pratica 1 - hill e succinato desidrogenase

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
	
REAÇÃO DA SUCCINATO DESIDROGENASE
REAÇÃO DE HILL
Maringá
2019
REAÇÃO DA SUCCINATO DESIDROGENASE
REAÇÃO DE HILL
	
Maringá
2019
1. INTRODUÇÃO
1.1 Succinato desidrogenase
A enzima Succinato desidrogenase participa do ciclo do ácido cítrico catalisando a oxidação do Succinato formando fumarato. Além disso, nos eucariotos, a enzima está firmemente ligada a membrana interna da mitocôndria e participa do Complexo II da cadeia transportadora de elétrons, sendo a segunda porta de entrada dos mesmos como mostra a imagem a seguir:
Figura 1: Cadeia transportadora de elétrons na membrana interna da mitocôndria.
(Nelson, Cox, Lehninger, 2014).
Os elétrons são transferidos do succinato para o FAD que se reduz a FADH2, e então são transportados para a ubiquinona passando pelos centros ferro-enxofre para seguirem para o Complexo III e realizar a fosforilação oxidativa por completo. Portanto, é muito importante para o funcionamento celular que ela esteja funcionando perfeitamente.
O Complexo II é constituído de 4 subunidades proteicas (uma delas é um grupo Heme b) e 5 grupos protéticos (FAD e centros ferro-enxofre). O grupo Heme b é responsável por reduzir o vazamento de elétrons da cadeia que podem gerar espécies reativas de oxigênio ROS e causar sérios danos a célula.
Quando dois elétrons passam pela cadeia respiratória e mais dois prótons, vindo da oxidação succinato, se unem com o oxigênio no Complexo IV e forma água.
Conforme os elétrons vão passando pela cadeia transportadora, prótons vão sendo exportados da matriz para o espaço intermembrana formando o gradiente de prótons e a força próton-motriz que estimula o retorno dos prótons para a matriz por meio do poro da ATPsintase presente na membrana interna. Sendo que a cada 3 prótons que passam para a matriz pela parte Fo, induz a rotação de 120º na parte F1 que é onde ficam os sítios de síntese de ATP, liberando uma molécula de ATP (Nelson, Cox, Lehninger, 2014).
Porém, a ação da succinato desidrogenase pode ser inibida, pelo malonato por exemplo, e o resultado dessa ação é a interrupção do transporte de elétrons e assim das vias metabólicas que dependem da reoxidação das coenzimas. O malonato é um inibidor competitivo dessa enzima pois tem sua estrutura muito semelhante ao succinato. Assim, a adição dele nas mitocôndrias inibe a atividade do ciclo do ácido cítrico, impedindo portanto a redução do FAD à FADH2 e consequentemente o inibe o transporte de elétrons até a ubiquinona.
1.2 Fotólise da água – Reação de Hill
Fotólise é o processo de degradação de moléculas orgânicas pela radiação luminosa e um bom exemplo desse processo é a fotossíntese.
A transferência de elétrons promovida pela luz durante a fotossíntese na fase clara é realizada por sistemas multienzimas na membrana tilacoide dos cloroplastos (Nelson, Cox, Lehninger, 2014).
A fotólise da água se inicia pela excitação dos elétrons da água presente no lúmem de tilacóide nos cloroplastos por meio da luz, estes são então transferidos pela cadeia transportadora até um aceptor de elétrons NADPH que ao se unir aos íons H+ e oxigênio livres, que foram liberados pela quebra da molécula de água, formam NADPH2 e ATP.
Quando os elétrons retornam para a molécula de clorofila liberam energia pois retornam à níveis de energia mais baixos, e essa energia que é utilizada para sintetizar o ATP por exemplo, que será útil na fase escura da fotossíntese.
Durante a fase escura da fotossíntese, as reações não dependem da luz para ocorrerem pois utilizam NADPH e o ATP produzidos na fase clara como fonte de energia para realizar a síntese de carboidratos como a glicose.
Esse transporte de elétrons é acoplado também a geração de uma força próton-motriz por meio da membrana do tilacoide, são esses prótons que são captados por NADP e forma-se o NADPH2, o oxigênio é liberado para o meio e os elétrons retornam para a clorofila.
A reação da fotólise da água foi descoberta por Robert Hill em 1937, por isso o aceptor NADPH e a reação ficaram conhecidos como reagente e reação de Hill, respectivamente. A reação pode ser escrita da seguinte forma:
	 2H2O  ------> O2 + 4H+ + 4e-
Robert Hill demonstrou utilizando cloroplastos de espinafre que os mesmos tinham a capacidade de reduzir compostos por meio da fotólise e produzir oxigênio. Isso foi possível adicionando nos cloroplastos solução de ferricianeto de potássio e luz, e verificou a produção de oxigênio e a redução do ferricianeto. Então, essa reação ficou conhecida como reação de Hill (figura 2), onde o ferricianeto foi o receptor de elétrons e assim foi chamado de reagente de Hill. 
Figura 2: Reação de Hill original.
O processo todo da fotossíntese na fase clara, de forma resumida, ocorre como mostra a imagem:
Figura 3: Fase clara da fotossíntese. Ocorrendo a fotólise da água acoplada a produção do aceptor NADPH, H+ e ATP.
Porém, hoje sabe-se que há muitos compostos que podem atuar como receptores de Hill, sendo aceptores artificiais. Um deles é o 2,6-diclorofenolindofenol que na sua forma oxidada tem coloração azul, mas quando é oxidado a solução fica incolor. 
Esse, entre muitos outros aceptores que mudam de cor ao sofrerem reações de óxido-redução são utilizados para experimentos que visam verificar a atividade metabólica de uma organela por exemplo.
2. OBJETIVOS
2.1 Reação da Succinato desidrogenase
O objetivo principal dessa prática foi analisar a atividade da succinato desidrogenase através da reação de redução de um aceptor de elétrons artificial, substituindo o ferricianeto utilizado por Hill. O 2,3,5-trifeniltetrazólio foi utilizado como aceptor, este em solução aquosa tem coloração amarela, que ao ser reduzido à diformazan torna a solução vermelha, provando a atividade catalítica da enzima em questão.
2.2 Reação de Hill
O objetivo desse experimento foi avaliar a atividade metabólica do cloroplasto na fotólise da água. Da mesma forma que a reação da succinato, é necessário um aceptor de elétrons como indicador da reação de óxido-redução. Foi utilizado o 2,6-diclorofenolindofenol como aceptor que em solução aquosa na sua forma oxidada tem coloração azul, e quando reduzido fica incolor, assim permitindo visualizar se a reação fotoquímica teve ação dos cloroplastos.
	
