 e 80. Por tentativa foi observado que a diluição ideal foi de 40X para o K+ e de 5X para o Na+
RESULTADOS E DISCUSSÃO 
-MDA
Tendo feito a preparação da amostra seca para a determinação do conteúdode Malondialdeído (MDA), a leitura obtida do espectrofotômetro usada na equação: 
X = [(Abs532 – Abs600) / 155] 
Y = X * fator de diluição da amostra 
Z = (Y * volume de extração) / matéria fresca
Na qual se utiliza a absorbância de 600nm para diminuir o erro da estimativa. Os dados obtidos foram agrupados e plotados em Excel para a construção do (Gráfico 1)
Gráfico 1
Conteúdo de Malondialdeído (MDA) em plantas sob estresse em comparação com o controle.
Como pode ser observado no (Gráfico 1), o conteúdo de MDA em plantas sob estresse (irrigadas com NaCl) é maior do que em plantas irrigadas apenas com água, isso se deve a maior produção de ácido malondialdeído ocasionado pela peroxidação de lipídeos na membrana celular das plantas. Isso implica que está havendo um aumento na concentração de espécies reativas de oxigênio (EROs), que pode afetar no processo fotossintético das plantas. A produção de EROs pode acontecer nos cloroplastos, mitocôndrias e peroxissomas. Os cloroplastos são local de produção de O2, molécula que pode receber elétrons e formar estas espécies, passando pelos fotossistemas (GILL & TUTEJA, 2010). Além dos prejuízos às plantas citados anteriormente, a produção de EROs, , também pode causar a morte celular programada de diferentes formas. A deficiência de K+ , por exemplo, que pode ser causada e agravada em plantas sob salinidade, contribui para ativação de enzimas relacionadas a apoptose e interfere na atividade de enzimas que agem sobre o H2O2 (SHABALA; POTTOSIN, 2014).
- Concentração de íons Sódio e Potássio
Como já foi citado anteriormente, o estresse salino afeta também o equilíbrio osmótico celular por prejudicar o transporte iônico. Então para se estimar os danos causados pelo estresse foi feita a quantificação dos íons Na+ e K+, por meio da fotometria de chama, como pode ser observado nos (Gráficos 2-3).
Gráfico 2
Concentração de K+ em plantas em plantas sob estresse (irrigadas com NaCl) em comparação com o controle (irrigadas apenas com H2O)
Gráfico 3
Concentração de Na+ em plantas em plantas sob estresse (irrigadas com NaCl) em comparação com o controle (irrigadas apenas com H2O)
É retratado na literatura que o estresse salino conduz ao aumento de Na+ com consequente diminuição de K+ na planta, (MAGGIO et al., 2007). Algumas glicófitas, plantas sensíveis à salinidade, acumulam o mínimo de Na+ e Cl- , podendo, também, demonstrar menor sensibilidade ao acumular estes íons em seus tecidos ou compartimentalizar no vacúolo, sem prejuízos na produtividade (GANDONOU et al., 2011). Entretanto, foi observado o aumento dos dois íons, Na+ e K+, diferente do resultado esperado, esse resultado pode ser devido o pequeno período de estresse em que a planta foi submetida, ou a baixa concentração aplicada, visto que foi aplicado 1M de NaCl por 6 dias. Dito isso, é possível estimar que houve uma adaptação do metabolismo referente as concentrações iônicas, reestabelecendo o equilíbrio frente o aumento da concentração de (Na) no solo. 
CONCLUSÃO 
- Determinação do conteúdo de Malondialdeído (MDA) e Quantificação de íons sódio e potássio em plantas irrigadas com NaCl e controle (irrigadas somente com H2O)
Com base nos resultados obtidos, pode se inferir que o estresse salino, pode ser melhor estimado logo no início do estresse pelo método de determinação de MDA, visto que, mesmo com poucos dias de estresse e sob baixa concentração salina no solo, foi obtido o resultado esperado quando se compara os dois tratamentos (plantas sob estresse têm maior concentração de ácido malondialdeído), caracterizando a peroxidação lipídica das plantas sob estresse. Já a medida da concentração dos íons sódio e potássio não refletiu o resultado esperado, apenas foi observado um aumento da concentração de ambos os íons, implicando que houve uma adaptação do metabolismo da planta, a fim de manter o equilíbrio osmótico e prevenir o déficit hídrico.
REFERÊNCIAS
FU, J.; HUANG, B. Involvement of antioxidants and lipid peroxidation in the adaptation of two cool-season grasses to localized drought stress. Environment and Experimental Botany, v. 45, p. 105-112, 2001.
MELONI, D. A. Composição mineral, relações hídricas, atividade fotossintética e crescimento em dois cultivares de algodoeiro submetidos a estresse salino. Viçosa: UFV, 1999. 48 p. (Tese de Mestrado).
MARSCHNER, H. Mineral nutrition of higher plants. 2 ed., California: Academic Press, California, 1995. 889 p.
DIONISIO-SESE, M. L.; TOBITA, S. Antioxidant responses of rice seedlings to salinity stress. Plant Science, v. 135, p. 1-9, 1998.
MELONI, D. A. Composição mineral, relações hídricas, atividade fotossintética e crescimento em dois cultivares de algodoeiro submetidos a estresse salino. Viçosa: UFV, 1999. 48 p. (Tese de Mestrado)
EYIDOGAN, F.; OZ, M.T. Effect of salinity on antioxidant responses of chickpea seedlings. Acta Physiology Plant, v.29, 48-493, 2007.