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Reagente e materiais
3.1.1. Para a reação da Succinato-desidrogenase foi utilizado:
Fígado de galinha 
Meio de extração das mitocôndrias: sacarose 0,32 M em tampão fosfato 0,02 M com pH 7,3 e 0,01 M de EDTA.
Suspensão de mitocôndrias
Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio 0,5%
Succinato de sódio 1% (neutralizar com NaOH)
Malonato de sódio 1% (neutralizar com NaOH)
Tampão fosfato 0,02 M pH 7,3
3.1.2.Para a reação de Hill:
Sacarose 0,35M
Tampão fosfato 0,05M pH 6,5 com 0,35M de sacarose.
2,6-diclorofenolindofenol 16mg/100mL
Cristais de ácido ascórbico
Ditionito de sódio
3.2 Procedimento experimental
3.2.1 Reação da Succinato-desidrogenase
Para fazer a reação foi feita extração de mitocôndrias de fígado de galinha. Então foi pesado 15 gramas de fígado, este foi cortado em pequenos pedaços e macerado com auxílio de gral e pistilo e 5 ml do meio de extração gelado, que ao total continha 30 mL. Após homogeneização completa do tecido, foi acrescentado o restante do meio de extração. 
A mistura foi então filtrada com gaze, e dividiu-se o filtrado de 30 ml em dois tubos de centrífuga, cada um com 15 ml aproximadamente. O filtrado então foi centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos.
Após a centrifugação, retirou-se com cuidado o anel de gordura da parte superior dos tubos com o auxílio de uma pipeta de Pasteur, o sobrenadante foi descartado em um recipiente para posterior descarte adequado das amostras biológicas.
As mitocôndrias contidas na camada superior ao precipitadoforam cuidadosamente retiradas, colocadas em um novo tubo de ensaio e ressuspensas em 3 mL do meio de extração. Foi retirado da suspensão mitocondrial 0,5 mL e colocado em outro tubo de ensaio e ressuspendeu-se em 1 mL de meio de extração, em seguida o tubo foi colocado no banho com a água fervendo, para que a enzima desnaturasse, por 3 minutos.
Para determinar a atividade da enzima e a sua inibição pelo malonato, foram separados e enumerados 7 tubos, cada um com a seguinte constituição:
	Tubos
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	Tampão fosfato 0,02 M pH 7,3
	0,50
	0,50
	0,50
	0,50
	0,50
	0,50
	0,50
	Tetrazólio 0,5%
	0,25
	0,25
	0,25
	0,25
	0,25
	0,25
	-
	Malonato 1%
	-
	0,50
	-
	-
	-
	0,50
	-
	Mitocôndria fervida por 3’
	-
	-
	0,50
	-
	-
	-
	-
	Suspensão mitocondrial
	-
	0,50
	-
	0,50
	0,50
	0,50
	0,50
	Succinato 1%
	0,50
	0,50
	0,50
	-
	0,50
	-
	0,50
Cada tubo, antes de colocar o substrato (succinato), foi incubado por 3 minutos. Após essa incubação, adicionou-se o succinato nos respectivos tubos e todos os tubos foram incubados em banho-maria ao mesmo tempo a 37ºC e durante o intervalo de 5 a 20 minutos os tubos foram observados para verificar alterações de cor.
Após 10 minutos de incubação a 37 ºC do tubo 2, adicionou-se a ele 2 mL de succinato 10%.
3.2.2 Reação de Hill
	Pesou-se 10g de folhas de espinafre que foram picadas e trituradas em um graal com o auxílio do pistilo com 3 mL de 10 mL da solução de sacarose 0,35 M e depois de homogeneizado, foi adicionado o restante de sacarose aos poucos.
A mistura foi filtrada com gaze e em seguida o filtrado foi centrifugado por 2 minutos a 1000 rpm. O sobrenadante foi colocado em outro tubo de centrífuga, o precipitado foi descartado, e o sobrenadante foi centrifugado novamente por 7 minutos a 3000 rpm.
O sobrenadante foi cuidadosamente retirado, e o restante (cloroplastos) foi ressuspensos em 10 mL de tampão fosfato com sacarose. 
Em seguida, para realizar as reações, 4 tubos foram separados e enumerados, cada um com a respectiva constituição:
	Tubos
	Suspensão de Cloroplastos
	Tampão fosfato (mL)
	2,6DCF (mL)
	Observações
	1
	1,5
	3,0
	0,5
	Expor a luz
	2
	1,5
	3,0
	0,5
	Colocar no escuro
	3
	1,5 + Ác. ascórbico
	3,0
	0,5
	Bancada
	4
	1,5 + Ditionito
	3,0
	0,5
	Bancada
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Reação da Succinato desidrogenase
Esperava-se como único resultado positivo nesse experimento, o tubo 5, pois era o único que tinha o necessário (tampão, aceptor de elétrons, mitocôndria e substrato) para ocorrer a reação corretamente e sem nenhum inibidor, portanto o objetivo era que todos os outros ficassem na sua cor inicial e que o tubo 5 ficasse na cor vermelha. E foi isso que aconteceu na prática, com exceção de alguns tubos.
No tubo 1 não aconteceu a reação pois não foi colocado mitocôndria, no tubo 2 também não aconteceu até o momento que foi esperado, pois foi adicionado o malonato, que é o inibidor competitivo da enzima, ou seja, no lugar do substrato/succinato, no sitio ativo da enzima entrou o malonato, impedindo a reação de ocorrer. Porém, se aguardasse mais um tempo talvez isso seria revertido.
No tubo 3 também não ocorreu a reação pois ao invés de utilizarmos a suspensão mitocondrial, foi adicionado a mitocôndria fervida, portanto as interações intermoleculares da enzima já havia sido desnaturada e perdido sua função. No tubo 4, não havia substrato para que a enzima catalisasse sua transformação em fumarato.
No tubo 6 não havia nem substrato e também foi adicionado o inibidor da enzima, então não obteve-se a catálise da enzima. No tubo 7 ocorreu a reação, já que tem substrato, mitocôndria e tampão. Porém não havia tetrazólio no tubo de ensaio então não há alteração na cor.
Alguns tubos não apresentaram o resultado esperado como pode ser visto na figura 4, pois tubos que deveriam ficar incolor e negativo (2, 4, 6 e 7) ficaram vermelhos, isso provavelmente ocorreu por erros na centrifugação. Já que no momento de centrifugar não obteve-se o anel da mitocôndria bem demarcado, então é possível que isso ocorreu pois no momento de pegar somente a mitocôndria acabou indo junto algumas outras organelas e resto de célula. 
Figura 4: Resultados da reação da Succinato desidrogenase em fígado.
4.2 Reação de Hill
Nessa prática era esperado que no tubo 1 ocorresse a redução do 2,6 diclorofenolindofenol já que continha os cloroplastos, tampão, o aceptor de elétrons e ficou exposto a luz, portanto esperava-se que sua cor esverdeada inicial fosse clareando até ficar incolor. Isso ocorreu, não chegou a ficar incolor como mostra a figura 5, mas ficou mais claro do que estava inicialmente.
No tubo 2, não esperava que ocorresse a redução do diclorofenolindofenol já que este tubo ficou no escuro, e foi exatamente o que aconteceu. Portanto não houve quebra das moléculas de água e liberação dos seus elétrons.
Os tubos 3 e 4 foram colocados como controles positivos, pois foi adicionado ácido ascórbico e ditionito de sódio, e já que ambos têm a capacidade de reduzir o 2,6-diclorofenolindofenol e foram deixados na bancada era esperado que eles ficassem mais claros do que o verde inicial.
Como pode ser visualizado na figura 5, os resultados teóricos ocorreram na prática também.
Figura 5: Resultados da reação de Hill. Sendo na ordem dos tubos: 1, 2, 3, 4.
	
5. CONCLUSÃO
 Com essas práticas foi possível visualizar somente pela alteração das cores, a ação de enzima e de organelas na redução de compostos que comprovaram o que já foi visto na teoria. 
A reação da enzima succinato desidrogenase não ocorreu como esperado, provavelmente por erros na centrifugação pois após a etapa de centrifugar a suspensão mitocondrial a única fase realmente visível e separada foi a da gordura que foi facilmente retirada. Talvez se deixasse na centrifuga por mais um tempo haveria a separação adequada e o resultado seria melhor.
A reação da fotólise da água ocorreu como desejado, mas também se tivesse mais tempo provavelmente os resultados positivos poderiam ser mais visíveis, já que ficaria mais incolor do que apresenta na figura 5.
	
6. REFERÊNCIAS
Nelson, David L.; COX, Michael M. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2011. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014.